이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 질병 모델링 및 재생 치료를위한 위대한 약속을 개최합니다. 우리는 이전에 말초 혈액 단핵 세포 (PB 다국적)에서 통합없는 iPSCs를 생성하는 에피 솜 벡터 (EV)의 사용을보고 하였다. 사용되는 에피 솜 벡터들은 각각 포유 동물 세포에서 플라스미드의 복제 및 장기 retainment 허용 엡스타인 - 바르 (EB) 바이러스로부터 oriP 및 EBNA1 요소 혼입 DNA 플라스미드이다. 상기 최적화, IPSC 콜로니 수천 말초 혈액 1 ㎖로부터 얻을 수있다. 높은 프로그래밍 효율성을 달성하기위한 두 가지 중요한 요인은 : 1) (2A)의 사용은 "자가 절단은"펩티드 따라서 두 요인 등몰 발현을 달성 OCT4 및 SOX2을 연결하는 단계; 2) 두 벡터의 사용은 MYC 및 KLF4에게 개별적으로 표현합니다. 여기 통합없는 IP를 생성하는 단계별 프로토콜을 설명성인 말초 혈액 샘플에서 희주. 잔류 에피 솜 플라스미드 다섯 구절 후 발견 할 수없는만큼 생성 된 iPSCs 통합-무료입니다. 리 프로그래밍 효율이 센다이 바이러스 (SV) 벡터에 필적하지만, EV 플라스미드 상당히 경제적 시판 SV 벡터 이상이다. 이 저렴한 EV의 재 프로그래밍 시스템은 재생 의학의 임상 적용 가능성 보유 등 통합이없는 중간 엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포에 PB의 다국적 기업의 직접 리 프로그래밍에 대한 접근 방식을 제공합니다.
서론
여러 전사 인자의 발현 후 강제 (즉, OCT4, SOX2, MYC 및 KLF4)는, 체세포는 재생 의학 및 세포 대체 요법 1-3에서 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)로 재 프로그램 할 수있다. 지금까지 다양한 방법이 4-7 재 프로그래밍의 성공율을 높이기 위해 개발되었다. 바이러스 통합 재 프로그래밍 요소에 대한 높은 수준의 안정적인 발현을 유도하기 때문에 바이러스 벡터 - 유도 리 프로그래밍 널리 iPSCs의 효율적인 생성을 위해 사용된다. 그러나, 세포 게놈 내로 벡터 DNA 영구 통합 삽입 성 돌연변이 5를 유도 할 수있다. 또한, 프로그래밍 요소의 부족 불 활성화는 iPSCs 차별화 8을 방해 할 수있다. 이와 같이, 프로그래밍 요소의 통합없이 iPSCs의 사용은 특히 세포 치료 응용에 사용하기 위해 필수적이다.
에피 솜 벡터 (전기 자동차)을 광범위하게 통합 무료 iPSCs의 생성에 사용됩니다. 가장 일반적으로 사용되는 EV는 엡스타인 바 바이러스 (EB) 바이러스 (9)로부터 두 개의 요소, 바이러스 복제 (oriP) 및 EB 핵 항원 1 (EBNA1....
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프로토콜
인간의 PB 샘플의 모든 지역 연구 윤리위원회의 승인을 천진 혈액 센터에서 사용할 수없는 식별 정보와 익명 성인 기증자로부터 얻었다.
1. 엔도가없는 플라스미드 준비
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 대장균에서 에피 솜 벡터를 추출하는 상업 플라스미드 정제 맥시 키트를 사용합니다. 최종 단계에서, 독소가없는 멸균 수로 대체 TE 버퍼는 DNA 펠렛을 용해.
- 시판 UV / 비스 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 농도는 일반적으로 A260 / A280은 각각 1.8 및 2.0 초과, A260 / A230의 비율이 1보다 큰 μg의 / μL이다.
2. 문화 미디어
- 적혈구 매체 준비 : 조혈 줄기 세포 확장 매체 100 NG / ㎖의 인간 줄기 세포 인자 (SCF), 10 ng의 / ㎖ 인터루킨 -3 (IL3), 2 U / ㎖로 보충 된 에리트로 포이 에틴 (예를 들어PO), 20 NG / ML의 인슐린 성장 인자 1 (IGF1), 1 μM 덱사메타손 0.2 mM의 1 티오 글리세롤. 0.22 μm의 주사기 필터로 멸균 필터. 적혈구 매체는 1 개월까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- IP....
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결과
이 프로토콜을 이용하여, 1 × 105 nucleofected PB 다국적 콜로니에서 수백를 얻을 수있다 (도 1a 및도 1b). 0.5 %와 식민지가 능성 마커 (도 1C 및 1D)를 표현 - 재 프로그래밍 효율은 약 0.2이다. 전술 한 프로토콜을 사용하여 생성 iPSCs 통합 무료이며 기형은 세 배엽 (도 1E 및 1F)을 형성하는 구성하는 능력을 가지고있다.
그림 1 : 말초 혈액 단핵 세포.......
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토론
건강한 기증자 또는 환자의 혈액 샘플을 취득하면 기초 연구 및 임상 세포 치료를위한 매력적인 셀 소스 만들기, 편리하고 비 침습적이다. 여기에서 우리는 말초 혈액 샘플에서 통합 무료 iPSCs의 효율적인 생성을위한 프로토콜을 설명했다. 이 재현하고 저렴한 방법은 IPSC 필드를 수혜가 예상된다.
우리는 고도로 효율적인 PB의 리 프로그래밍 (30)에 대한 책임이 중요한 요소가 있음을보고했다. 하나는 2A 링커 (31)를 사용하여 몰 OCT4의 표현과 SOX2입니다. 이를 달성하기 위해, PEV-OCT4-2A-SOX2이 프로토콜에서 사용된다. 다른 하나는 우리가 이전에 (30)를 사용한 것을 대신 PEV-MYC-2A-KLF4의 MYC 및 KLF4을 표현하는 두 개의 플라스미드 PEV-MYC 및 PEV-KLF4의 사용이다. 겉으로는 간단한 변화는 MYC에서 점진적으로 더 큰 증가에 주로 기인한다 PB의 재 프로그래밍 효율.......
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공개 사항
저자는 공개할 경쟁 또는 상충되는 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 과학기술부(2015CB964902, 2013CB966902 및 2012CB966601), 중국 국가자연과학재단(81500148, 81570164 및 81421002), 로마린다 의과대학 GCAT 보조금(2015), 원격 의료 및 첨단 기술 연구 센터(W81XWH-08-1-0697)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 조혈 줄기 세포 확장 매체 | 시그마 | S0192 | 4 °에 저장; C |
| 인간 줄기 세포 인자 (SCF) | Peprotech | 300-07 | -20 또는 -80 °에 저장; C |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | -20 또는 -80 °에 보관하십시오. C |
| 에리트로포이에틴(EPO) | Peprotech | 100-64 | -20 또는 -80 °에 저장; C |
| 인슐린 성장 인자 -1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | -20 또는 -80 °에 저장; C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | -20 또는 -80 °에서 보관하십시오. C |
| 1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | -20 또는 -80 °에서 보관하십시오. C |
| DMEM/F12 매체 | Gibco | 112660-012 | 4°C에 보관; C |
| L-글루타민 (100x) | Gibco | 25030-081 | -20 °에 저장; C |
| 페니실린/스트렙토마이신 (100x) | Gibco | 15140-122 | -20 °에 저장; C |
| 비필수 아미노산 용액 (100x) | Gibco | 11140-050 | 4°C에 보관; C |
| 섬유 아세포 성장 인자 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | -20 또는 -80 °에서 저장; C |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS, 100x) | Gibco | 41400-045 | 에 저장; C |
| 아스코르브산 | 시그마 | 49752 | -20 °에 저장; C |
| DMEM (고포도당) 매체 | Thermo | SH30243.01B | 에 저장; C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SV30087.01 | -20 °에 보관; C |
| Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | RT |
| Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 ° C |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | RT에 저장, 빛으로부터 보호 |
| Endofree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | RT |
| IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 ° C |
| Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | RT에 보관, nucleofection buffer와 supplement는 4 °에서 보관해야 합니다; C |
| 나트륨 부티레이트 | 시그마 | B5887 | -20 또는 -80 °에서 보관하십시오. C |
| ROCK 억제제 - Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | -20 °에 저장; C |
| 필수 8 기초 매체 (E8) | Gibco | A15169-01 | 4 °에 저장; C, 보충제는 -20 또는 -80 °에 보관해야합니다. C |
| Matrigel | BD | 354277 | -20 또는 -80 °에서 저장합니다. C |
| 2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye) | TransGen Biotech | AS111 | -20 °에서 저장; C |
| 세포 분리 용액 | STEMGENT | 01-0006 | -20°C에 보관 ° C, 세포 분리 용액으로서의 Accutase는 단일 세포 현탁액 |
| DAPI | Sigma | D9542-1MG | 4 또는 -20 °deg에서 저장합니다. C |
| Anti-Nanog AF488 | BD | 560791 | 4 °에 저장; C, 면역형광에 사용되는 1차 항체, |
| Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | 에 저장; C, 면역 형광에 사용되는 1 차 항체, |
| AF488 당나귀 안티 마우스 IgG | Invitrogen | A21202 | C, 면역형광에 사용되는 2차 항체, |
| PE anti-human TRA-1-60-R 항체 | Biolegend | 330610 | 희석 4 °에 저장; C, 유세포 분석에 사용되는 항체 |
| eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 ° C, 유세포 분석에 사용되는 항체 |
| Isotype 항체 | eBioscience | 11-4011 | 4 °에 저장; C, 유세포 분석에 사용되는 항체 |
| 알칼리성 인산가수분해효소 검출 키트 | SiDanSai | 1102-100 | 4°C에 저장; C |
| 게놈 DNA 추출 키트 | TIANGEN | DP304-02 | RT |
| Trypan Blue 솔루션에 | Sigma | T8154 | RT |
| 저장 유세포 분석 세포 분석기 | BD | LSRII | |
| 회전 디스크 컨포칼 현미경(SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | 컨포칼 이미징 |
| Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | PB MNC |
| ImageQuant LAS-4010 | GE | AP 염색 사진을 대량으로 촬영합니다 |
참고문헌
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human....
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재인쇄 및 허가
