방법 논문

의 재배 예쁜 꼬마 선충 실험실에서 세 가지 차원에서

DOI:

10.3791/55048

⸱

2016년 12월 12일

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

이 논문에서

요약

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우리는 NGT-3D 및 NGB-3D라는 3D 선충 재배 시스템을 구축하는 간단한 방법을 제시한다. 이러한 표준 2D 실험실 C. elegans의 배양 플레이트보다 자연 예쁜 꼬마 선충 서식지에 더 유사 서식지에서 선충의 체력과 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

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Caenorhabditis elegans와 같은 유전자 모델 유기체의 사용은 지난 50년 동안 생물학에서 중요한 발견으로 이어졌습니다. 예쁜꼬마선충에 대해 우리가 알고 있는 대부분의 정보는 선충의 실험실 배양에 국한되어 있으며, 이는 선충이 자연에서 일반적으로 서식하는 환경을 반드시 반영하지 않을 수도 있습니다. 벌레가 썩은 과일과 자연의 식물 퇴비에서 만나는 3D 매트릭스와 더 유사한 3D 서식지에서 예쁜꼬마선충을 재배하면 2D에서 관찰되지 않는 새로운 표현형과 행동을 밝힐 수 있습니다. 또한 3D 실험은 2D에서 관찰되는 표현형이 자연의 벌레와 어떤 관련이 있는지 설명할 수 있습니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans)이 3차원으로 정상적으로 성장하고 번식하는 새로운 방법을 제시합니다. Nematode Growth Tube-3D(NGT-3D)에서 예쁜꼬마선충을 배양하면 3D 환경에서 예쁜꼬마선충 균주 또는 다양한 조건의 생식 적합성을 측정할 수 있습니다. 또한 현미경 분석을 위해 예쁜꼬마선충을 3D로 배양하기 위해 Nematode Growth Bottle-3D(NGB-3D)라는 새로운 방법을 제시합니다. 이러한 방법을 통해 과학자들은 자연에서 만나는 환경을 더 잘 반영하는 조건에서 예쁜꼬마선충의 생물학을 연구할 수 있습니다. 이것들은 우리가 실험실에서 관찰하는 예쁜꼬마선충의 생리학과 행동의 근본적인 진화적 관련성을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서론

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실험실에서의 선충 Caenorhabditis elegans에 대한 연구는 지난 50년 동안 생물학 분야에서 중요한 발견으로 이어졌습니다1. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 1998년에 게놈 염기서열 분석을 한 최초의 다세포 유기체였으며, 전체 유기체의 발달, 생리학 및 행동에 대한 개별 유전자의 기여를 이해하는 데 매우 중요했습니다. 과학자들은 이제 이러한 유전자가 자연 환경에서 유기체의 생존과 생식 적합성에 어떻게 기여할 수 있는지 더 깊이 이해하기 위해 유전자 수준3-5에서 생태학과 진화에 대해 질문하고 있습니다.

C. elegans는 다시 한 번 이러한 질문에 답할 수 있는 훌륭한 시스템을 제공할 수 있습니다. 그러나 자연 선충 서식지에서 예쁜꼬마선충의 생물학에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 현재 실험실에서 예쁜꼬마선충의 통제된 자연 조건을 시뮬레이션할 수 있는 방법은 없습니다. 실험실에서 C. elegans는 E. coli 박테리아6이 뿌려진 한천 판의 표면에서 배양됩니다. 그러나 자연에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans) 및 관련 선충(comatodes)이 전 세계의 토양에 드물게 서식하는 것을 볼 수 있지만, 특히 썩어가는 과일과 식물 물질에서 번성하는 것으로 발견된다7,8. 이러한 3차원(3D)의 복잡한 환경은 실험실에서 벌레가 노출되는 단순한 2D 환경과는 상당히 다릅니다.

보다 자연스러운 3D 환경에서 선충의 생물학에 대한 질문에 답하기 위해 우리는 선충 성장 튜브 3D또는 줄여서 NGT-3D 9라고 부르는 선충의 실험실 배양을 위한 3D 서식지를 설계했습니다. 목표는 표준 2D 선충 성장 배지(NGM) 플레이트10과 유사한 성장, 발달 및 비옥도를 허용하는 3D 성장 시스템을 설계하는 것이었습니다. 이 시스템은 전체 수명 주기에 걸쳐 박테리아와 선충의 성장을 3D로 지원하고, 벌레가 3차원에서 자유롭게 움직이고 행동할 수 있도록 하며, 제조 및 사용이 쉽고 저렴합니다.

본 연구에서는 NGT-3D를 제조하고 기생충의 발달 및 생식력을 평가하는 단계별 방법을 제공합니다. 3D로 지렁이의 적합성을 평가하는 것 외에도 3D 배양에서 지렁이의 행동과 생리학을 이미지화, 비디오 및 평가하고자 했습니다. 따라서 NGT-3D 외에도 3D 배양 중 예쁜꼬마선충의 현미경 이미징을 위해 Nematode Growth Bottle 3D 또는 NGB-3D라는 대체 방법을 제시합니다. 이는 2D에서 확인된 알려진 행동에 대한 연구와 3D 재배 고유의 새로운 행동을 식별하는 데 특히 중요합니다.

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프로토콜

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1. NGT-3D 및 NGB-3D를위한 솔루션을 준비

  1. 다음 멸균 솔루션을 준비 : 0.1454 M NaCl 용액 1 L, 1 M CaCl2를, 1 M 황산 1 L 1 L, 원성 국물 (LB), KH 2의 1 M KPO 4 버퍼 (108.3 g 1 L PO 4 및 K 2 35.6 g HPO 4, H 2 O 기입 L 1). 이러한 솔루션을 사용 NGM의 제조 이전 프로토콜 (10)에서 찾을 수있다.
  2. 121 ° C, 15 분에서 오토 클레이브 솔루션을 제공합니다.
  3. 멸균 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 50 ㎖를 준비합니다. 한 50㎖ 원추형 튜브에 콜레스테롤의 0.25 g 및 99.99 % 에탄올 50ml를 혼합하고 잘 혼합한다. 오토 클레이브하지 마십시오. 0.45 μm의 주사기 필터로 50 mL를 주사기를 사용하여 콜레스테롤을 살균 용액. 이것은 또한 어떤 용해되지 않은 콜레스테롤을 제거합니다.
  4. 2'- 데 옥시 -5- fluorouridine (FUdR) 주식의 150 mM의 10 ㎖를 준비합니다 (선택 사항). 15 ml의 원추형 튜브에, 0.3693 g을 혼합FUdR 증류수 10 ㎖의. 잘 흔들어.

2. NGT-3D 및 NGB-3D에 대한 박테리아 문화를 준비합니다

  1. 박테리아 10 ml의 LB 배지에 접종. 공급 C. elegans의 사용되는 표준 박테리아는 대장균 OP50이다.
  2. 문화 밤새 진탕 배양기에서 37 ° C에서 세균 접종.
  3. 일련의 희석에 대비, 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 NaCl 용액의 나누어지는 9 ml의. 예를 들어, 7 개의 튜브에 분취 9 ml의 OP50 균주 E. 콜라이의 10-7 희석을한다.
  4. NaCl 용액의 9 ml의 멸균 새로운 튜브에 멸균 1,000 μL 피펫, 피펫 세균 배양 1 ml의 희석 세균 배양를 사용하여 잘 10 ml의 혼합물을 소용돌이. 원하는 박테리아 희석에 도달 할 때까지 반복합니다.
    주 : 원하는 박테리아 희석 종류 및 조건 세균뿐만 아니라 정확한 실험 조건에 의존한다.예를 들어, 10-6 - 6.5 ml의 NGT-3D 튜브 당 200 세균성 식민지 - OP50 변형 대장균의 10-8 희석는 1 생산하기에 충분했다. 웜 확실 개발 콜로니 수 × 10-6의 희석에서 발생하는 60 때 정상적으로 재생 - 10-7. NGB-3D를 들어, 10-8의 희석을 사용합니다.

3. 만들기 NGT-3D 및 NGB-3D (200 ㎖)

  1. 박테리아 배양을 제조 한 후, 0.6 g의 NaCl 1 g의 과립 한천, 및 500 mL의 플라스크에서, 0.5 g 펩톤 섞는다. 플라스크에 자기 교반 막대를 삽입합니다.
  2. 195 ml의에게 증류수를 추가하고 알루미늄 호일로 플라스크의 입 커버.
  3. 15 분 동안 오토 클레이브에서 121 ° C.
  4. 저어 접시에 뜨거운 멸균 플라스크를 놓고, 적어도 2 시간 동안 적당한 속도로 교반한다. 40 ° C까지 플라스크를 냉각. 완성 된 한천의 흐리게 될 수 있습니다 여기에 고온에서 지속적으로 충분히 냉각해야합니다.그러나, 낮은 온도는 한천의 조기 경화의 원인이 될 수 있습니다.
    1. (선택 사항), 냉각 프로세스의 속도를 저어 접시에 배치하기 전에 40 ° C의 물 목욕 15 분에 플라스크를 배치합니다.
  5. 한천 매체의 온도가 40 ℃에 도달하면, 용액은 교반 계속되고, 200 ㎕의 1 M CaCl2를 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 200 ㎕를 200 ㎕의 1 M 황산 5 mL의 1 M KPO 4 버퍼를 추가 1 mM의 염화칼슘 2, 5 μg의 / ㎖ 콜레스테롤, 1 mM의 황산, 1 mM의 KPO 4의 최종 농도.
    1. NGT-3D 수명 분석을 위해 (선택 사항) 120 μM (12)의 최종 농도 150 mM의 FUdR의 80 μl를 추가합니다.
  6. 직접 플라스크에 단계 2.4에서 박테리아 문화를 희석하여 10 ml의 6 ML을 추가합니다.
    1. , NGT-3D (선택 사항) 단계 3.6 전에 한천 미디어의 6 mL로 분리하여 따로 따뜻한 유지. 이 매체는 사용할 수없는 것이다 세균최상층.
  7. 무균 절차를 이용하여, 무균 배양 챔버에 미디어 분배. 확인 챔버의 커버가 단단히 종료합니다.
    1. (선택 사항), 한천의 표면에 형성되는 세균성 식민지를 방지 3.7 완전히 경화 단계에서 용지 전에 상단에 단계 3.6.1에서 박테리아가없는 한천 미디어의 층을 확인하십시오. 이 NGT-3D의 상단에 박테리아가없는 영역을 생성합니다.
    2. NGT-3D를 들어, 박테리아 한천 층을 조심스럽게 얇은 세균 -을 만들기 위해 반경 화 3D 미디어의 상단에있는 박테리아가없는 미디어 200 μl를 분배하는 8 ml의 투명한 플라스틱 시험관에 6.5 ml의 미디어를 부어 상단에 자유 층.
    3. NGB-3D를 들어, 25cm 2 투명한 플라스틱 세포 배양 병에 미디어 65 ml에 붓는다. 이 금액은 25cm 2 세포 배양 병의 본문을 작성해야합니다.
  8. 박테리아 콜로니가 성장하도록 일주일 수직 상온 챔버 남기기적어도 1mm 직경의 상당한 크기.
    1. NGT-3D의 수명 분석을 위해 (선택 사항), 알루미늄 호일 커버 챔버 FUdR의 빛 저하를 방지 할 수있다.

NGT-3D (상대 브루드 크기 분석)에 대한 웜 인구의 4 측정 휘트니스

  1. 선택과 세균이없는 NGM 접시에 전송 백금 와이어를 사용하여 L4 무대 웜을 선택합니다. 웜은 자유롭게 몸에 부착 된 세균을 제거하는 몇 분 동안 이동할 수 있습니다.
  2. 단계 4.1를 반복하고 웜이 박테리아에서 무료로 있는지 확인하십시오. 일반적으로, 4.1이 반복 충분하다.
  3. 조심 백금선 픽업과 3D 매체의 표면에 깨끗한 웜 놓는다. 이 웜은 결국 3D 한천 행렬에 한천을 입력해야합니다.
  4. 커버 느슨하게 일부 공기가 튜브로 얻을 수 있지만, 한천 매체 건조 방지습니다.
  5. 20 ° C에서 96 시간 동안 품어.
  6. 사일 후 단단히 뚜껑을 닫고 두는88 ° C의 물을 욕조에 NGT-3D 문화 챔버는 한천을 녹여합니다. 열은 벌레를 죽이는 그러나 그들의 몸은 그대로 유지됩니다.
    참고 : NGT-3D에 8 ㎖의 튜브 사용은 20 - 30 분 배양은 일반적으로 충분합니다.
  7. 유리 피펫을 사용하여 9cm 플라스틱 페트리 접시에 용융 미디어 옮긴다. 벌레가 자주에 충실 수있는 플라스틱 피펫은 권장되지 않습니다.
  8. 송신 스테레오 해부 현미경을 사용하여, L3, L4에 웜 및 성체 단계의 개수를 카운트. F1을하고 F2 세대가 여기에 혼동 될 수 있으므로, L2 단계 이하이다 벌레를 계산하지 마십시오. 따라서, 이러한 분석은 상대 브루 크기 분석보다는 전체 브루 크기 분석이다.

5. 이미지 및 기록 웜 동작 NGB-3D에

  1. 백금 와이어를 사용하여 L4 무대 웜 선택 선택하고 박테리아가없는 NGM 판에 전송하고 자유롭게 몇 분 동안 이동할 수 있도록하여 표면에 붙어있는 박테리아를 제거합니다.
  2. 단계를 반복 5.1 하시다 확인하십시오RM은 박테리아에서 무료입니다.
  3. 조심스럽게 백금 와이어 픽와 병의 목 근처 NGB-3D의 한천 표면의 중심에 클린 웜을 배치합니다. 이 웜은 결국 3D 한천 행렬에 한천을 입력해야합니다.
  4. 한천 미디어의 건조를 방지하면서 덮개가 느슨하게, 약간의 공기가 튜브에 들어갈 수 있도록 닫습니다.
  5. 이미지 또는 전송 스테레오 해부 현미경 벌레를 기록합니다. 웜은 3D 매트릭스를 통해 이동으로 초점을 조절합니다.

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결과

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NGT도 3d의 구조는 한천 (도 1a)에 걸쳐 이격 된 작은 박테리아 콜로니 한천 채워진 시험관 결과 단순하고 간단한 프로토콜이다. 웜 자유롭게 세균성 식민지를 발견하고 소비, 한천 매트릭스를 통해 이동할 수 있습니다. C. elegans의 재현과 NGT-3D 정상적으로 성장할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 다산과 표준 2D NGM 플레이트와 3D의 애벌레 개발을 비교 하였다. 상대 무리 크기 분석에서, 성인 C. 세균 식민지가 적어도 60 식민지 (그림 1B)와 풍부한 경우 NGT-3D로 자웅 동체 표준 2D NGM 판에있는 자웅 동체로 단지뿐만 아니라 재생 엘레 간스. 또한, NGT-3D의 애벌레 개발도 96시간 (그림 1C) 후 성인 상태에서 웜의 대부분과 세균성 식민지의 많음이있을 때 일반적으로 진행된다. 그러나...

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토론

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고전 선충류 성장 미디어 판을 사용하여 선충의 실험 재배가 제공 한 C. elegans의에서 연구 중요한 발견의 수백에 매우 중요했다. 여기, 우리는 더 정확하게 자연 입체 서식지를 반영하는 환경에서 C. 엘레을 육성하기 위해 새로운 방법을 제시한다. 다른 방법 3D 13 C. 엘레을 관찰하기 위해 사용되었지만, 이는 고체 차원 매트릭스 웜의 재배를 허용하는 제 1 프로토콜이다. 여기에 표시된 두 가지 방법, NGT-3D 및 NGB-3D는 과학자 이미지도 3D 재배 피트니스, 발전과 성장의 문제 등을 요청하고 3D로 벌레를 기록 할 수 있습니다. NGT-3D 및 NGB-3D 표준 2D NGM 플레이트에 약간의 차이가 있지만, 그들은이 원래의 방법과 유사한 만 z 축에 웜 재배를 추가하도록 조정한다. 따라서, 우리는 개발, 불임 및 수명이 우리의 조건에서 정상적으로 진행 것을 찾을 수 있습니다. 그만큼목표는 실험실 연구를 위해 사용 할 수있는 프...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은에 의해 지원되었다 새 탐정 그랜트 [2014R1A1A1005553] JIL에 한국 연구 재단 (NRF)에서; 와 연세대 학교 미래 리더 챌린지 그랜트 [2015-22-0133] JIL에

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
LB 국물, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
염화나트륨DAEJUNG7548-440058.44 MW
한천, 과립Difco214530
펩톤Bacto211677
염화칼슘, 이수화물바이오 베이직CD00502 * H 2 < / sub>O; 147.02 MW
콜레스테롤바이오 베이직CD0122386.67 MW
에틸 알코올B & JRP090-199.99%; 46.07 MW
마그네슘 설페이트, 무수바이오 베이직MN1988120.37 MW
인산칼륨, 모노베이직, 무수바이오 베이직PB0445136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine도쿄 화학 산업D2235246.19 MW
인산칼륨, 이염기성, 무수바이오 베이직PB0447174.18 MW
다목적 시험관Stockwell ScientificST.85708 ml
시험관 마개Stockwell ScientificST.8575
세포 배양 플라스크SPL Lifescience7012525 cm2
Research 스테레오 현미경NikonSMZ18
고화질 컬러 카메라 헤드NikonDS-Fi2
PC 기반 제어 장치NikonDS-U3
NIS 요소 기본 연구, 현미경 이미징 소프트웨어NikonMQS32000

참고문헌

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