Method Article

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출 현장에서 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

DOI:

10.3791/55162

⸱

January 11th, 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 전신 조사에 노출된 후 마우스의 골 수 세포에서 염색체 간 안정 이상을 식별하는 데 있어 다중 형광 현장 혼성화(mFISH) 및 스펙트럼 핵형 분석(SKY)의 유용성을 설명합니다.

Abstract

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이온화 방사선(IR)은 수많은 안정 및 불안정한 염색체 이상을 유발합니다. 염색체 형태가 실질적으로 손상된 불안정한 이상(unstable aberrations)은 기존의 염색체 염색 기법으로 쉽게 식별할 수 있습니다. 그러나 염색체 형태학의 상당한 변형 없이 유전 물질의 교환 또는 전좌를 포함하는 안정적인 수차를 검출하려면 형광 제자리(in situ)로 널리 알려진 염색체 페인팅 기술인 형광 표지된 DNA 프로브의 현장 혼성화에 의존하는 정교한 염색체 페인팅 기술이 필요합니다 혼성화(FISH). FISH 프로브는 전체 염색체 또는 염색체의 정확한 하위 영역에 특이적일 수 있습니다. 이 방법은 안정적인 수차의 시각화를 가능하게 할 뿐만 아니라 특정 수차 형성과 관련된 염색체 또는 특정 DNA 염기서열을 검출할 수도 있습니다. 세포 유전학에서는 다양한 염색체 페인팅 기술을 사용할 수 있습니다. 여기에서는 전신 조사에 노출된 후 마우스의 골수 세포에서 형성되는 염색체 간 안정 이상을 식별하기 위해 mFISH(Multiple Fluorescence in situ hybridization)와 SKY(Spectral Karyotyping)라는 두 가지 고감도 방법에 대해 논의합니다. 두 기술 모두 형광 표지된 DNA 프로브에 의존하지만 검출 방법과 형광 신호의 이미지 획득 과정은 다릅니다. 이 두 가지 기술은 방사선 생물학, 암 세포 유전학, 후향적 방사선 생물선량 측정, 임상 세포 유전학, 진화 세포 유전학 및 비교 세포 유전학과 같은 다양한 연구 분야에서 사용되어 왔습니다.

Introduction

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방사선 유도 염색체 간 안정 이상을 식별하는 가장 신뢰할 수 있는 두 가지 방법은 두 개 이상의 염색체를 동시에 페인팅할 수 있는 다중 형광 제자리 혼성화(mFISH)와 게놈의 각 상동 염색체 쌍에 고유한 색상을 부여하는 스펙트럼 핵형 분석(SKY)입니다. 불안정한 수차와 달리, 안정된 수차는 본질적으로 지속적이며 방사선 조사된 집단에서 여러 세대에 걸쳐 전파될 수있으며1, 방사선 유발 세포유전학적 병변2의 중요한 분자 "서명"으로간주됩니다. 다양한 그룹의 연구에 따르면 안정적인 수차는 암을 포함한 여러 질병의 발병 및 발병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다3. 염색체 페인팅(분자 세포 유전학이라고도 함) 시대 이전에는 기존의 G-밴딩 기술이 안정적인 염색체 이상을 감지하는 유일한 방법이었습니다. 그러나 염색체 밴딩은 해상도가 제한되고, 재현성이 불확실하며, 노동 집약적인 절차이고, 신뢰할 수 있는 데이터 해석을 위해 고도로 숙련되고 경험이 풍부한 세포유전학자가 필요하기 때문에 세포유전학자에게 도전이 됩니다4. 더욱이, 고전적인 밴딩 기법은 방사선 손상의 일반적인 결과인 두 개 이상의 염색체 간에 분포된 세 개 이상의 단절의 상호 작용을 포함하는 복잡한 염색체 재배열을 감지할 수 없습니다. 복잡한 ....

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Protocol

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모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 수행 하였다. 동물 프로토콜은 의료 과학에 대한 아칸소 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 신선한 공기와 표준 설치류 음식과 물을 무료로 이용할 수의 15 시간당 사이클 - 모든 동물은 10 20 ± 2 ℃에서 표준 에어컨 동물 시설에서 보관 하였다. 도착 후, 마우스 1 주일 동안 격리에서 개최하고 인증 설치류 식사를 제공했다.

1.Radiation 노출 및 중기 세포의 생체 체포에

  1. 노출 조사 챔버에서 2 Gy의 전신 방사선에 마우스를 해제는-마취. 조사 기간 동안, 통풍이 잘 유지 챔버의 장소 마우스는 자유롭게 이동하고 균일 한 용량을받지 못한 확인합니다.
  2. 0.05 % 콜히친 용액 100 μL를 주입 (c칼슘 및 마그네슘없는 PBS에 용해 olchicine 분말) 복강 내 1 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용. 어떤 기관에 직접 분사하지 마십시오.
  3. 골수 세포 수확하기 전에 2 시간 동안 케이지에 동물을 둡니다. 통증이나 고통의 흔적에 대한 동물을 관찰한다.
    4. <....

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Results

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전신 방사선 조사 된 마우스의 골수 세포에서 다수의 염색체 수차를 유도한다. 현재 프로토콜은 방사선 조사 후 골수 세포의 생체 유사 분열 정지를 위해 최적화되고, 밀도 구배 원심 분리, 중기 세포 퍼짐의 제조 및 후속 의해 조사 생쥐 골수 단핵 세포의 분리의 뒷다리 골수 세포의 수확 mFISH과 SKY 기술에 의해 방사선 유발 안정적인 염색체 이상 검출. 염색체 이들 기술은 검색 및 다양한 병태 생리 학적 증상의 위험을 평가하는 데 이용 될 수 그림.

도 1은 대표적인 중기 세포는 정상 및 비정상 마우스 염색체 쌍-1, -2, -3에 확산 나타낸다. 그림 2는 정상 및 비정상 마우스 중기 염색체의 스펙트럼 핵형을 보여줍니다.이러한 결과는 전리 방사선 것은 주로 다양한 세포 유형으로자가.......

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Discussion

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몇 가지 중요한 단계는 mFISH과 SKY의 성공을 결정합니다. 첫번째 가장 중요한 단계는 골수 단핵 세포의 생체 유사 분열 정지를위한 콜히친 처리를 최적화한다. 콜히친 농도와 처리 시간을 개별적으로 또는 콘서트에 효과적인 염색체 그림의 유사 분열 지수뿐만 아니라 염색체 응축 - 두 가지 중요한 전제 조건을 결정한다. 높은 콜히친 농도 이상 처리 시간은 적절한 변성과 하이브리드에 대한 호환되지 않는 매우 응축 된 염색체로 연결됩니다. 또한, 응축 된 염색체와 확산 중기 세포의 복잡한 재 배열의 정확한 식별은 달성하기 쉬운 일이 아니다. 22, 26g 사이의 체중을 가진 마우스에서 2 시간 동안 100 μL 0.05 % 콜히친의 복강 내 투여는 중기 세포의 충분한 수가 약간 좁은 염색체 확산 생성한다. 두번째 중요한 단계는 저장성 처리이다.볼륨, 처리 시간, 및 저장성 용액 영향 염색체 형태학의 온도와 유리 슬라이드 상 염색체 확산. 짧은 시간 또는 서브 - 최적의 온도에서 저장 액 처리 중첩 염색체 확산 중기 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 국립 항공 우주국 통해 아칸소 공간 그랜트 협회와 국립 우주 바이오 메디컬 연구소에 의해 지원되었다, 부여 NNX15AK32A (RP) 및 RE03701 (MH-J), 및 P20의 GM109005 (MH-J), 미국 재향 군인의 관리 ( MH-J). 우리는 원고의 준비 편집 지원 크리스토퍼 Fettes, 의료 과학 아칸소 대학의 환경 및 산업 보건학과에 대한 프로그램 코디네이터, 감사합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
포름 아미드시그마 - 알드리치221198-100ML
SSC 버퍼 20 회; ConcentrateSigma-AldrichS6639-1L
SKY 실험실 시약 마우스응용 스펙트럼 이미징FPRPR0030/M40
CAD - 집중 항체 검출 키트응용 스펙트럼 이미징FPRPR0033
단일 페인트 맞춤형 - 3가지 색상; 마우스 염색체 1: 빨간색, 마우스 염색체 2: 녹색, 마우스 염색체 3: 아쿠아응용 스펙트럼 이미징FPRPR0182/10
유리 커버슬립Fisher Scientific12-545B
트윈 20Fisher ScientificBP337-100
염산, 37%, AcrosOrganics Fisher ScientificAC45055-0025 
Fisherbrand 유리 염색 접시  나사 캡 포함Fisher Scientific08-816
KaryoMAX 염화칼륨 용액 Life Technologies10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
콜세미드 분말Fisher Scientific50-464-757 
히스토파크-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, 모델 25 137Cs 조사기J. L. Shepherd & Associates모델 484B
주사기 1 mLBD Biosciences647911
에틸 알코올, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), 칼슘 및 마그네슘 없음Fisher ScientificICN1860454
소 태아 혈청Fisher Scientific10-437-010
메탄올Fisher ScientificA454SK-4
빙하 아세트산Fisher ScientificAC295320010
Zeiss 현미경ZeissAXIO Imager.Z2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20....

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Inter chromosomal Stable AberrationsMultiple Fluorescence In Situ HybridizationSpectral KaryotypingBone Marrow CellsTotal Body IrradiationMetaphase Cell SpreadsFluorescence MicroscopyChromosome PaintingCytogenetic AnalysisRadiation Biology

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