생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

요약

여기에서는 생리학적 산소 상태에서 mRNA의 5' 캡을 결합하는 번역 시작 인자를 분석하기 위한 인간 세포 배양 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아가로스 연결 m⁷GTP 캡 아날로그를 사용하며 캡 결합 인자 및 이들의 상호 작용 파트너를 조사하는 데 적합합니다.

초록

번역 조절은 특히 세포 스트레스 기간 동안 유전자 조절의 초점입니다. eIF4F 복합체를 통한 캡 의존적 번역은 진핵 세포에서 단백질 합성을 시작하는 가장 일반적인 경로이지만, 이 복합체의 스트레스 특이적 변이가 현재 나타나고 있습니다. 아가로스 연결 m⁷GTP(5' mRNA 캡 유사체)로 구성된 친화성 수지로 캡 결합 단백질을 정제하는 것은 번역 시작 조절과 관련된 요인을 식별하는 데 유용한 도구입니다. 저산소증(저산소)은 태아 발달 및 종양 진행 과정에서 발생하는 세포 스트레스로, 번역 조절에 크게 의존합니다. 또한, 최근에는 인간 성인 장기의 산소 함량이 낮아 세포가 일상적으로 배양되는 주변 공기보다 저산소증에 더 가까운 것으로 보고되었습니다. 저산소성 eIF4F 복합체(eIF4F^H)의 특성화가 진행됨에 따라 5' mRNA 캡을 통한 산소 의존성 번역 시작을 이해하는 데 대한 관심이 높아지고 있습니다. 최근에는 산소 가용성에 의해 조절되는 캡 결합 단백질을 분석하기 위해 인간 세포 배양 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 산소에 대한 노출을 제거하기 위해 저산소증 워크스테이션에서 세포 배양 및 용해를 수행한다는 점을 강조합니다. 액체 매체가 워크스테이션 내의 대기와 평형을 이룰 수 있도록 세포를 최소 24시간 동안 배양해야 합니다. 이러한 제한을 피하기 위해 더 짧은 시간이 필요한 경우 사전 컨디셔닝된 배지(탈산소화)를 세포에 추가할 수 있습니다. 특정 캡 결합 단백질은 두 번째 염기와의 상호 작용이 필요하거나 m⁷GTP를 가수분해할 수 있으므로 정제 과정에서 일부 캡 상호 작용체가 누락될 수 있습니다. 효소 저항성 캡 유사체에 연결된 아가로스-연관성은 이 프로토콜에서 대체될 수 있다. 이 방법을 통해 사용자는 캡 의존성 번역과 관련된 새로운 산소 조절 번역 인자를 식별할 수 있습니다.

서론

번역 컨트롤은 특히 세포 스트레스 ^일의 기간 동안, 유전자 발현의 전사 조절에 동등하게 중요한 단계로 부상하고있다. 번역 제어의 초점은 단백질 합성의 첫 번째 단계는 7 methylguanosine에 진핵 개시 인자 4E (eIF4E에)의 결합을 포함 개시의 속도 제한 단계 (m ⁷ GTP)의 mRNA ^2의 5 '캡에있다 . 의 eIF4E는 eIF4A, RNA 헬리 카제 및 eIF4G, 다른 번역 요인과 40S는 ³ 리보솜의 채용에 필요한 비계 단백질을 포함 eIF4F라는 이름의 삼량 체 복합체의 일부입니다. 정상적인 생리 조건에서의 mRNA의 대부분은 모자에 의존하는 메커니즘을 통해 번역되어 있지만, 세포 스트레스의 기간에 따라 인간의 mRNA의 약 10 %는 ^1,4 intiation 모자 독립적 인 번역을 허용 할 수있는 5 '의 UTRs가 포함되어 있습니다. 모자 종속 번역은 역사적으로 동의어있다OU에 eIF4F으로, 그러나, eIF4F의 스트레스 별 변화는 추세 주제 ^{5-8이되었다.}

다양한 세포 응력의 eIF4E 활성이 라파 마이신 복합체 1 (mTORC1)의 포유 동물 표적을 통해 억압되도록. 이러한....

프로토콜

세포 배양 1. 준비

1. 인간 세포의 시판 주식을 구입합니다.
   참고 :이 프로토콜은 HCT116의 대장 암 및 기본 인간의 신장 근위 관 상피 세포 (HRPTEC)를 사용합니다.
2. 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 7.5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)로 보충 / 높은 포도당 매체 HCT116의 문화를 500 ml의 배지를 확인합니다.
3. 5 % FBS, 1 % 상피 세포 성장 보충제로 보충 상피 세포 매체와 1 % P / S : 500 ml의 HRPTEC의 문화 매체합니다.
4. 140 mM의 NaCl을, 3 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 ₂ HPO _4, 15 mM의 KH ₂ PO ₄ : 1 배 인산염 완충 식염수 (PBS)의 500 ml의를 준비합니다. 7.4으로 산도를 조정하고 121 ℃에서 40 분간 고압 증기 멸균에 의해 소독.

세포 배양 2. 개시

1. 조심스럽게 t을 방해하지 않고 80-90% 합류 요리에서 매체를 대기음그는 세포.
2. 배양 접시 당 1X PBS의 나누어지는 3 ~....

결과

M이 ⁷ GTP 선호도 열에서의 eIF4E 및 eIF4E2의 산소에 반응하여 캡 결합 능력 분석

1 및도 2는 두 사람의 세포주에서 산소 변동에 대한 응답으로 두 가지 주요 캡 - 결합 단백질의 전형적인 m ⁷ GTP 선호도 정화의 서양 말을 나타냅니다 F의 igure 1과 대장 암의 주요 인간 신장 근위 관 상피 세포 (HRPTEC () 그림 2에서 HCT116). 세포는 액체 매질에 용해 된 산소는 저산소증 스테이션 내의 공기로 평형화했다되도록 24 시간 동안 지시 된 산소 가용성 유지된다. 레인 입력 (IN)이 ⁷ GTP 결합 된 아가 로스 비드 캡 - 결합 단백질을 포착하기 위해 .......

토론

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포 캡 결합 단백질의 분석은 신규 산소 조절 번역 개시 인자의 확인을 허용 할 수있다. mRNA의 캡 또는 다른 관련 단백질의 5 '캡 이러한 요소의 선호도가 ⁷ m 그들의 관계의 강도에 의해 측정 될 수 아가 로스 비드 GTP 결합. 이 기술의 한 가지주의는 단백질 분해 이후의 캡 결합 전위를 측정하지만,이 단백질 - 단백질 상호 작용과 번역 후 변형 (PTMS)을 유지하는 비 - 변성 조건 하에서 수행된다는 것이다. 여러 단백질 - 단백질 상호 작용는 5 '캡에 eIF4E를 가족의 결합을 중재. 4E-BP는 결합 및 eIF4G과의 상호 작용을 차단하고 ³⁸ 복잡한 사전 개시 43S의 채용을 방지하여의 eIF4E을 억압. 의 eIF4E / 4E-BP 단지는 성적 증명서에서 모든 개시를 차단, 5 'mRNA의 캡에 결합 남아 있고, 수m ⁷ GTP 친 화성 컬럼에서의 eIF4E 억제 마커로 사용 될 수있다. 반대로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
&감마;-아미노페닐-m7GTP 아가로스 C10 결합 비드	Jena Bioscience	AC-1555	아가로스 연결 m7GTP
100mm 배양 접시	Corning	877222	10cm 배양 접시
150mm 배양 접시	Thermofisher	130183	15cm 배양 접시
AEBSF 염산염	ACROS 유기물	A0356829	AEBSF
아가로스 비즈	Jena Bioscience	AC-0015	아가로스 비드 제어
브로모페놀 블루	피셔	BP112-25	SDS-PAGE 로딩 버퍼의 구성 요소
1.5ml 원심분리기 튜브	FroggaBio	1210-00S	소량 원심분리기에 사용
15ml 원추형 원심분리기 튜브	Fisher	1495970C	일차 세포 배양에 사용
정의된 트립신 억제제	Fisher	R007100	DTI
Dithiothreitol	Fisher	BP172-25	DTT
상피 세포 배지 (전체 키트)	ScienCell	4101	혈청 및 성장 인자 보충제 포함)
글리세롤	Fisher	BP229-1	SDS-PAGE 로딩 버퍼 구성 요소
100 mM 구아노신 5'- 트리포스페이트, 1 ml	Jena Bioscience	272076-0251M	GTP
HCT116 결장직장 암종	ATCC	CCL-247	인간 암 세포주
인간 신장 근위 세뇨관 상피 세포	ATCC	PCS-400-010	HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose	GE Life Sciences	SH30022.01	인간 세포 배양을 위한 표준 배지
Hyclone 페니실린-스트렙토마이신 용액	GE Life Sciences	SV30010	DMEM
H35 HypOxystation	최면	산소 N/A	저산소증 워크스테이션
Igepal CA-630	MP Biomedicals	2198596	용해 완충액의 세제 성분
인산일칼륨	Fisher	P288-500	KH2PO4
염화칼륨	Fisher	P217-500	KCl
염화마그네슘	Fisher	M33-500	MgCl2
Sodium chloride	Fisher	BP358-10	NaCl
불화나트륨	Fisher	5299-100	NaF (lysis buffer의 phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate	Fisher	5369-500	Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum	Seradigm	1500-500	FBS
프로테아제 억제제 칵테일 (100x)	세포 신호	58715	용해 완충액의 구성 요소
도데실 황산나트륨	Fisher	BP166-100	SDS
오르토바나데이트 나트륨	시그마	56508	Na3VO4
Tris Base	Fisher	BP152-5	완충액
0.05% 트립신-EDTA (1x)	Life Technologies	2500-067	트립신은 부착 세포를 분리하는 데 사용됩니다

의 항생제 성분의 구성 요소.