방법 논문

실험 성 대장염 동안 장내 상피 장벽 기능에 영양 보조 식품의 유익한 효과 분석

DOI:

10.3791/55095

⸱

2017년 1월 5일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

이 논문에서

요약

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염증성 장 질환 (IBD)의 현재 치료는 질병의 증상을 완화 목표로하지만 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 대안 전략은 동물 대장염 모델에서 연구되고있다. 여기서 우리는 임상 IBD 표지판에 다이어트 보조제의 유익한 효과는 이러한 대장염 모델에서 분석 방법에 대해 설명합니다.

초록

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크론 병과 궤양 성 대장염을 포함한 염증성 장 질환 (IBD)는, 내장의 만성 재발 성 질환이다. 그들은 영향을받는 개인 이러한 복부 경련, 피 묻은 설사, 체중 감소 등의 심각한 문제를 일으킬. 불행하게도, 치료법은 아직없고, 치료는 증상을 완화하는 것을 목표로하고 있습니다. 현재 치료는 심각한 부작용을 일으킬 수 소염 및 면역 억제제를 포함한다. 이는 부작용을 일으키지 않는 등의 영양 보충제와 같은 다른 치료 옵션에 대한 검색을 보증한다. 임상 연구에의 응용하기 전에, 이러한 화합물은 엄격 동물 모델에서 효율성과 보안을 테스트해야합니다. 신뢰성있는 실험 모델은 인간에서의 궤양 성 대장염의 임상 징후의 많은 재생 마우스에서 덱스 트란 황산나트륨 (DSS) 대장염 모델이다. 우리는 최근에 들어있는 영양 보충의 유익한 효과를 테스트하기 위해이 모델을 적용비타민 C와 E, L 아르기닌, 및 ω3-고도 불포화 지방산 (PUFA). 우리는 다양한 질병 매개 변수를 분석하고이 보충 질병 활동 지수가 전반적으로 개선 선도, 부종 형성, 조직 손상, 백혈구 침윤, 산화 스트레스 및 염증성 사이토 카인의 생산을 개선 할 수 있었다 것으로 나타났습니다. 이 글에서, 우리는 구체적으로 올바른 C57BL / 6 마우스의 DSS 대장염 모델을 사용하여 영양 보충제의 응용 프로그램뿐만 아니라 방법 등 조직학, 산화 스트레스, 염증 등 질병 매개 변수가 평가됩니다 설명합니다. 다른 다이어트 보조제의 유익한 효과를 분석하는 것은 다음 결국 IBD의 증상을 완화 및 / 또는 그 심각한 부작용을 유발하지 않고 죄 사함의 위상을 연장 대체 치료 전략의 개발을위한 새로운 길을 열 수 있습니다.

서론

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대장염은 설사와 복통을 일으킬 수있는 대장의 염증 상태이다. 대장염 감염 또는 스트레스에 응답하여, 급성이거나, 그러한 염증성 장 질환 (IBD)의 그룹에 속하는 궤양 성 대장염 (UC)와 같이 만성 질환으로 발전 할 수있다. UC의 임상 증상이 잘 설명되었지만, 병인은 여전히 좋지 1 이해된다. UC는 중요한 역할이 재생 유전 변이 및 비정상적인 면역 반응과 더불어, 인성 질병이라고 전문가들 사이에서 허용됩니다. 그러나, 생활 스타일 및 영양과 같은 환경 적 요인은 또한 질환의 발생 및 진행 (3)에 기여한다.

불행하게도, IBD는 경화 아니라, 임상 증상을 완화하는 것을 목표로 많은 치료 옵션이 있습니다. 현재의 치료법은 설파살라진 및 코르티코 스테로이드와 같은 소염제를 포함한다; 이러한 azathio과 같은 면역 억제제,prine; 이러한 인테그린과 같은 종양 괴사 인자 α (TNF-α), 또는 블록과 같은 부착 분자 캡처 염증성 사이토 카인, 과도한 백혈구 보충을 감소시키는 모노클로 날 항체; 이러한 야누스 키나제 (JAK) 4와 같은 염증성 경로를 트리거 키나제를 표적 억제제. 모든 환자가 모든 치료에 반응 때문에 치료 전략 (5)를 개별화해야합니다. 또한, 이들 치료제의 대부분은 종종 심각한 부작용을 일으키는 대사 및 면역 반응을 방해. 이런 이유로, 대안적인 치료 옵션이 조사되었다.

대체 치료는 프로 바이오 틱과 성공 6,7 다양한 수준의 동물 모델 및 임상 시험에 적용된 영양 보충제를 포함한다. 최근 발견되는 것과 같은 항산화 비타민 또는 ω3 - 불포화 지방산과 같은 다른 하나의 영양제의 애플리케이션 (PUFAs)는 대장염 및 심혈관 질환의 증상을 완화 8,9 그러한 보조제의 조합의인가 열등하다. 이러한 연구는 마우스에서 수행되었다 때문에 임상 연구이 연구 결과는 인간에 적용 가능할지 여부를 결정하기 위해 인간이 수행되어야한다. 임상 연구가 시작되기 전에, 새로운 치료 방법의 효능 및 안전성은 동물 모델에서 평가되어야한다.

IBD를 들어, 덱스 트란 황산나트륨 (DSS) 모델은 광범위 질병 발전의 메커니즘과 약물 및 영양제 6,10의 유익한 효과를 연구하기 위해 사용되었다. 대부분의 연구에서 유도 칠일의 기간 동안 만 급성; 그럼에도 불구하고, 이들 동물에서 관찰 된 임상 징후 밀접 IBD 환자에서 관찰 된 것과 유사한 (즉, 혈변, 체중 감소, 상피 장애, 및 면역 세포 침윤) 10. DSS는 점막에 미란을 야기장벽 기능 장애에 증가 장내 상피 투과성 (11)의 결과. 정확한 메커니즘은 알 수없는 남아 있습니다. 그러나, 연구는 DSS는 상피 세포를 입력하고, 염증성 신호 전달 경로 (12)를 유도 할 수있는 나노 lipocomplexes을 형성하는 중간 사슬 길이의 지방산과 상호 작용하는 것을 의미한다. 이 글에서, 우리는 유도와 각 동물에 일정한 용량을 보장하기 위해 위관 영양법으로 적용하는 방법을 영양 보충제 마우스에 분석 대장염 방법을 자세히 설명하고 다양한 대장염 증상에 같은 보충제의 효과는 방법을 조사하고 있습니다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 Cinvestav의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. DSS 마시는 물 준비 및 대장염의 유도

  1. 멸균 된 마시는 물에 3.5 % w / V 덱스 트란 황산 나트륨 (DSS) 솔루션을 준비합니다. DSS 쉽게 용해하고 최종 용액을 필터링 할 필요는 없다.
    참고 : DSS 처리 7 일 심한 대장염을 유도한다. 가벼운 장염을 유발하는 경우 3 - 치료 4 일의 권장합니다. 만큼 DSS 식수 명확 유지로서, 상기 물을 변경할 필요가 없다. 이 혼탁 변한다면, 그것은 교체되어야한다.
  2. 수컷 마우스의 기본 무게를 기록한다. 12주 나이 21의 범위 내에서 - - 25g의 체중들은 8 있는지 확인합니다.
    주 : 해당 DSS 농도는 각각의 실험실에서 최적화되어야한다. 결과는 크게 주택 조건에 따라 다를 수 있습니다. 2.5 사이의 농도 - 5 %는 일반적으로 강한 C를 유도하는 것으로보고되고C57BL / 6J WT 마우스 10 olitis. 결과는 DSS의 다른 소스와 다를 수 있습니다 서로 다른 기업과 다른 많은에서 DSS는, 테스트해야합니다.
  3. 임의 량의 물을 제공하고 필요한 경우 신선한 3.5 % DSS 물로 교체합니다.

위관 영양 보조 식품 2. 응용 프로그램

  1. 적당한 용매에서 원하는 영양 보충제의 "급송"솔루션을 준비합니다. 이 연구를 위해, 우리는 200 밀리그램 / kg의 L- 아르기닌, 83 ㎎ / ㎏ 비타민 C 46 ㎎ / ㎏ 비타민 E 77 밀리그램 / kg 에이코 사 펜타 엔 산 (EPA) 및 115 ㎎ / ㎏ 도코 사 헥사 엔 산을 함유하는 혼합물 (DHA 사용 )를 1 : 물과 홍화 오일 (1) 솔루션입니다.
  2. 위관 바늘에 연결 1 ML의 주사기를 채우기 영양 보충 혼합물 (15 G 50 mm의 X). 바늘의 외부의 화합물을 제거하고 적절한 용량의 애플리케이션을 보장하기 위해 위관 바늘의 외부를 닦습니다.
  3. 꼬리의베이스를 잡고 마우스를 억제한 손으로 단단히 다른 손의 엄지 손가락과 집게 손가락으로 목 뒤쪽에 피부 배를 파지하여. 세 번째 손가락과 목을 보유하고 같은 손의 엄지 손가락의베이스 사이의 꼬리를 놓습니다.
  4. 수직 위치에 마우스를 유지하면서, 동물의 입의 왼쪽에 바늘을 삽입하고 조심스럽게 식도를 찾을 수 입의 지붕을 따릅니다. 어떠한 저항이 발생하지 않은 경우, 위 방향으로 바늘을 전진.
    참고 : 동물이 진행하기 전에 제대로 호흡되어 있는지 확인합니다.
  5. 천천히 혼합물을 관리 천천히 주사기를 잡아 당겨 튜브를 제거하고 마우스를 놓습니다. 대장염 실험의 과정 동안 위관 회 영양 보충제를 적용합니다.

디지 활동 지수 3. 결정

주 : 질병 활성 지수 OB있는 체중 감소, 항문 출혈 및 대변 일관성 점수의 조합매일 13 tained.

  1. 매일 체중을 측정하고, 중량 감량 율에 따라 0 내지 4의 점수를 할당 (0 : 0 %, 1 : 1-5% 2 : 5-10% 3 : 10~20%, 4 :> 20 %).
    주 : 체중 손실 DSS-대장염의 유도와 실제 중량 전에 기저 중량 % 사이의 차이를 계산함으로써 결정된다.
  2. 항문 출혈의 수준을 결정하기 위해, 신선한 분변 시료를 수집하고 guaiac 분변 잠혈 검사 키트 슬라이드에 얇은 스미어를 적용하도록 제공 어플리케이터를 사용한다. 각 샘플에 대한 새로운 어플리케이터를 사용합니다.
    1. 전면 커버를 닫고 슬라이드 뒷면에있는 창을 엽니 다. 샘플 위치에서 뒷면에 현상액의 2 방울을 적용합니다.
    2. 30 초 후 결과를 읽어보십시오. 블루 색상의 흔적은 잠혈에 대한 긍정적이다. 포지티브 guaiac 분변 잠혈 검사 (신호 강도에 따라), 3 - 4 - 2.5 없음 0.5 : 0~4 (0의 스코어를 할당 촉진제SS 출혈).
      참고 변에 혈액이 보이면 guaiac 분변 잠혈 검사를 수행해야하고, 3 점, 3.5, 4 가시 혈액의 양에 따라 할당하지 않는다.
  3. 신선한 대변 샘플을 관찰하여 대변의 일관성을 결정합니다. (설사 0 : 일반 / 고체 0.5 - : - 2.5 4 반죽 의자, 3) 4 0의 점수를 할당합니다.

에반스 블루 분석에 의해 생체 내에서 장내 상피 투수를 결정 (4)

  1. 생리 식염수 (0.9 % 염화나트륨)로 희석 케타민의 혼합물 (체중 100 밀리그램 / kg)과 자일 라진 (13 밀리그램 / 체중의 kg)으로 복강을 주입하여 동물을 마취하고, 핀치를 모니터링함으로써 마취 깊이를 평가할 철수 반사.
  2. 부정사 위치에 마취 동물을 놓고 장 노출하는 개복술을 수행합니다.
  3. 맹장을 찾아 콜론 (a)의 근위 부분에 작은 절개를scendens (맹장에 이상적으로, 바로 옆).
  4. 먹이 바늘 (G22)를 삽입하고 공통의 실크 스레드를 사용하여 합자로 고정합니다. 조심스럽게 튜브를 통해 풍부한 PBS 세척은 대장에서 모든 배설물을 씻어합니다. 이 항문에 도달 할 때까지 대장에 에반스 블루 용액 (1.5 % w / PBS에서 V)을 주입.
  5. 15 분 동안 에반스 블루를 품어. 항문 주위 유실가 선명해질 때까지 풍부한 PBS와 튜브를 세척하여 염료를 세척 할 것.
  6. 자궁 전위에 의해 동물을 안락사.
  7. 대장을 절제하고 풍부한 PBS로 다시 씻어. 대장 점액을 고집하는 염료를 제거하기 위해 PBS에서 6 밀리미터 N의 -acetylcysteine 1 mL로 한 번 씻어.
  8. 길이 방향으로 결장을 잘라 PBS 6 mM의 N의 -acetylcysteine 1 mL로 한 번 더 그것을 씻어.
  9. 무게와 길이를 기록한다. 부드러운 agitatio 실온에서 하룻밤, N 2 mL의 N 디메틸 포름 아미드를 콜론을 놓고 에반스 블루 염료를 추출하려면엔. 610 nm에서 분광 광도계 염료 농도를 측정한다.

5. 조직 컬렉션

  1. 생리 식염수 (0.9 % 염화나트륨)로 희석 케타민의 혼합물 (체중 100 밀리그램 / kg)과 자일 라진 (13 밀리그램 / 체중의 kg)으로 복강을 주입하여 동물을 마취하고, 핀치를 모니터링함으로써 마취 깊이를 평가할 철수 반사.
  2. 자궁 전위에 의해 동물을 안락사.
  3. 부정사 위치에 동물을 놓고 복강을 노출 개복술을 수행합니다.
  4. 가위를 사용하여 전체 결장 해부 길이를 기록한다.
  5. 대변을 제거하기 위해 냉장 PBS로 콜론을주의 깊게 여러 번 세척하십시오. 티슈 중량을 기록하여 단계 5.6에 기재된 바와 같이, 이하의 실험을 준비 - 5.8.
  6. RNA 분리 및 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO) 분석을 위해, (100 ㎎을 충분합니다), 튜브 내부에 배치하고, SNA 적절한 크기의 조직 샘플을 잘라액체 질소를 p는 동결. 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 조직을 저장합니다.
  7. 면역 형광 염색 및 산화 스트레스 결정 (아래 참조)의 경우, 작은 대장 샘플 컷 (0.5-1 센티미터) 및 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물로 채워진 작은 알루미늄 컵을 덮어서 가리다. 건조 얼음 컵을 배치하고 버블의 형성을 피하기 위하여 천천히 얼게. 냉동 된 조직 샘플은 나중에 사용하기 위해 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
  8. 스위스 14 롤의 경우, 길이 방향으로 결장을 열고 조심스럽게 집게를 사용하여 대변을 제거합니다. 점막이 뾰족한 집게 또는 얇고 둥근 나무 막대기를 사용하여 안쪽으로 향하게하여, 그것을 롤. 조심스럽게 매립 카세트 내부에 배치 단계 6.1를 계속합니다.
    참고 : DSS가 대장에 손상을 유도한다. 그러나, 손상 분포는 일반적으로 원위 결장과 직장에서 본 가장 손상, 말초 결장의 근위부에 따라 다릅니다. 따라서, 우리는 원위 COL 어느 일방 조직학 분석 권장또는 전체 대장의 스위스 역할을한다.

헤 마톡 실린 - 에오신 염색에 의한 대장 조직학 6. 분석

  1. 조직 준비
    1. 조직 학적 분석을 위해 적절한 고정을 달성하기 위하여, 실온 (RT)에서 48 시간 동안 10 % 포름 알데히드를 5 ml의 스위스 롤이나 제어의 특정 결장 영역으로부터 작은 조직 조각을 처리 한 마우스를 잠수.
      주 : 달리 언급하지 않는 한 6 단계에서 상기 모든 단계가 실온에서 수행된다.
    2. 18 시간 동안 수돗물로 씻으십시오.
    3. 1 시간, 1 시간, 1 시간 동안 96 %, 및 무수 에탄올, 70 % 에탄올 15 mL로 이들을 탈수. 다음 농도를 진행하기 전에 신선한 알코올로 각 단계를 반복합니다.
    4. 무수 에탄올 7.5 mL를 1 시간 동안 절대 크실렌 7.5 mL를 혼합하여 탈수를 계속한다. 1 시간 동안 절대 자일 렌 15 mL의 샘플을 전달하기 전에 한 번 반복합니다. 신선한 크실렌 한 번이 단계를 반복합니다.
    5. 파라핀에 결장 조직 샘플을 포함
      1. 17 시간 동안 액체 파라핀 50 ㎖의 샘플을 담가. 한 번 만 3 시간 동안이 단계를 반복합니다.
      2. 액체 파라핀의 810 mL에 : 큐브 샘플 (22 X 22 X 22mm 플라스틱, 사각형 금형, 크기)을 빠져.
      3. 대장 조직 샘플 파라핀 실온에서 24 시간 동안 응고하도록 허용합니다.
    6. 마이크로톰을 사용하여 조직 단면을 절단
      1. 5 ㎛의 두께로, 제조자의 지시에 따라, 마이크로톰을 사용하여 결장 샘플을 잘라.
      2. 0.3 % 젤라틴을 포함하는 수조 (1 L)의 절단을 모은다. 이것은 조직 단면의 접힘을 방지한다. 조직 섹션을 복구하고 유리 슬라이드에 그들을 탑재합니다.
    7. 조직 간 부분의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색
      1. 배양기에서 60 ° C에서 18 시간 동안 샘플을 Deparaffinize. 이를 위해, 유리 (S)을 사용하여LIDE는 핸들 랙.
      2. 탈 파라핀 한 후, 5 분 동안 절대 크실렌 70 ㎖의 슬라이드 젖어. 신선한 크실렌 한 번이 단계를 반복합니다.
      3. 1 분 동안의 무수 알코올 70 mL의에 샘플을 전송합니다. 신선한 알코올 번이 단계를 반복합니다.
      4. 1 분 동안 에탄올 96 %의 70 ㎖의 대장 조직 샘플을 품어. 신선한 알코올 번이 단계를 반복합니다.
      5. 2 초 동안 두 번 수돗물 샘플을 씻으십시오.
      6. 7 분 동안 해리스 헤 마톡 실린의 조직을 품어.
      7. 2 초 동안 두 번 수돗물 샘플을 씻으십시오.
      8. 산성 알코올 시료 (70 % 에탄올 70 mL의 1 M 염산 700 μL) 7 초 동안 부화.
      9. 2 초 동안 두 번 수돗물 샘플을 씻으십시오.
      10. 탄산 리튬 7 초 동안 (증류수 100ml에 탄산 리튬 1 g)을 70 mL의 조직 샘플을 인큐베이션.
      11. 2 초 동안 두 번 수돗물 샘플을 씻으십시오.
      12. 에탄올 (80) 70 mL에 샘플을 품어1 분 %.
      13. 15 초 동안 70 mL를 에오신-Y로 샘플을 전송합니다.
      14. 1 분 동안 96 %의 에탄올 70 mL에이를 부화. 신선한 알코올 번이 단계를 반복합니다.
      15. 1 분간 무수 에탄올 (에틸 알코올 절대 무수) 70 ㎖의 조직 샘플을 인큐베이션. 신선한 알코올 번이 단계를 반복합니다.
      16. 절대 알코올 35 mL를 혼합 1 분 동안 절대 자일 렌 35 mL를 70 mL에 샘플을 품어.
      17. 1 분 동안 절대 자일 렌 70 mL의에 샘플을 전송합니다. 신선한 절대 자일 렌 70 mL에 5 분 동안이 단계를 반복합니다.
      18. , 대장 조직 샘플에 합성 수지의 80 μL 추가 된 커버로 커버하고, 실온에서 24 시간 동안 그들을 건조 할 수 있습니다. 마지막으로, 명 시야 현미경 (8)를 사용하여 샘플을 분석한다.

    면역 형광에 의해 7. 분석 접합 구성

    1. 단계 5.7에 기재된 바와 같이 조직을 준비하여 8 ㎛의 두께의 단면을 절단그라 이오 스탯을 사용.
    2. 수정하고 20 분 동안 -20 ℃에서 96 % 에탄올로 대장 단면을 Permeabilize 하시려면.
      주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 인큐베이션은 이후 건조 및 형광 색소 변색을 방지하기 위해 습기가 어둠 상자에서 RT에서 수행한다.
    3. 공기 건조 샘플, 다음 1X PBS로 5 분간 3 회 씻어
    4. 2 시간 동안 PBS (0.01 % 트윈, 2 %의 BSA를 함유) 용액을 차단하여 샘플을 인큐베이션.
    5. 블로킹 용액을 제거하고 10 분 동안 PBS-0.01 % 트윈으로 씻어.
    6. 이 시간 동안, PBS-0.01 % 트윈에서 원하는 농도 차 항체를 희석.
    7. 상기 세정액 ​​제거 이전 단계의 항체 용액을 적용하고, 습윤 상자에서 4 ℃에서 밤새 배양한다.
    8. 항체 용액을 제거하고 매우 온화한 교반과 함께 10 분 동안 탈 이온수로 한번 5 분마다 PBS-0.01 % 트윈으로 3 회 세척하고.
    9. 세척, 원심 분리기 불소 동안ochromeconjugated, 종 특이 4 ° C에서 20 분 동안 14,000 XG에 이차 항체.
    10. PBS-0.01 % 트윈 (Tween)의 제공자에 의해 나타낸 바와 같이, 석출물이없는 차 항체 희석을 적용하고, RT에서 1 시간 동안 배양한다.
    11. 단계를 반복 7.8 가능한 한 완전히 세척 용액을 제거.
    12. 의 피펫 4 μL 슬라이드에있는 각각의 샘플을 통해 에이전트를 안티 - 페이딩.
    13. 커버 슬립과 샘플을 커버.
    14. 1 시간 동안 공기 건조.
    15. 매니큐어와 인감 슬라이드. 슬라이드를 추가 분석 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
    16. 공 초점 레이저 현미경 (8)에 분석 할 수 있습니다.

    에티 디움의 산화에 의한 산화 스트레스의 8 결정

    1. 5 ㎛의 두께로 저온 유지 장치에 결장 섹션을 단계 5.7에서 설명한 절단으로 DSS 대장염 7 일 후 조직을 준비합니다. 유리 슬라이드 위에 마운트 단면은 폴리 -L- 라이신 용액으로 처리하고, 샘플 재치를 품어시간 5 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 물에 dihydroethidium (DHE)의 μM.
    2. PBS (산도 7.6) RT에서 교반과 함께 15 분 각 3 회 샘플을 씻으십시오. 공기 샘플을 건조하고 형광을 보호하기 위해 매체를 장착 한 방울을 추가합니다. 산화 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 에티 디움 (40X 배율, 568 nm 파장)의 형광을 관찰한다.

    MPO의 분석에 의한 백혈구 모집 9. 분석

    1. DSS 대장염 7 일 후, 대장 조직을 수집하고 샘플을 균질화 - 얼음에 호모 게 나이저를 사용하여 헥사 1 ㎖ (HTAB) 버퍼 (50 mM의 0.5 %의 HTAB 인산 완충액, pH를 6.0)과 (200 400 mg)을.
    2. 10 초마다 40 % 진폭 다섯번 해물 모든 조직을 포함하고 초음파 처리하는 하나의 버퍼 용액 HTAB 회 균질화 끝을 헹군다. 액체 질소 세 번에 동결 해동.
    3. 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기와 뜨는를 수집합니다.구연산 나트륨 (물 중 1 M), 과산화수소 수 0.1 ㎖를 ABTS, 5 mL를 혼합 한 2,2'- 아지노 - 비스 (3-ethylbenzothiazoline -6- 술폰산) (ABTS) 용액을 준비하고, Bi를 45 mL의 -증류수.
    4. 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 0.1 mL의 ABTS 용액 각각의 상층 액 0.1 mL로 섞는다. 10 분 후 분광 광도계를 이용하여 460 nm에서 흡광도를 측정한다.

    (10) PCR에 의한 염증성 사이토 카인의 발현을 평가

    1. 조직의 균질화
      1. 전력 균질기를 사용하여 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 혼합물을 1 mL의 결장 조직 표본을 50 내지 100 mg의 균질화.
      2. 실온에서 15 분 동안이를 부화.
    2. 상 분리
      1. 클로로포름 0.2 mL를 넣고 30 초 동안 격렬하게 흔들어.
      2. 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
      3. 4 ℃에서 60 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기.
      4. U 자 이동신선한 튜브 (~ 500 μL)에 pper 수상.
    3. RNA 침전 및 재 부유
      1. 이소 프로필 알코올 0.5 mL를 넣고 60 분 동안 4 ° C에서 샘플을 품어.
      2. 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기.
      3. 완전히 뜨는을 제거합니다.
      4. 에탄올 75 %와 소용돌이의 1 ML을 추가합니다.
      5. 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기.
      6. 뜨는을 제거합니다.
      7. 3 ~ 5 분간 자연 건조 나머지 에탄올을 허용합니다.
        참고 :이 크게 용해도를 감소로 RNA 펠렛이 완전히 건조하게하지 않는 것이 중요합니다.
      8. 디 에틸 피로 카보 0.3 ㎖ (DEPC) 처리 된 물에 펠렛을 다시 녹인다. 즉시 -80 ° C에서 또는 저장 (단계 10.5을 참조 안정적)의 cDNA에 RNA 샘플을 전사.
    4. RNA 정량
      1. DEPC 처리 된 물 99 μL와 RNA 1 μL를 희석.
      2. 제 읽기260 nm에서 샘플 농도 및 순도를 결정하기 위해 UV / VIS 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서 OD 전자.
    5. cDNA를 합성
      1. 의 RNase없는 멸균 튜브 1 올리고의 μL (DT) 12-18 (0.5 μg의 / μL) 및 DEPC 처리 된 물 (12 μL의 총 부피)와 RNA 샘플 (1-5 μg의)를 섞는다.
      2. 10 분 동안 70 ℃에서 인큐베이션.
      3. 10 배 PCR 버퍼 2 μL,의 MgCl 2 50 mm의 1 μL, 10 mM의의 dNTP 믹스 1 μL, 0.1 M 디티 오 트레이 톨의 2 μL (DTT)를 추가합니다.
      4. 5 분 동안 4 ° C에서 품어.
      5. 역전사 효소 1 μL를 추가하고 5 분 동안 42 ° C에서 품어.
      6. 15 분 동안 70 ℃에서 인큐베이션.
      7. 15 분 동안 4 ° C에서 품어. cDNA를 더 사용할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
    6. PCR
      1. 10 배 PCR 버퍼 2.5 μL, 25 mM의 1.5 μL의 MgCl 2를 혼합, 10 밀리미터의 dNTP 0.5 μL는, 혼합 0.25 μ25 μL의 총 부피의 Taq DNA 중합 효소, 0.25 μL 각 프라이머 (10 μM) 및 cDNA를 (100 NG) 및 멸균 L.
      2. 96 웰 열 자전거 타는 사람에 샘플을 실행합니다. 앞으로, 게놈 DNA의 증폭을 방지하고 프라이머가 다른 엑손에 위치해야 반전하려면 : IL1β-FW : GCAACTGTTCCTGAACTCAACT 및 IL1β-RE : TCTTTTGGGGTCCGTCAACT; IL6-FW : CCTTCCTACCCCAATTTCCAA 및 IL6-RE : AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC; KC-FW : TGTCAGTGCCTGCAGACCAT 및 KC-RE : CCTGAGGGCAACACCTTCA; 그리고 굴지-FW : TATCCACCTTCCAGCAGATGT과 액틴-RE : AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA. 15 초, 30 초 동안 58 ° C, 30 초 동안 72 ° C, 플러스 72 ℃에서 10 분간 최종 연장을 95 ° C에서 95 ° C에서 5 분 동안 30 사이클 뒤에 다음 PCR 조건을 사용하여 .

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결과

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다이어트 보조 식품 DSS 대장염에서 보호 할 수 있습니다

비타민 C, 비타민 E, 산화 질소 (NO) -source의 L- 아르기닌 및 ω3 - 불포화 지방산 (ω3-PUFAs에) 등의 항 염증 및 항산화 다이어트 보조제, 동물에서 다양한 성공 사용되고 모델은 염증성 질환 3,6,15의 흔적을 완화한다. 영양 실조, 산화 스트레스, 및 염증성 사이토 카인의 생산은 급성 및 만성 대장염 3을 트리거 할 수있다. 이전의 연구에서, 우리는 미량 영양소의 조합이 생체 내에서 DSS 유도 된 대장염에 대한 보호 효과를 보였다 있음을 증명했다. 여기, 우리는 이러한 효과가 8을 측정 하였다 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 첫째, 우리는 체중 감소의 세 파라미터 이루어진 질병 활성 지수 (D...

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토론

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임상 연구에서 영양 보충제를 사용하기 위해, 이득 등과 보충 안전 신중 동물 연구에서 생체 내에서 평가한다. 대장염의 경우, IBD의 임상 증상과 유사한 여러 적절한 동물 모델은 DSS, TNBS, 또는 아세트산을 이용한 화학 모델을 포함하여, 확립되었다; 녹 - 아웃 등 IL10-KO로 (KO) 모델; 및 입양 T 세포 전송 19-21를 사용하여 대장염을 면역 세포 매개. 대장염의 DSS 모델은 인간 IBD 많은 질병 증상과 유사한 및 대장염 (22)의 분자 메커니즘을 조사 연구의 과다 사용되어왔다 대장염 유도 신속하고 신뢰할 수있는 방법이다. 또한, DSS 대장염은 가역적이며, colitogenic 자극이 제거 된 후, 따라서 또한 조직의 치유에 대한 연구 수 있습니다. 제공되는 프로토콜 상세 이전에 우리의 실험실 8에 최적화 된 DSS 대장염 모델을 설명합니다.

단점은 환경...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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이 작품은 멕시코 과학 기술위원회 (CONACYT, 207268 및 233395 마이클 Schnoor에)에서 보조금에 의해 지원되었다. KFCO는 석사 학위를 취득 할 수있는 CONACYT의 장학금 (396260)의받는 사람입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
젤라틴 0.3% Bioxon158
10% 포름알데히드J.T. Baker2106-03
96-웰 플레이트, 평평한 바닥Corning3368
절대 에탄올 J.T. Baker9000-03
앱솔루트 크실렌J.T. Baker9490-03
ABTSSigma AldrichH5882
소 혈청 알부민Sigma-Aldrich9048-46-8
ColoScreenHelena Laboratories5072
Corabion (Merck, Naucalpan, Mexico에서 친절하게 제공)Merck
덱스트란 황산염 나트륨Affymetrix9011-18-1(M.W. 40,000-50,000)
DihydroethidiumLife TechnologyD11347
Eosin-Y J.T. BakerL087-03
Evans blueSigma-Aldrich314-13-6
급식  바늘Cadence Science Inc.9921
손잡이가 있는 유리 슬라이드 랙전자 현미경70312-16
유리 슬라이드코닝2947
Harris hematoxylin 시그마-알드리치H3136
헥사데실트리메티아암모늄 (HTAB)시그마 알드리치H6269
히스토셋 (임베딩 카세트)SimportM498.2
염산 1 MJ.T. Baker9535-62
과산화수소시그마 알드리치H3410
케타민PiSA 아그로페쿠아리아Q-7833-028
액상 파라핀 Paraplast39501-006
리튬 카보네이트 Sigma-Aldrich2362
N,N-dimethylformamideJ.T. Baker68-12-2
N-acetylcysteineSigma-AldrichA9165
플라스틱 큐브전자 현미경70181
폴리-L-라이신 용액Sigma-Aldrich25988-63-0
Prism 5 통계 소프트웨어 GraphPad 소프트웨어Prism 5
식염수 용액 0.9% NaClCS PiSAQ-7833-009
시트르산나트륨 시그마-알드리치W302600
합성 수지 Poly Mont7987
Taq DNA 중합효소Invitrogen11615-010
Tissue-tek. OCT 컴파운드Sakura Finetek4583
Tuberculine 주사기BD Plastipak305945
트윈 20Sigma-Aldrich9005-64-5
VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 매체 with DAPIVector LaboratoriesH-1200
XylazinePiSA AgropecuariaQ-7833-099

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 13-27 (2016).
  2. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
  3. Neuman, M. G., Nanau, R. M. Inflammatory bowel disease: role of diet, microbiota, life style. Transl Res. 160, 29-44 (2011).
  4. Lowenberg, M., D'Haens, G. Next-Generation Therapeutics for IBD. Current Gastroenterol Rep. 17, 21(2015).
  5. Bernstein, C. N. Does everyone with inflammatory bowel disease need to be treated with combination therapy. Curr Opin Gastroenterol. , (2016).
  6. Nanau, R. M., Neuman, M. G. Nutritional and probiotic supplementation in colitis models. Dig Dis Sci. 57, 2786-2810 (2012).
  7. Yamamoto, T. Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol. 29, 216-221 (2013).
  8. Vargas Robles, H., et al. Experimental Colitis Is Attenuated by Cardioprotective Diet Supplementation That Reduces Oxidative Stress, Inflammation, and Mucosal Damage. Ox Med Cell Longev. , 8473242(2016).
  9. Vargas-Robles, H., Rios, A., Arellano-Mendoza, M., Escalante, B. A., Schnoor, M. Antioxidative diet supplementation reverses high-fat diet-induced increases of cardiovascular risk factors in mice. Ox Med Cell Longev. 2015, 467471(2015).
  10. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  11. Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Curr. Protoc. Immunol. 104, Unit 15 25(2014).
  12. Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, 32084(2009).
  13. Mennigen, R., et al. Probiotic mixture VSL#3 protects the epithelial barrier by maintaining tight junction protein expression and preventing apoptosis in a murine model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 1140-1149 (2009).
  14. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
  15. Shen, W., Gaskins, H. R., McIntosh, M. K. Influence of dietary fat on intestinal microbes, inflammation, barrier function and metabolic outcomes. J Nutr Biochem. , (2013).
  16. Bruewer, M., et al. Interferon-gamma induces internalization of epithelial tight junction proteins via a macropinocytosis-like process. FASEB J. 19, 923-933 (2005).
  17. Fournier, B. M., Parkos, C. A. The role of neutrophils during intestinal inflammation. Muc Immunol. 5, 354-366 (2012).
  18. Yan, Y., et al. Temporal and spatial analysis of clinical and molecular parameters in dextran sodium sulfate induced colitis. PLoS One. 4, 6073(2009).
  19. Maxwell, J. R., Viney, J. L. Overview of mouse models of inflammatory bowel disease and their use in drug discovery. Curr Prot Pharmacol, S.J. Enna. , Chapter 5, Unit 5.57 (2009).
  20. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 135-146 (2009).
  21. Randhawa, P. K., Singh, K., Singh, N., Jaggi, A. S. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Kor J Physiol Pharmacol. 18, 279-288 (2014).
  22. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). JoVE. , (2010).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Prot. 2, 541-546 (2007).
  24. Naydenov, N. G., et al. Nonmuscle Myosin IIA Regulates Intestinal Epithelial Barrier in vivo and Plays a Protective Role During Experimental Colitis. Sci Rep. 6, 24161(2016).
  25. Sumagin, R., Robin, A. Z., Nusrat, A., Parkos, C. A. Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 to regulate the epithelial barrier and neutrophil recruitment. Muc Immunol. 7, 905-915 (2014).
  26. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
  27. Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 360(2013).

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