후 성적인 요소는 유전자 발현을 조절 하 고 B 세포 기능을 조절 하는 유전자 프로그램으로 작용할 수 있습니다. 결합 하 여 체 외에서 B 세포 자극, qRT-PCR, 및 높은 처리량 예측에 관한 시퀀스 및 mRNA 순서 접근, 우리 B 세포에서 miRNA 및 유전자 표현의 epigenetic 변조를 분석할 수 있습니다.
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방법 논문
MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조
이 논문에서
요약
초록
항 체 응답은 신체적인 hypermutation (SHM), 클래스-스위치 DNA 재결합 (CSR), 및 플라즈마 세포 분화를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 B 세포-기본 프로세스를 통해 수행 됩니다. 최근 몇 년 동안, 후 성적인 수정 또는 히스톤 deacetylation 및 microRNAs (miRNAs) 같은 요인 보였다 epigenetic 요인의 부전으로 이어질 발견 되었습니다 동안 모양 항 체 반응, B-세포 유전 프로그램 상호 작용 autoantibody 응답입니다. Epigenetic 변조기에 B 세포에 게놈 넓은 miRNA 및 mRNA 표정 분석 하는 것이 B 세포 기능과 항 체 반응의 후 성적인 규정을 이해 하는 데 중요 합니다. CSR 및 플라스마 세포 감 별 법을 B 세포를 유도, 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제 (HDIs)와이 B 세포 치료 및 mRNA와 예측에 관한 식 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 직접 보완 DNA (cDNA) 시퀀스를 사용 하 여 다음-세대 mRNA 시퀀싱 (mRNA-seq) 미르-seq 기술과 시퀀싱의 게놈, 그리고 양이 많은 반전 녹음 방송 (qRT)를 읽고 분석-PCR. 이러한 방법으로 우리는 정의 B 세포는 CSR 및 플라스마 세포 감 별 법을 유도, HDI, 후 레 귤 레이 터, 선택적으로 miRNA 및 mRNA 표정 변조 CSR 및 플라즈마 세포 분화를 변경.
서론
후 성적인 부호 또는 DNA 메 틸 화, 히스톤 posttranslational 수정, 및 비 코딩 RNAs (microRNAs 포함) 같은 요인 유전자 식1을 변경 하 여 세포 기능을 조절. 후 성적인 수정 B 림프 구 기능, 면역 글로불린 종류 스위치 DNA 재결합 (CSR), 신체적인 hypermutation (SHM), 및 메모리 B 세포 또는 플라스마 세포, 항 체 및 autoantibody 변조 함으로써 차별화 등 규제 응답2,3. CSR과 SHM 비판적으로 높은 T-종속 및 T-독립 항4B 세포에서 유도 된 활성화 유도 cytidine deaminase (원조, Aicda로 인코딩된), 필요 합니다. 클래스-전환/hypermutated B 셀 추가 1 (Blimp1, Prdm1로 인코딩된)5패션 비판적으로 유도 하는 B 림프 구 성숙 단백질에 의존에 항 체의 대량 분 비 플라즈마 세포로 분화. 탈 항 체/autoantibody 반응, 알레르기 반응 또는 면역1,
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프로토콜
프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 샌안토니오에서 건강 과학 센터 택 사스 대학 동물 보호 지침을 따릅니다.
1. 자극의 마우스 B 세포 CSR, 플라즈마 세포 분화 및 HDI 처리
- 비장 세포 현 탁 액의 준비
참고: 마우스를 제외 하 고 층 류 두건에 모든 단계를 수행 안락사와 해 부입니다.- 는 특정 병원 체 무료 C57BL/6J CO 2 흡입에 의해 (나이 8-12 주) 마우스 Euthanize.
- 위 복 부와 해 보드에 마우스를 하다. 피하 주사 바늘 1.5-18-게이지, 마우스의 모든 4 개 피트를 핀.
- 70% 에탄올에 젖은 잎사귀를 사용 하 여 피부를 소독.
- 압력가 수술 도구 (집게와 해가 위) 바로 시각화 (간 바로 아래 복 부의 왼쪽)에 비장 하 흉 곽 아래 피부를 통해 잘라의 1 세트를 사용 하 여.
- 다른 살 균 겸 자 사용 하 고 집게로 비장을 부드럽게 클램핑 및 해 부와 모든 연결 조직에서 절단 하 여 복 부의 더 큰 곡률 아래 거짓말 비장 추출 하가 위가 위. 모든 연결 조직을 제거 있는지 확인 하십시오.
- 1.5 mL mi....
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결과
LPS와 함께 배치 하는 B 세포를 정화 우리의 프로토콜을 사용 하 여 (3 µ g/mL) 및 IL-4 (5 ng/mL)에 96 h IgG1에 CSR의 30-40% 및 플라즈마 세포 분화의 ~ 10%를 일으킬 수 있다. HDI (500µM VPA) 치료, 후에 IgG1 CSR 감소 10-20%, 플라스마 세포 감 별 법 ~ 2%로 감소 하는 동안 (그림 1). CSR의 HDI 중재 금지 추가 후 재결합 Iμ Cγ1 및 성숙한 VHDJH의 감소 수에 의해 확인 되었다-완료 된 CSR의 Cγ1 증명서. QRT-PCR로 측정 된, CSR/SHM, Prdm1 및 Xbp1, 플라즈마 세포 차별화에 대 한 중요 한 중요 Aicda, 표현의 VPA (그림 2)에 의해 저해를 표시 했다.
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토론
이 프로토콜 B 셀 클래스 스위칭 및 플라즈마 세포 분화; 유도에 포괄적인 접근을 제공 합니다. epigenetic 변조기, 즉 HDI;에 의해 그들의 영향을 분석 하 그리고이 세포에서 mRNA와 미르 식에 HDI의 효과 검색 합니다. 이러한 방법의 대부분은 또한 인간 B 세포 기능 및 mRNA/miRNA 표정에 epigenetic 요인의 영향을 분석 하 사용할 수 있습니다. QRT-PCR 및 mRNA-seq/미르-seq 접근 또한 HDIs 같은 후 변조기로 치료 하는 쥐에서 분리 하는 B 세포를 분석을 사용할 수 있습니다.
Epigenetic 조절 세포 증식, 생존, CSR 및 플라즈마 세포 분화에 영향을 미칠 수 있는 등 많은 다른 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 세포 증식, 생존, 그리고 HDI 치료 없이 B 세포의 세포 주기를 분석 합니다. HDI에 의해 mRNA와 미르 식 또는 qRT-PCR에 의해 다른 후 레 귤 레이 터의 변조를 분석 하기 위한 과제 중.......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 교부 금 AI 105813 및 인공 지능 079705 (PC)에 의해 지원 되었다, Lupus 연구 대상 식별 Lupus 그랜트 ALR 295955 (PC)에 대 한 얼라이언스와 관절염 국립 연구 재단 연구 부여 (HZ). TS는 의학 샌 안토니오 Xiangya UT 학교 학생 방문 프로그램의 맥락에서 소아과 의료 센터, 두 번째 Xiangya 병원, 중앙 남쪽 대학, 창사, 중국에 의해 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 마우스 | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (크기: 6 x 500mL; L-글루타민 포함) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone 항생제 항진균 용액 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-메르캅토에탄올 | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| 팔콘 세포 여과기 | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan 블루 스테인 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK 용해 버퍼 | 피셔 사이언티픽 | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep 자석 | 줄기 세포 기술 | 18000 | |
| Falcon 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브(캡 포함 | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep 마우스 B 세포 분리 키트 | 줄기 세포 기술 | 19854 | |
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| PE-Cy7 B220 항체 | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 anti-mouse | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µ g | Biolegend | 406610 | |
| FITC 안티 마우스 IgM 항체 | Biolegend | 406506 | |
| FITC 안티 마우스/인간 CD45R/B220 항체 | Biolegend | 103206 | |
| PE 안티 인간/마우스 CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
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| LPS 25mg (대장균 055:B5의 지질다당) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| 재조합 마우스 IL-4 (캐리어 프리) | BioLegend | 574302 (크기: 10 ug) | |
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| 10 mL 혈청학적 피펫 팁 | Fisher | Scientific 89130-898 | |
| 5 mL 혈청학적 피펫 팁 | Fisher Scientific | 898130-896 | |
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| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
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| S200 집속 초음파 발생기 | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | 벡크만 쿨터(Beckman Coulter | ) A288267 | |
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| HiSeq 2000 게놈 시퀀서 | 일루미나 | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA 라이브러리 준비 키트 v2 | 일루미나 | RS-122-2001 | |
| TruSeq 소형 RNA 라이브러리 준비 키트 | 일루미나 | RS-200-0012 | |
| NEXTflex 일루미나 소형 RNA 염기서열분석 키트 v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | 애질런트 | G2964AA |
참고문헌
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P.
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