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방법 논문

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

10.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55160

⸱

2017년 1월 6일

 , 
1Department of Cell and Development Biology, Vanderbilt University Medical School

이 논문에서

요약

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

초록

큰 포유 동물 pancreata에서 관류 기반의 섬 - 격리 프로토콜은 잘 확립되어있다. 이러한 프로토콜은 쉽게 인해 준비 콜라겐 주입 및 이후의 조직 관류를 허용 췌관의 큰 크기로 많은 실험실에서 실시하고 있습니다. 관류 쉽게 작은 pancreata에서 얻을 수 없기 때문에 반대로, 작은 pancreata에서 섬 격리는, 신생아 쥐처럼, 도전이다. 여기에서 우리는 시각적 인 도움으로 새로 태어난 쥐에서 독도의 상당한 숫자를 복구 상세한 간단한 절차를 설명합니다. 갓 해부 전체 pancreata는 마이크로 원심 튜브에서 37 ° C에서 행크스 균형 염 용액 (HBSS)에 용해하고, 0.5 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 IV로 분해 하였다. 튜브는 조직의 분산을 돕기 위해 정기적으로 도청했다. 조직의 대부분이 1mm 주위에 작은 클러스터에 분산시킨 경우, 용 해물을 10 % 소 태아 혈청 (FBS)로 배양 배지와 서너 번 세척 하였다. 섬 클러스터,인식 선포 조직의 결여, 다음 입체경을 해부에서 복구 할 수 있습니다. 새로 태어난 마우스의 췌장 당 대형 섬에 80 소형 -이 방법은 (20)를 복구합니다. 이 섬은 인슐린 분비, 유전자 발현, 문화를 포함한 대부분의 생각할 수있는 다운 스트림 분석에 적합하다. 인슐린 분비 분석의 예는 분리 프로세스를 검증하기 위해 제공된다. 유전 적 배경과 소화의 정도는 수익률을 결정하는 가장 큰 요인이다. 이 내분비 - 외분비 격리 에이즈로 높은 활성 갓 만든 콜라겐 용액은 바람직하다. 세척의 모든 솔루션 및 소 태아 혈청에있는 양이온의 존재 [칼슘 (Ca 2+)과 마그네슘 (Mg를 2+)] / 따기 매체는 적절한 무결성 섬의 좋은 수율이 필요하다. 좋은 대조 및 확대와 해부 범위도 도움이 될 것입니다.

서론

순수한 췌장섬을 분리하는 것은 베타 세포의 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)를 분석하고 사체 기증자로부터 섬을 이식하는 데 필수적입니다 1-3. 또한 섬세포에서 내분비 유전자 발현을 확립할 필요가 있다 4, 5. 이를 위해 큰 췌장섬을 큰 췌장섬으로부터 분리할 수 있도록 상세한 프로토콜이 수립되었습니다(6 및 그 안에 있는 참고 문헌). 이러한 방법은 효소 관류를 기반으로 하여 섬 조직에서 acinar를 해리하고 gradient separation 및 hand picking과 결합합니다. 따라서 큰 췌장에서 섬을 분리하는 것은 대부분의 실험실에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 반면에, 너무 작아서 관류할 수 없는 췌장에서 섬을 분리할 수 있는 상세한 단계별 프로토콜은 없습니다.

신생아 섬의 유전자 발현과 기능을 연구하는 것은 중요합니다. 신생아 섬은 인슐린 분비 및 증식 능력에서 성인과 다른 특성을 가지고 있습니다 7, 8. 그러나 새로 태어난 동물, 특히 쥐로부터 섬을 분리하는 것은 새로 태어난 췌장의 크기가 작기 때문에 어렵습니다. 이 크기는 췌관을 통해 콜라겐 분해 효소가 주입 될 때 일반적인 관류 과정을 방지합니다. 실제로, 몇몇 논문에서는 효소 또는 비효소 보조 분리 절차 7, 9, 10과 같은 연구를 발표했습니다. 그러나 시각 자료를 사용한 섬 분리 과정에 대한 자세한 설명은 7, 9가 부족하여 대부분의 연구자들이 유사한 연구를 수행하는 데 어려움을 겪고 있습니다.

우리는 신생아 마우스에서 고품질 섬을 생산하는 몇 가지 다른 조건을 탐구했습니다. 여기에서는 연구자들이 섬 격리 과정의 주요 세부 사항을 배우는 데 도움이 될 것으로 기대되는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생후 2주령까지 쥐의 췌장에 적용할 수 있으며, 그 후에는 일상적인 섬 격리를 위해 관류를 수행할 수 있습니다. Islet은 인슐린 분비 및 유전자 발현 분석에 직접 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

동물 사용이 프로토콜 M에 규정 된 절차를 다음 / 구에 대한 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 / (181) 11. CD1 또는 CBA / BL6 마우스는 상용 공급 업체에서 구입 및 신생아 쥐를 얻기 위해 밴더빌트 동물 시설에서 교차했다.

마우스 1. 준비, 재고 솔루션 및 장비

  1. 마우스 크로스의 경우 : 마우스 십자가를 설정하고 실험 계획을 돕기 위해 연결 날짜를 기록합니다. CD1 마우스는 보통 짝짓기 후 하루 (19)의 주위에 출산을 제공합니다. 사용 CD1 또는 CBA / BL6은 각각 CD1 또는 CBA / BL6 신생아를 얻기 위해 십자가. 두 선 사이의 Intercrosses는 CD1의 여성과 CBA / BL6 남성을 사용한다.
  2. 콜라게나 주식에 대한 : 고정밀 밸런스 200 mg의 콜라겐 유형 IV 무게. 50 ML의 원심 분리기 튜브에 전송합니다. 칼슘 40 ㎖의 HBSS에 용해 2+ / 마그네슘 2+ (각각 1.26와 0.5 밀리미터는) 5 ㎎ / ㎖의 원액을 확인합니다.
    1. 에 콜라게나 허용부드러운 흔들림과 함께 ~ 30 분 동안 용해. 나누어지는 및 1 년 이상 활성 상태를 유지 재고 한 -20 ° C에 냉동 솔루션을 유지.
  3. 해부 및 섬 따기위한 핀셋, 가위, 및 P20 팁 몇 쌍을 소독하기 위해 압력솥.
  4. 1 M 포도당 주식에 대한 : 50 mL의 원심 분리기 튜브에 9g 포도당 무게 포도당을 용해 50 mL의 RPMI에게 1640 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사용할 때까지 4 ° C에 보관하지,하지만 6 개월 이상.

2. 작업 솔루션

참고 : 섬 분리의 날, 다음과 같은 시약을 준비합니다.

  1. 콜라게나 제 타입 IV 가공 솔루션 : 해동 얼음에 콜라게나 주식을 희석. 각각 1.7 mL의 미세 원심 분리 관에 0.15 mL의 주식을 분배. 칼슘 / 마그네슘 2+와 1.35 ㎖의 HBSS를 추가합니다. 튜브 5 번 반전. 15 분 동안 얼음에 둡니다.
    1. 미세 원심에서 3 분 동안 고속으로 회전. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 사용할 때까지 얼음에 남겨주세요. 불용성 이물질와 튜브를 폐기하십시오.
  2. 전체 RPMI 1640 미디어 : 500 ㎖의 RPMI 1640 미디어에 2.5 mL의 1 M 포도당, FBS 불 활성화 50ml의 열, 5 ㎖의 100 배 펜 연쇄상 구균 주식을 추가합니다. 사용할 때까지 얼음에 둡니다.

3. 췌장의 분리 및 소화

  1. 승인 된 프로토콜에 따라 잘린 다음 이소 플루 란과 신생아를 안락사.
  2. 배꼽이 위를 향와 마우스를 놓습니다. 살균 70 % 에탄올로 스프레이.
  3. 핀셋으로 배꼽 피부를 들어 올려 흉곽의 생식기 영역에서 가위와 정중선을 따라 길이 방향으로 피부와 근육 층을 잘라. 이것은 모든 내부 장기를 노출 복강을 엽니 다.
  4. 핀셋으로 100cm 접시에 모든 내부 장기를 전송합니다. 위장과 비장과 십이지장 (11)에 달라 붙는 복부 부분에 달라 붙는 지느러미 부분과 분산 - 장기 인 췌장을 찾습니다.
  5. 장기 잠수함하기 위해 접시에 HBSS를 추가합니다. 용액에서, 췌장 조직이 더 이상 십이지장, 위, 비장에 집착하지 않는다. 이 때문에 전형적인 화이트 색상의 해부 범위에서 쉽게 인식 할 수있다. HBSS로 새로운 60mm 요리에 떨어져 주변 조직 및 전송에서 췌장 조직을 박리 핀셋을 사용합니다.
  6. 어떤 차원에서 5mm보다 작은 조각으로 가위 각각의 췌장을 잘라. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 최대 5 pancreata는 (P7 미만) 하나의 튜브에 소화 할 수있다. P8-P16 마우스의 경우, 췌장 당 하나의 튜브를 사용합니다.
  7. 각각의 튜브에 1 ML의 콜라게나 작업 용액 (각 P1-P7 췌장 0.2 mL 씩 P8-P16 췌장 0.5 mL로 사용합니다.) - 0.5를 추가합니다. 최대 15 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 튜브를 남겨주세요. 튜브 두 번 모든 분을 반전.
  8. ~ 5 분 후, 췌장 조직의 분해 상태를 모니터링하기 위해 상기 튜브를 탭. 췌장의 대부분까지 소화 과정을 계속조직은 직경 <2mm와 같은 파편 세포 클러스터를 나타납니다. 해물 정상 선방 세포자가 분해에 의한 흐림을 나타납니다.

4. 해물 세척

  1. 미세 원심에서 10 초 동안 500 XG에 해물 스핀. P1,000의 pipetman에 뜨는 층을 제거합니다. 상층 액은 혼탁하지만 세포 클러스터없는 나타납니다. 빠르게 인해 일부 끈적 DNA의 존재에 맨 아래에있는 조직 조각을 멀리 대기음 수있는 구토물이기도를 사용하지 마십시오.
  2. 1 mL의 RPMI 1640 전체 미디어를 추가합니다. 조각난 해물을 재현 탁 부드럽게 튜브를 누릅니다. 최대 반전 10 배 아래로. 단계를 반복 4.1.
  3. 단계를 반복 4.2 두 번 이상 또는 상등액을 분명히 나타날 때까지. 1 mL의 완전한 RPMI 1640 배지에서 세척 췌장 조각을 다시 일시 중지합니다.

5. 작은 섬 격리

참고 : pancreata의 작은 번호는 직접 손으로 따기 아래 (5.1) 섬의 ISOL 사용할 수 있습니다ATION. pancreata 많은 경우 (> 6), 5.2에서 설명하는 방법이 바람직하다.

  1. 직접 손으로 따기 :
    1. 60 밀리미터 접시 단계 4.3에서 해물을 전송합니다. 5 ㎖ 전체 RPMI 1640 미디어를 추가합니다. 해부 현미경으로 가져옵니다.
    2. 현미경의 시야 조명을 설정합니다. 빛의 세기 최대 전력의 ~ 50 %를 조정합니다. 이 상태에서, 독도는 선포 세포와 같은 어두운 불규칙한 모양의 클러스터 반면 (그림 1A)로 약간 핑크 클러스터를 나타납니다. ~ 50X (목적의 힘과 눈 조각을 결합)의 확대가 가시화 섬의 가장 좋은 방법 및 따기위한 동시에 피펫 팁 오프닝을 제공하는 것이 좋습니다.
    3. 선포 클러스터를 피하면서 P20 피펫 팁과 섬을 선택합니다. 분배 RPMI 전체 미디어 (그림 1B)와 새로운 60mm 요리에 분수를 섬이 풍부한.
    4. 두 번 더 핸드 피킹 과정을 반복합니다. 새로운 60 순수한 독도를 남겨4 mL의 전체 RPMI 미디어 (그림 1C)와 mm 접시.
  2. 그라데이션 원심 분리 :
    1. 1.077 g / ㎖의 밀도로 2 ML의 polysucrose 나트륨 diatrizoate 미리로드 된 15 mL의 원심 분리기 튜브를 준비합니다. 사용할 때까지 얼음 튜브를 남겨주세요.
    2. 파스퇴르 피펫으로 polysucrose 나트륨 diatrizoate 솔루션의 상단에 단계 4.3에서 정지를 전송합니다. 바닥 층을 방해하지 마십시오. 최대 새로 태어난 10 2 pancreata P17에서 조직은 각각 15 mL의 튜브에로드 할 수 있습니다.
    3. 4 ° C에서 15 분 동안 스윙 로터에 ~ 600 XG에 튜브를 스핀. 브레이크 오프 설정을 사용합니다.
    4. 원심 분리 후, 새로운 15ml를 튜브에 미디어 및 계면 층 (이상적인 동작 조건에서 아일렛 원심 분리 후 polysucrose 문화 매체 사이의 계면에 위치 될 것이라는 점에 유의) 옮긴다. 10 mL의 미디어를 추가 부드럽게 잘 섞는다.
    5. 작은 섬이 풍부한 부분을 스핀 다운5 분 300 XG에. 세척 용지를 제거합니다. 전체 RPMI 매체와 세척을 한 번 더 반복합니다. 대부분 섬 및 덕트 (그림 1D)를 포함 4 mL의 미디어에의를 Resuspend 펠릿.
    6. 5.1 절에 설명 된대로 독도를 손으로 선택합니다.

격리 된 독도 6. 국제 대학원 분석 실험

  1. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간 동안 전체 RPMI 미디어의 단계 5.1.4에서 독도를 품어.
  2. 해부 현미경 RPMI을 제거하는 피펫을 사용합니다. 플레이트 (3)에 2.8 mM의 포도당과 3 mL의 KRB 솔루션을 추가합니다. 독도를 씻어 10 회 소용돌이 친다. KRB 솔루션을 제거합니다.
    1. 한 번 세척 과정을 반복합니다. 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ KRB 용액 독도 부화.
  3. 12 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 분취 KRB. 인큐베이터에서 37 ° C로 KRB 재고 및 플레이트를 사전 따뜻하게.
  4. 6.2에서와 같이 미리 예열 KRB 두 번 독도를 씻으십시오. 트랜스FER 미리 예열 플레이트의 각 웰에 10 아일렛. 37 ° C 배양기에서 품어.
  5. 45 분 후, 상층 액 50 μL를 철회. 이것은 기초 포도당에서 분비되는 인슐린 솔루션이 포함되어 있습니다.
  6. 32 μL 500 mM의 포도당을 추가합니다. 솔루션을 섞어 판 20 회 소용돌이 친다. 37 ° C 배양기에서 품어. 판을 한 번에 5 시간마다 5 분 소용돌이 친다.
  7. 45 분 후, 50 μL 상층 액을 철회. 이 높은 포도당에서 분비되는 인슐린이다.
  8. 1.5 ㎖의 튜브에 모든 섬을 전송합니다. 30 분 동안 -20 ℃에서 동결. 실온에서 5 분 동안 해동. 냉동과 해동 과정을 반복합니다.
  9. 20 mM의 염산 0.5 mL의 70 % 에탄올을 추가합니다. 하룻밤 둡니다. 이 섬에 남아 인슐린이다.
  10. 인슐린 수치를 분석하기 위해 기존의 ELISA를 사용하여 이전에 3 설명했다.

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결과

각각의 작은 마우스의 췌장에서 아일렛 80 - 최적 조건에서 제시된 방법 (20)을 수득 할 수있다. 이 번호는 마우스의 유전 적 배경, 나이에 의존하고, 섬의 크기를 회복한다. 일반적으로 사용되는 가운데, CD1가에서 자란와 C57BL / 6J 순종 마우스 CD1 및 C57BL / 6 또는 상업적 B6CBAF1 사이의 잡종보다 작은 크기의 작은 섬을 생산 / J 마우스는 않습니다. 일반적으로 따기 직접 손으로 인해 외분비 조직 (그림 1A-C)와 혼합 할 때 인정하기 어려울 수 있습니다 작은 섬의 배제에 독도의 적은 수의 가능성을 주었다. 그라데이션 원심 분리 믹스 (그림 1D)의 작은 섬을 포함하여 많은 섬을 얻을 수 있습니다. 출산 후 계속 섬의 증식에서 예상대로 이전 마우스는 또한, 더 큰 섬을 생산하고 있습니다. 흥미롭게도, 회수 된 아일렛 수 직접 췌장 크기와 상관되지 않는다 : CD1 생쥐는 보통...

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토론

여기, 우리는 기존의 관류 너무 작은 pancreata에서 섬 분리에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 등과 베타 세포의 정제, 유전자 발현 분석, 췌장 베타 세포의 성숙, 증식, 세포 스트레스 반응, 세포 생존, 대사 및 작용 GSIS 유지, 모든 섬 기반 연구 준비 아일렛을 수득 할 것으로 예상된다. 이것은 우리의 지식, 신생아 쥐에서 섬 격리을 수행하는 새로운 연구를 안내하는 최초의 상세한 영상 프로토콜의 최선이 될 것입니다. 이 시각 보좌관하지 않고, 광범위한 시행 착오가 작은 pancreata에서 성공적인 췌도 분리를 달성하기 위해 대부분의 연구자 예상된다.

단계 3.6에 설명 된대로 성공적으로 섬 격리를위한 가장 중요한 요소는 췌장 소화의 적절한 정도 - 3.8. 일반적으로 이해하고 과잉 소화 모두 섬 수율을 줄일 수 있습니다. 오버 소화 더 타협 섬 아키텍처, 막 '그들은 기능 분석을위한 적합하지 말이지. 가장 분해 결과를 달성하기 위해,...

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공개 사항

저자는 설명된 작업에 대해 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 NIDDK(GG의 경우 DK065949)의 보조금으로 지원되었습니다. 원고를 읽어주신 Brenda M. Jarvis 박사와 Jeff Duryea Jr.에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Collagenase Type IVSigma Aldrich, St Louis, MOC5138
Ca2+/Mg2+Mediatech/Cellgro, Manassas, VAMT21020CVCa2+/Mg2+가 있는 HBSS를 얻은 경우 CaCl2 및 MgSO4를 추가할 수 있습니다. 각각 1.26 및 0.5 mM. 
RPMI 1640 포도당 없음Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA11879-020포도당은 이후의 섬 사용을 방해하지 않도록 특정 수준으로 첨가해야 합니다. 
포도시그마 Aldrich, St Louis, MOG-7021 
폴리수크로오스 및 디아트리조산 나트륨 용액Sigma Aldrich, St Louis, MOHistopaque-10771
스테레오스코프Carl-Zeiss, Oberkochen, GermanyStemi2000
스테레오스코프Leica, Wetzlar, GermanyLeica M165
MicrocentrifugeEppendorf, Hauppauge, NYCentrifuge 5417C
CentrifugeEppendorf, Hauppauge, NYCentrifuge 5810R
15-mL 원심분리기 튜브VWR, Radnor, PA89039-666
50-mL 원심분리기 튜브VWR, Radnor, PA89039-658
정밀 저울VWR, Radnor, PAVWR-225AC
마이크로fuge 튜브VWR, Radnor, PA87003-294
Pipetman P1000Fisher Scientific,  Waltham, MAF123602
Pipetman P20Fisher Scientific,  Waltham, MAF123600
100 x 15 mm 접시VWR, Radnor, PA25384-088
60 x 15 mm 접시VWR, Radnor, PA25384-168
12웰 플레이트VWR, Radnor, PA665-180
ScissorFine Scientific Tools, Foster City, CA14080-11
핀셋Fine Scientific Tools, Foster City, CA5708-5
CD1 마우스Charles River Laboratories, Wilminton, MA CD-1
C57BL/6J잭슨 연구소, 파밍턴, 코네티컷 C57BL/6J
B6CBAF1/J잭슨 연구소, 파밍턴, 코네티컷 B6CBAF1/J
당

참고문헌

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