방법 논문

사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

DOI:

10.3791/55108

⸱

2017년 10월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.

초록

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허 혈 성 뇌졸중은 혈전 또는 두뇌의 부분에 혈액 흐름을 방해 하는 embolus로 인 한 복잡 한 뇌 손상. 이것은 산소와 포도 당, 에너지 실패 원인과 신경 죽음의 부족. 허 혈 성 뇌졸중 모욕 후 이다 반응 되 고 그것은 개발로 부상 사이트 격 증. 이 시나리오에서는 허 혈에 노출 된 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여를 공부 하기 어렵습니다. 따라서,이 문서의 기본 사이토 반응성 산소 포도 당 부족 (지도부) 라는 허 혈 같은 환경의 체 외에 모델 확산을 공부 하는 방법을 소개 합니다. 이다 1-4 일에서 고립 되었다-오래 된 신생아 쥐와 일반적인 astrocytic 셀 수 사이토 선택 마커 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 및 핵 얼룩을 사용 하 여 평가 했다. 기간 이다 지도부 조건에 복종 된다 수 사용자 지정할 수, 그들은에 노출 되는 산소의 백분율 뿐만 아니라. 이 유연성 과학자를 셀 체 외의 다른 그룹에서 허 혈 성 같은 상태 기간 특성을 수 있습니다. 이 문서에서는 사이토 반응성, hypertrophic 형태학 및 확산 증식 세포 핵 항 원 (PCNA)를 사용 하 여 면역 형광 검사로 측정 된 유도 지도부의 시간대를 설명 합니다. 확산, 게다가 이다 에너지와 산화 스트레스를 받게 하 고 응답 지도부 셀 중간에 녹는 요소를 해제 하 여. 이 매체는 수집 고 분자 이다 세포 세포 상호 작용 없이 기본 신경 문화에 의해 발표의 효과 분석 하는 데 사용 될 수 있습니다. 요약 하자면,이 1 차 셀 문화 모델 부상 시 절연된 이다의 역할을 이해 하 효율적으로 사용할 수 있습니다.

서론

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선 "는 급성 신경 부전 혈관 근원의 증상 및 징후, 뇌의 초점 분야의 참여 하에 해당의 급격 하거나 급속 한 개발"1,2로 정의 됩니다. 뇌졸중의 두 가지 유형이 있다: 출혈 및 허 혈 성. 혈관 장애는 동맥 류 또는 arteriovenous 오작동, 약화의 동맥, 후부 파열과 동반 하 여 발생 하는 경우이, 죽음에 이르게 하는 대부분의 경우에는 출혈 성 뇌졸중3 이라고 불린다. 혈전 또는 embolus 혈액 흐름을 방해, 산소와 포도 당 두뇌 지역에의 임시 박탈을 일으키는 그것 이라고 뇌경색4합니다. 영향을 받는 지역 또는 항상성 및 대사 불균형, 에너지 장애, 신경 죽음, 및 염증5, 환자6평생 장애를 일으킬 수 있는 허 혈 성 핵심 리드 주위 세포를 키 우다 실패.

허 혈 성 뇌졸중은 반응 하 고 다른 시간 지점에서 그들의 효과 발휘 하는 셀의 여러 종류를 포함 multifactorial 부상이 다. 많은 상호 작용 개별 셀의 동작을 연구 하는 어려운 환경을 만들....

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프로토콜

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1-4 일 산 후 쥐 (Sprague Dawley) 오래 된 외피가 분리 하는 데 사용 됩니다. 안락사는 잘린, NIH 지침에 의해 승인.

1. 악기의 준비와 수술에 대 한 자료

  1. 압력솥에 Sterilize 계기 (온도: 121 ° C, 압력: 15 psi, 시간: 30 분) 강철 상자 또는 살 균 주머니 씰링 인스턴트를 사용 하 여. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.

2. DMEM 준비 완료

  1. 압력가 물 700 mL를 포함 하는 1 리터 비 커에 추가 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 실 온에서 중간 파우더.
  2. 3.7 g/L 나트륨 중 탄산염, 솔루션은 자력으로 자극 하는 동안 추가.

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    결과

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    기본 astrocytic 문화의 주요 관심사 중 하나는 뉴런, oligodendrocytes, 섬유 아 세포, microglia 등 다른 세포의 존재 이다. 그림 1에서 쥐 외피가에서 고립 된 셀 미디어 변경 3 일 마다 졌고 중 치료 또는 치료와 함께 추가 LME 1 h. 24 시간 후에, 세포에 GFAP immunostained 되었고 DAPI와 counterstained. LME 치료 셀 8% 보여주었다 동안 치료 셀 긍정적인 세포 GFAP-39% 비의 평균을 보였다. 이러한 결과 LME 치료 및 미디어 변경 어떻게 효과적으로 감소 비 GFAP 긍정적인 세포 4.75 배, 농축 사이토 문화를 생산 하 여 보여 줍니다. 만약 1 시간 또는 6 h 지도부에 영향을 미치는 사이토 생존이이 방법론 후를 확인 하려면 그림 2 사이토 문화, 모욕 후 24 h의 MTT 분.......

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    토론

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    이 프로토콜 이다 쥐 외피가에서 격리를 설명합니다. 이 방법에서는, 그것은 microglia, oligodendrocytes, 섬유 아 세포 등 다른 세포 종류와 오염 감소에 중요 한입니다. Microglia의 수를 줄이기 위해, 몇 가지 단계를 취할 수 있습니다: 미디어, 떨고, 궤도 및 화학 치료를 변경. 가장 눈에 띄는 셀 오염 물질에 대 한 선택적 세포 마커를 사용 하 여 면역 형광 또는 문화 순수성을 확인 실험을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 이온화 칼슘 바인딩 접합 기 분자 1 (Iba-1)에 대 한 항 체 microglia 감지를 사용할 수 있습니다. 신경 죽음 문화에 일찍 시작 하 고이 세포는 플라스 크 도청 후 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 함께 제거 미디어 변경 3 일31. Oligodendrocytic 선구자 세포 olig2 NG2 등 항 체를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. GalC 미 숙 또는 성숙한 oligodendrocytes를 식.......

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    공개 사항

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    저자는 공개 없다.

    감사의 글

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    저자는 기술 지원에 대 한 파 올라 로페스 Pieraldi를 감사 드립니다. A.H.M.는 보조금 8G12MD007600 및 U54-NS083924이이 간행물을 지원에 대 한 감사. 우리 시설 지원에 대 한 NIH-NIMHD-G12-MD007583 그랜트를 감사합니다. D.E.R.A.는 NIHNIGMS-R25GM110513에서 제공 하는 원정대에 대 한 감사입니다. 우리는 일반적인 계측 영역의 사용에 대 한 감사와 광학 이미징 시설 RCMI 프로그램의 사용에 대 한 박사 Priscila Sanabria의 원조 G12MD007583 부여. 또한, 우리는 그의 뛰어난 역할을 촬영 하 고 편집 하는 시각적 프로토콜에 대 한 호세 빠 디 야 감사 드립니다.

    ....

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    < 강한 > 수술 도구-1 단계 < / 강한 >
    작동 가위 5.5 "Roboz CompanyRS-6812쥐의 목을 베는 데 사용되는 도구.
    곡선 집게 7 "  Roboz CompanyRS-5271두개골이 제거되는 동안 쥐의 피부를 잡습니다.
    미세 해부 가위 4 "  Roboz CompanyRS-5882쥐의 피부와 두개골을 모두 자릅니다.
    마이크로 해부 집게 4" 각도, 세밀하게 날카롭다 Roboz CompanyRS-5095두개골이 제거되는 동안 쥐의 피부를 잡습니다.
    미세 해부 집게 4" 약간 구부러진 0.8Roboz CompanyRS-5135피질을 분리하는 데 사용되는 도구.
    미세 해부 핀셋Roboz CompanyRS-4972뇌 수막을 벗깁니다.
    해부 현미경OlympusSZX16피질에서 수막을 제거하는 데 중요합니다.
    DMEM 준비 - step 2
    Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM)GibCo. Company11995-065세포의 성장을 지원합니다.
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    소 태아 혈청(FBS)GibCo. Company10437-010세포 배양을 위한 혈청 보충제.
    Anti-NeuNCell Signaling24307성숙한 뉴런을 감지하여 성상세포 배양을 검증하는 역할을 합니다.
    Anti-PCNACell Signaling2586증식하는 세포를 감지합니다.
    프로피듐 요오드화물(PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170세포사멸 염색.
    Anti-Olig1AbcamAB68105성숙한 희소돌기아교세포를 검출합니다.
    Anti-IBA1+Wako016-20001미세아교세포를 검출합니다.
    Cy3와 결합된 Anti-GFAP Sigma-Aldrich CompanyC9205처리된 세포에서 반응성 성상세포를 검출합니다.
    Alexa Fluor 488Molecular Probe Life TechnologyA1101안티 마우스 2차 항체.
    Alexa Fluor 555Molecular Probe Life TechnologyA21428Anti-Rabbit 2차 항체.
    4',6'-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542핵 염색.
    컨포칼 현미경Olympus
    세포 보충제.는 세포 보충제.은 산소은 는

    참고문헌

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
    2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
    3. Kassner, A., Merali, Z.

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