연속 크라이 섹션은 단일 마우스 골격근에서 인접 영역을 이용한 유전자 발현 측정 학적 어플리케이션 및 RNA의 농축을 가능하게 수집된다. 직접 애플리케이션에서 비교 풀링 저온부 및 측정 30mg을 - 고품질 RNA를 (20)로부터 얻어진다.
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이 논문에서
요약
초록
이 방법으로, 연속 저온부는 하나의 마우스 골격 근육에서 인접 영역을 사용하여 유전자 발현을위한 조직 조직학 및 RNA의 농축 모두 현미경 응용 프로그램을 사용하기 위해 수집됩니다. 전형적으로, 그것은, 버퍼 볼륨이 효율적으로 연마 애플리케이션 너무 낮을 수 있기 때문에 아직 충분한 기계적 중단없이 작은 골격근 샘플의 적절한 균질화를 달성하는 도전 버퍼 시약 근육 제한 침투 치밀한 조직 구조는 궁극적으로 저 RNA 수율을 야기. 여기에보고 된 프로토콜에 따라 30 ㎛의 섹션을 수집하고 버퍼 침투 노출 표면적을 증가 저온 절편 이후 니들 균질화가 근육을 방해 기계적하게 풀링. 이 기술의 주요 제한은 저온 유지가 필요하다고하고, 이는 상대적으로 낮은 스루풋이다. 그러나, 고품질의 RNA를 풀링 m 작은 샘플로부터 얻을 수있다uscle 저온부는 여러 가지 골격 근육과 다른 조직이 방법은 액세스 할 수 있도록. 또한,이 기술은 유사한 가능 분석 (예, 조직 병리학 및 유전자 발현) 측정치가 직접 실험 불확실성을 감소시키고위한 작은 조직 소스 필요 복제 성 동물 실험을 감소시키는 애플리케이션에서 비교 될 수 있도록 하나의 골격근의 인접 영역에서 여러 응용 프로그램.
서론
이 기술의 목적은 하나의 작은 골격근 조직 소스로부터 액세스 같은 조직 학적 및 유전자 발현과 같은 다른 양상, 여러 실험을 분석하는 것이다. 현미경 애플리케이션 신중 동결 동안 얼음 결정 생성물의 형성을 제한하도록 제어 되어야만 보존 방법을 시료에 가장 민감하다. 따라서, 분석법 개발을 경골근에 기초한다 (TA) 근 부분적으로 면역 형광 현미경 유전자 발현 양 분석을위한 원료로서 -140 ° C 액체 질소 냉각 -2- 메틸 부탄 욕에서 수지 매립 덮여 냉동.
다양한 기술적 접근법 동일한 원료를 사용할 필요가 좌우 근육 상이한 조건 실험 하나는 제어를 나타내는 근육 주사 기반 실험을 위해 특히 중요하다. 예를 들어, 근육의 재생 과정에서, 하나의 MUscle는 반대측 근육 차량 주입 제어 한 역할을하면서 광범위한 조직 손상을 유발하는 독소를 주사한다. 마찬가지로, 근육 질환에 대한 유전자 치료 연구는 일반적으로 반대쪽이 빈 벡터, 벡터 또는 비 관련 차량 제어와 비교되는 근육 내 주사에 의한 유전자 치료 벡터의 유효성 시작한다. 따라서, 다른 어플리케이션에 각각 TA 근육을 소싱 할 수 없다.
이러한 문제점을 해결하기위한 일반적인 전략은 : ⅰ) ⅱ....
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프로토콜
모든 동물의 절차는 동물 사용 프로토콜 A2013 07-016 (비들)에서 조지아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다.
미 정착 골격근 1. 냉동 보존
- 예비
- 약 (작은 사각형 면도날과 (약 1cm X 1cm)에 코르크를 잘라 소스 마우스와 근육을 식별하고, 매우 얕은 컷을 만들기 위해 2 메틸 부탄에 내성이 좋은 팁 마커 코르크에 쓰기 상면 전역 1mm). 조직을 배향에 사용할 컷에 플라스틱 커버 슬립을 삽입합니다. 모든 조직이 동결 보존 될 수 있도록 코르크가 준비 될 때까지 반복합니다.
- 액체 질소, 2- 메틸 부탄, 삽입 수지, 저온 온도계, 코르크, 해부 도구 및 연구 마우스를 얻습니다.
주의 : 액체 질소가 가열되면 폭발 할 수 있습니다 압축 된 가스이다. NI 액체 처리 할 때 실험실 코트, 저온 장갑 및 안면 보호구를 착용트로겐; 피부 접촉 또는 눈 화상이나 동상의 원인이 될 수 있습니다. 2- 메틸 부탄은 가연성, 독성, 건강과 환경에 위험이 있습니다. , 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 보호 안경)을 착용 흄 후드에서 주식 컨테이너를 열고, 밀폐 할 수있는 별도의 용기에 (일반적으로 200 ~ 400 ml)에 ....
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결과
근육을 동결 절단 (Cryosections)의 RNA는 품질이 높고, 대부분의 응용 프로그램에 충분한 수율을 제공합니다
여섯 골격근 RNA 제제의 분석은 8 대조군 마우스로부터 풀링 경골근 (TA) 근 19.4 41 mg의 사용 표 1에 나타낸다. 모두 좌측 (L) 및 우측 (R) TA 근육이 방법을 이용하여 근육 손상을 일으킬 삼일 식염수 또는 10 μM의 cardiotoxin 25 μL의 길이 근육 주사 후 채취 근육 재생 실험에서 제조 된 이전에 1을보고 하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 근육 동결 절단 (Cryosections)의 RNA에 대해 A260 / 280 비를 대표 샘플이 전형적으로 가깝거나 더 높다. "순수한"RNA는 2.2 / 2.0 및 A260.......
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토론
과잉 수지가 풀 저온부의 수집 속도가 느려집니다 및 RNA 분리에 수지 오염을 포함 증가시킬 수 있기 때문에이 방법으로 최상의 결과를 얻으려면, 조직 냉동 보존하는 동안 근육의 낮은 세 번째 또는 절반으로 제한 수지를 포함 유지. 또한, 바늘 균질화 동안 세심한주의 수율을 최대화하고, 바늘 막힘 가능성을 최소화하는 것이 중요하다. 프로토콜은 니들이 차단 방해물을 제거하기 위해 높은 압력이 필요로 될 경우의 샘플 손상을 방지하기 위하여 루어 코리아 주사기를 사용하여 변형 될 수있다. 25 또는 26 게이지 바늘과 바늘 추가적인 균질화 단계는 상기 RNA 수율을 향상 할 수있는 미세 조직 현탁액을 생성하기 위해 첨가 될 수있다. 클로로포름은 BCP 대체 할 수 있지만 BCP 덜 독성 및 RNA (12)의 유기 추출 동안 수성 단계에서 게놈 DNA 오염의 낮은 수준의 결과로,이 권장되지 않습니다. 증가균질화 덜 효율적입니다으로 풀링 저온부 μm의 30의 단면 두께는 사용하지 않는 것이 좋습니다.
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre, Junna Luan이 기술 지원을 제공했습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 지원을 받았습니다(수상 번호 AR065077). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 코르크 | VWR Scientific | 23420-708 | 날카로운 칼날로 작은 사각형으로 자릅니다. |
| 플라스틱 커버슬립 | Fisher Scientific | 12-547 | 얼어붙는 동안 근육의 방향을 잡는 데 사용됩니다. |
| 저온 온도계 | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-메틸부탄 | 시그마 | M32631-4L | 주의: 위험한 화학 물질. 가연성 캐비닛에 보관하십시오. |
| 임베딩 레진: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | 다른 임베딩 레진으로 cryomatrix를 대체할 수 있습니다. |
| 저온 유지 장치 | Thermo Fisher Scientific | microm HM550(일회용 블레이드 캐리어 포함 | 작동하는 모든 저온 유지 장치가 프로토콜에 충분해야 합니다. |
| 일회용 저온 유지 장치 블레이드 | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | 사용할 저온 유지 장치에 적합한 블레이드 또는 나이프를 사용하십시오. |
| RNAse 오염 제거 솔루션: "RNase Zap"Thermo | Fisher Scientific | AM9780 | |
| 분석 저울 | Mettler Toledo | XS64 | |
| 페인트 브러시 | Daler Rowney | 214900920 | 냉동 절편을 처리하는 데 사용합니다. 간단한 미술 용품이 있는 상점에서 찾을 수 있습니다. |
| 면도날 | VWR Scientific | 55411-050 | |
| 현미경 슬라이드 | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA 유기 추출 시약: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | 주의: TRIzol은 유해 화학 물질입니다. 참고: 골격근에서 RNA를 추출하는 데는 유기 추출 시약만 권장됩니다. |
| 18 게이지 바늘 | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 게이지 바늘 | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 게이지 바늘 | VWR Scientific | BD305115 | 선택 사항입니다. RNA 추출 프로토콜에서 3차 시료 분쇄에 사용할 수 있습니다. |
| 1 ml 주사기 | VWR Scientific | BD309659 | 매우 높은 가치의 샘플의 경우 Luer-Lok 주사기를 권장합니다 (><예 : < / i>, VWR BD309628). |
| 1-브로모-3-클로로펜탄(BCP) | 시그마 | B9673 | |
| DEPC 물에 70% 에탄올: 200 프루프 알코올 | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | 35ml 200프루프 알코올 + 15ml DEPC 물을 섞습니다. |
| DEPC 물 중 70% 에탄올: DEPC 처리된 물 | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | 35ml 200프루프 알코올 + 15ml DEPC 물을 혼합합니다. |
| RNA 정제 키트: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA 준비의 마지막 단계. |
| DNase/Rnase-free 물 | Gibco | 10977 | DEPC 처리수도 사용할 수 있습니다. |
| 분광광도계: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | 정제된 RNA를 처리하여 다운스트림 적용 전에 DNA 오염을 제거합니다. |
| 성 펜 | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco의 PBS, | Gibco | 14190 | PBS, 면역형광 프로토콜용. |
| 당나귀 세럼 | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | 제조사의 지시에 따라 일반 당나귀 세럼 재고를 재수화하고, 면역형광을 위해 분취액을 5%로 희석하십시오. 일반 염소 혈청도 사용할 수 있습니다. |
| eMHC 항체 | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI 항체 | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| 당나귀 안티 토끼 AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| 염소 안티 마우스 IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6- 디아미디노-2-페닐린돌) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| 수성 장착 매체: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | 페이드 방지 특성이 있는 형광 애플리케이션용으로 설계된 장착 매체만 사용하십시오. |
| 유리 커버슬립 | VWR Scientific | 16004-314 | 면역형광 프로토콜 끝에 슬라이드 장착에 사용 |
| 이미지 분석 소프트웨어: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express 또는 고급 제품 | 프리웨어 ImageJ도 수동 카운팅에 사용할 수 있습니다. 세분화 준수 기능이 있는 고급 소프트웨어는 프로세스의 부분 자동화를 허용할 수 있습니다. 예: , ImageProPremier. |
| 섹션 이미지 병합 및 매핑: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659가 중단되었습니다. 심독소에 대한 다른 옵션은 EMD Millipore #217503; 미국 사용자 정의 화학 공사 # BIO0000618; 또는 Ge 스크립트 # RP17303; 그러나 이것들은 검증되지 않았습니다. |
| 역전사 키트: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | 검증된 고품질 역전사 시약을 사용할 수 있습니다. |
| 표준 PCR: GoTaq Flexi 중합효소 시스템 | Promega | M8298 | 검증된 고품질 Taq 중합효소 시스템을 사용할 수 있습니다. DNA 염기서열분석이 PCR의 모든 애플리케이션 다운스트림에 사용되는 경우, 대신 고충실도 PCR 시스템을 사용해야 합니다. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | 전용 qPCR 마스터 믹스를 사용하지 않을 때 qPCR에 사용합니다. SuperROX(Applied Biosystems 기기용) 및 GoTaq Flexi 중합효소 및 완충액과 함께 사용할 수 있습니다. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX는 PCR 반응에서 더 안정적이므로 ROX(카르복시-X-로다민)보다 qPCR 수동 참조 염료로 사용하는 것이 바람직합니다. Applied Biosystems 기기를 사용한 qPCR의 경우 |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
참고문헌
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
- Bartoli, M., et al.
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