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방법 논문

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출

9.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55162

⸱

2017년 1월 11일

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 전신 조사에 노출된 후 마우스의 골 수 세포에서 염색체 간 안정 이상을 식별하는 데 있어 다중 형광 현장 혼성화(mFISH) 및 스펙트럼 핵형 분석(SKY)의 유용성을 설명합니다.

초록

이온화 방사선(IR)은 수많은 안정 및 불안정한 염색체 이상을 유발합니다. 염색체 형태가 실질적으로 손상된 불안정한 이상(unstable aberrations)은 기존의 염색체 염색 기법으로 쉽게 식별할 수 있습니다. 그러나 염색체 형태학의 상당한 변형 없이 유전 물질의 교환 또는 전좌를 포함하는 안정적인 수차를 검출하려면 형광 제자리(in situ)로 널리 알려진 염색체 페인팅 기술인 형광 표지된 DNA 프로브의 현장 혼성화에 의존하는 정교한 염색체 페인팅 기술이 필요합니다 혼성화(FISH). FISH 프로브는 전체 염색체 또는 염색체의 정확한 하위 영역에 특이적일 수 있습니다. 이 방법은 안정적인 수차의 시각화를 가능하게 할 뿐만 아니라 특정 수차 형성과 관련된 염색체 또는 특정 DNA 염기서열을 검출할 수도 있습니다. 세포 유전학에서는 다양한 염색체 페인팅 기술을 사용할 수 있습니다. 여기에서는 전신 조사에 노출된 후 마우스의 골수 세포에서 형성되는 염색체 간 안정 이상을 식별하기 위해 mFISH(Multiple Fluorescence in situ hybridization)와 SKY(Spectral Karyotyping)라는 두 가지 고감도 방법에 대해 논의합니다. 두 기술 모두 형광 표지된 DNA 프로브에 의존하지만 검출 방법과 형광 신호의 이미지 획득 과정은 다릅니다. 이 두 가지 기술은 방사선 생물학, 암 세포 유전학, 후향적 방사선 생물선량 측정, 임상 세포 유전학, 진화 세포 유전학 및 비교 세포 유전학과 같은 다양한 연구 분야에서 사용되어 왔습니다.

서론

방사선 유도 염색체 간 안정 이상을 식별하는 가장 신뢰할 수 있는 두 가지 방법은 두 개 이상의 염색체를 동시에 페인팅할 수 있는 다중 형광 제자리 혼성화(mFISH)와 게놈의 각 상동 염색체 쌍에 고유한 색상을 부여하는 스펙트럼 핵형 분석(SKY)입니다. 불안정한 수차와 달리, 안정된 수차는 본질적으로 지속적이며 방사선 조사된 집단에서 여러 세대에 걸쳐 전파될 수있으며1, 방사선 유발 세포유전학적 병변2의 중요한 분자 "서명"으로간주됩니다. 다양한 그룹의 연구에 따르면 안정적인 수차는 암을 포함한 여러 질병의 발병 및 발병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다3. 염색체 페인팅(분자 세포 유전학이라고도 함) 시대 이전에는 기존의 G-밴딩 기술이 안정적인 염색체 이상을 감지하는 유일한 방법이었습니다. 그러나 염색체 밴딩은 해상도가 제한되고, 재현성이 불확실하며, 노동 집약적인 절차이고, 신뢰할 수 있는 데이터 해석을 위해 고도로 숙련되고 경험이 풍부한 세포유전학자가 필요하기 때문에 세포유전학자에게 도전이 됩니다4. 더욱이, 고전적인 밴딩 기법은 방사선 손상의 일반적인 결과인 두 개 이상의 염색체 간에 분포된 세 개 이상의 단절의 상호 작용을 포함하는 복잡한 염색체 재배열을 감지할 수 없습니다. 복잡한 수차는 방사선 노출 후 수년이 지난 후에도 개체에서 지속될 수 있으므로 후향적 생물선량 측정에 유용합니다5. 따라서 안정적인 염색체 재배열을 검출하기 위해 기존 밴딩 기술의 한계를 극복하기 위해 대안적인 접근법이 필요했습니다.

1960년대 후반, 방사성 물질로 표지된 핵산 프로브를 사용한 분자 혼성화에 대한 Gall과 Pardue(1969)의 선구적인 연구는 세포 유전학 분야에서 새로운 시대를 열었고, 6번 염색체에서 특정 DNA 염기서열을 검출할 수있었습니다. 그러나 분자 혼성화를 위한 방사성 프로브의 사용에는 몇 가지 단점이 있었습니다: 방사성 프로브는 상대적으로 불안정하고, 프로브 활성은 사용된 동위원소의 방사성 붕괴에 따라 달라지며, 혼성화에 더 오랜 시간이 걸리고, 해상도가 제한되며, 프로브는 상대적으로 비싸고, 방사성 물질은 건강에 해롭습니다. 따라서 비방사성 프로브를 개발하고 설계해야 했습니다. 1980년대와 1990년대에 형광 표지 핵산 프로브의 도입은 방사성 프로브의 한계를 극복하고 혼성화 기술의 안전성, 민감도 및 특이성을 크게 향상시켰습니다7-10. 형광 프로브는 적절한 여기 및 방출 필터가 장착된 형광 현미경으로 관찰할 때 매우 밝은 신호를 발생시킵니다. 형광 표지된 염색체 또는 염색체의 일부의 손실, 증가 또는 재배열은 이 FISH 기술로 쉽게 식별할 수 있습니다.

FISH 페인팅에 의한 염색체 이상 분석은 수년에 걸쳐 세포유전학 연구에서 현저한 진전을 이뤘습니다. 유전자좌 특이적 프로브에서 전체 염색체 페인팅 프로브에 이르기까지 특정 응용 분야를 위한 형광 표지 프로브를 설계하는 것은 이 분야를 크게 발전시켰습니다. 이것은 또한 기존의 염색체 밴딩으로는 불가능했던 미시적("비밀스러운") 재배열의 감지를 용이하게 했습니다. mFISH와 SKY에 의한 염색체 페인팅은 단순하고 복잡한 염색체 간 재배열을 식별하는 데 유용한 도구임이 입증되었습니다. 두 기술의 기본 원리는 비슷하지만 in situ hybridization 후 형광 신호의 검출 및 식별 방법과 이미지 획득 과정은 다릅니다. mFISH에서는 협대역통과 현미경 필터를 사용하여 4가지 형광 색소 각각의 개별 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 전용 소프트웨어를 사용하여 이미지를 결합합니다. SKY에서 이미지 획득은 epifluorescence microscopy, charge-coupled device imaging 및 Fourier spectroscopy의 조합을 기반으로 하며, 이를 통해 모든 이미지 포인트에서 단일 노출로 전체 방출 스펙트럼을 측정할 수 있습니다. mFISH와 SKY에서 흑백 이미지는 독립적으로 캡처된 다음 병합되고, 마지막으로 각 형광 프로브에 부착된 특정 염료를 기반으로 단색 이미지의 염색체에 고유한 의사 색상이 할당됩니다.

방사선 생물학 분야에서 mFISH와 SKY 분석의 기여는 주목할 만하며, 특히 IR(방사선 생물선량 측정)11-14, 방사선 발암 위험 평가15, 방사선 요법 관련 2차 암의 탐지 및 위험 추정16에 대한 인체 노출의 후향적 선량 추정에 기여하고 있습니다. 쥐를 대상으로 한 최근 연구에 따르면 FISH 기반 염색체 페인팅 기법도 방사선 대책17의 효능을 평가하는 데 중요한 도구인 것으로 나타났습니다. 본 연구에서는 mFISH와 SKY 기법을 사용하여 생쥐의 골수 세포에서 안정적인 염색체 이상 유도에 대한 전신 방사선 노출의 영향을 입증했습니다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 수행 하였다. 동물 프로토콜은 의료 과학에 대한 아칸소 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 신선한 공기와 표준 설치류 음식과 물을 무료로 이용할 수의 15 시간당 사이클 - 모든 동물은 10 20 ± 2 ℃에서 표준 에어컨 동물 시설에서 보관 하였다. 도착 후, 마우스 1 주일 동안 격리에서 개최하고 인증 설치류 식사를 제공했다.

1.Radiation 노출 및 중기 세포의 생체 체포에

  1. 노출 조사 챔버에서 2 Gy의 전신 방사선에 마우스를 해제는-마취. 조사 기간 동안, 통풍이 잘 유지 챔버의 장소 마우스는 자유롭게 이동하고 균일 한 용량을받지 못한 확인합니다.
  2. 0.05 % 콜히친 용액 100 μL를 주입 (c칼슘 및 마그네슘없는 PBS에 용해 olchicine 분말) 복강 내 1 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용. 어떤 기관에 직접 분사하지 마십시오.
  3. 골수 세포 수확하기 전에 2 시간 동안 케이지에 동물을 둡니다. 통증이나 고통의 흔적에 대한 동물을 관찰한다.

2. 골수 세포 수확 및 밀도 구배 원심 분리하여 골수 단핵 세포의 분리

  1. CO 2 질식하여 마우스를 안락사.
  2. 지느러미와 복부 측면에 70 % 에탄올 스프레이.
  3. 날카로운 가위로 복부 피부에 2cm의 절개를합니다. 무딘 핀셋 절개의 양쪽 피부를 잡고 조심스럽게 복부 근육을 잡아 당깁니다.
  4. 가위로 양쪽 뒷다리를 잘라 즉시 4 % FBS 사전 냉장 PBS에 배치합니다.
  5. 조심스럽게 날카로운 면도칼과면 거즈 붕대로 뒷다리에 연결된 모든 근육을 청소합니다.
  6. 대퇴골의 경골을 분리합니다. 면도칼 각 뼈의 양쪽 끝을 낸다.
  7. 3 mL의 주사기에 부착 된 23 G 바늘을 사용하여 (4 % FBS)와 3 mL의 PBS와 함께 골수의 컨텐츠를 플러싱하고, 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 컨텐츠를 수집한다. 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 바늘을 통해 세포 현탁액을 10 배 이상을 합격.
  8. 조심스럽게 세포 현탁액 및 림프구 분리 매질 간의 인터페이스를 방해하지 않고 림프구 분리 매질 (3 mL)을 동일 부피의 세포 현탁액을 오버레이. 실온에서 30 분 동안 400 × g으로 원심 분리기.
  9. 새로운 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 다른 계층과 전송을 방해하지 않고 조심스럽게 버피 코트를 수집한다.

중기 세포 스프레드 3. 준비

  1. 버피 코트를 포함하는 튜브에 10 mL의 PBS를 추가합니다.
  2. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기.
  3. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 그런 t을 휴식그는 부드러운 도청과 펠렛 셀, ​​10 mL의 PBS를 추가합니다.
  4. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기.
  5. , 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거 펠렛을 중단하고 미리 예열 저장성 0.075 M 염화칼륨 용액 4 mL를 넣고. 부드러운 일정한 흔들림과 강하에 의한 저장성 용액 방울을 추가합니다.
  6. 수욕에서 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 인큐베이션.
  7. (: 빙초산 3 : 메탄올 1 v / v)의 저장성 처리 후, 고정액 동량 (4 ml)에 추가 15ml의 튜브와 상기 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합한다.
  8. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다.
  9. 몇 초 동안 부드러운 소용돌이 다음 탭핑과 세포 펠렛을 휴식과 일정한 흔들림와 드롭으로 정착 솔루션 드롭 3 mL를 넣고.
  10. 실온에서 30 분 동안 배양 한 다음 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기.
  11. , 상층 액을 제거 신사와 세포 펠렛을 휴식제작 : 도청, 3 mL의 신선한 정착액을 추가합니다.
  12. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. 부드러운 도청과 세포 펠렛을 휴식, 신선한 3 ML의 정착액을 추가합니다.
  13. 단계를 반복 3.12 배 더.
  14. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 세포 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을 제거한다. 그 후 600 μL의 정착에 400를 추가하고 피펫으로 잘 혼합한다.
  15. 45 ° 각도로 기울어 미리 청소하고 젖은 슬라이드에 30 μL에게 고정 된 세포를 삭제하고 완전히 밤새 공기 건조에 슬라이드를 할 수 있습니다.

mFISH 4. 마우스 염색체 페인팅

  1. 염색체 변성
    1. 실온에서 2 분 동안 2 × SSC에서 중기 세포의 퍼짐을 포함하는 슬라이드를 놓는다.
    2. 70 %에서 2 분 각각 80 %, 100 %를 직렬 에탄올 세척하여 슬라이드를 탈수. 65 ° C에서 60 분 동안 품어.
    3. 데우고 40 ㎖의 변성 용액 (70 % 포름 아미드 / 2 × SS기음; 30 분 동안 유리 코 플린 항아리에 70 ° C (± 2 ° C)로 pH를 7.0). 1.5 분 - 1 예열 변성 용액 슬라이드를 배양하여 염색체 변성.
    4. 2 분 변성 과정을 중단뿐만 아니라, 재 어닐링에서 염색체 변성을 방지하기위한 빙냉 70 % 에탄올 중에 슬라이드를 즉시 급냉. 그 다음 2 분 동안 80 % 에탄올로 세척하여 탈수. 2 분 동안 100 %의 에탄올과 에탄올 세척을 반복합니다. 완전히 실온에서 슬라이드를 건조.
  2. 변성 및 프로브 혼합물의 하이브리드
    1. 간단히 제조자에 의해 공급되는 프로브 혼합물을 원심 분리하여, 7 분 동안 수욕에서 80 ℃ (± 2 ℃)에서 배양 캡 원심 분리 튜브 스냅 500 μL로 프로브 액 10 μL를 전송하고, 변성.
    2. 10 분 동안 37 ℃에서 수욕 프로브 혼합물 원심 튜브를 놓는다.
    3. 변성 chromoso와 슬라이드에 변성 프로브 혼합물을 적용MES.
    4. 조심스럽게 18mm X 18mm 유리 커버 슬립으로 영역을 커버하고 매우 부드럽게 밀어 커버 슬립을 눌러 눈에 보이는 기포를 제거한다. 고무 시멘트와 커버 슬립의 네면을 밀봉 및 하이브리드에 대한 가습 챔버에서 37 ° C에서 어둠 속에서 16 시간에 12 시간 동안 배양.
  3. 포스트 하이브리드 세척 및 검출
    1. 조심스럽게 고무 시멘트와 커버 슬립을 제거합니다.
    2. 5 분 동안 74 ° C (± 2 ° C)에서 미리 예열 0.4 배의 SSC의 장소 슬라이드.
    3. 2 분 동안 세척 용액 II (4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20)에서 세척 슬라이드.
    4. DAPI의 Counterstain과 (1.5 μg의 / mL)로 안티 - 페이드 장착 매체의 20 μL를 놓고 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 부드럽게 실험실 조직과 coverslip에 눌러 공기 거품과 초과 장착 솔루션을 제거합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다.
    5. 적절한 필터가 장착 된 형광 현미경을 사용하여 볼 슬라이드.

5. 스펙트럼 핵형 마우스 염색체의 (SKY)

  1. 염색체와 프로브 변성
    1. 흔들림없이, 2 분 동안 실온에서 2 × SSC에서 슬라이드 평형.
    2. 실온에서 2 분마다 에탄올 시리즈 슬라이드 (70 %, 80 %, 100 % 에탄올)을 탈수. 완전히 에탄올을 제거 할 수있는 슬라이드를 공기 - 건조.
    3. 따뜻한 40 ML의 변성 용액 (70 % 포름 아미드 / 2 × SSC, 산도 7.0) 30 분 동안 유리 코 플린 항아리입니다.
    4. 1 ~ 1.5 분 동안 예열 변성 솔루션에 슬라이드를 품어.
    5. 2 분 변성 과정을 중단뿐만 아니라, 재 어닐링에서 염색체 변성을 방지하기 위해 즉시 빙냉 70 % 에탄올로 슬라이드 젖어.
    6. 실온에서 2 분 동안 100 % 에탄올로 2 분 후, 80 % 에탄올로 배치 의해 슬라이드 탈수.
    7. 80 ° C (± 2 ° C)로 설정 수욕에서 SKY 프로브 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 1) 변성7 분 후 즉시 10 분간 37 ° C로 설정 다른 수조에 놓는다.
  2. 프로브 하이브리드
    1. 변성 염색체에 변성 SKY 프로브의 10 μL를 추가합니다.
    2. 기포가 커버 슬립 아래에 갇혀되지 않도록 조심스럽게 SKY 프로브 상에 18mm X 18mm 유리 coverslip에 배치합니다.
    3. 고무 시멘트와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다.
    4. 가습 차광판 챔버에 슬라이드를 넣고 36 시간 ~ 24 시간 동안 37 ℃에서 어둠 속에서 배양한다.
  3. 포스트 하이브리드 세척 및 형광 검출
    1. 커버 슬립을 방해하지 않고 매우 신중 고무 시멘트를 제거합니다.
    2. 일정한 흔들림 5 분 동안 72 ° C (± 2 ° C)에서 미리 예열 빠른 세척 용액 (0.4 배의 SSC)에 슬라이드를 놓습니다. 세척 용액 III (4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20)에 슬라이드를 담그고 흔들어 섞으면 서 1 분 동안 품어.
    3. 옵션 : 차단 시약 80 μL를 추가하이브리드의 영역 상 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 2)와, 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 30 분 동안 37 ° C에서 어둠 속에 품어.
    4. 조심스럽게 플라스틱 커버 슬립을 제거하고 5 분간 예열 (45 ° C) 세척 용액 III와 슬라이드를 씻는다.
    5. 80 μL Cy5에 염색 시약 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 3)를 적용하는 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 40 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어.
    6. 함유하는 유리 코 플린 항아리에 슬라이드를 담근 예열 (45 ºC) 세정액 III (4X SSC / 0.1 % 트윈 20)와 진탕하면서 2 분 동안 수욕에서 45 ℃에서 배양한다. 이 세척 단계를 3 번 ​​반복합니다.
    7. 80 μL Cy5.5의 염색 시약 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 4)를 적용하는 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 40 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어.
    8. (미리 예열과 슬라이드 3 회 반복한다45 ºC) 세정액 III.
    9. 초과 액체를 배출하기 위해 종이 타월에 대하여 기울어 진 위치에 슬라이드를 잡습니다. 20 μL 안티 페이드 DAPI 시약 (제조업체에서 제공 유리 병 # 5)를 추가하고 조심스럽게 기포를 도입하지 않고 24mm X 60mm 유리 coverslip에 배치합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 SKY 이미지를 캡처 장착 된 표면 형광 현미경으로 관찰한다.

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결과

전신 방사선 조사 된 마우스의 골수 세포에서 다수의 염색체 수차를 유도한다. 현재 프로토콜은 방사선 조사 후 골수 세포의 생체 유사 분열 정지를 위해 최적화되고, 밀도 구배 원심 분리, 중기 세포 퍼짐의 제조 및 후속 의해 조사 생쥐 골수 단핵 세포의 분리의 뒷다리 골수 세포의 수확 mFISH과 SKY 기술에 의해 방사선 유발 안정적인 염색체 이상 검출. 염색체 이들 기술은 검색 및 다양한 병태 생리 학적 증상의 위험을 평가하는 데 이용 될 수 그림.

도 1은 대표적인 중기 세포는 정상 및 비정상 마우스 염색체 쌍-1, -2, -3에 확산 나타낸다. 그림 2는 정상 및 비정상 마우스 중기 염색체의 스펙트럼 핵형을 보여줍니다.이러한 결과는 전리 방사선 것은 주로 다양한 세포 유형으로자가...

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토론

몇 가지 중요한 단계는 mFISH과 SKY의 성공을 결정합니다. 첫번째 가장 중요한 단계는 골수 단핵 세포의 생체 유사 분열 정지를위한 콜히친 처리를 최적화한다. 콜히친 농도와 처리 시간을 개별적으로 또는 콘서트에 효과적인 염색체 그림의 유사 분열 지수뿐만 아니라 염색체 응축 - 두 가지 중요한 전제 조건을 결정한다. 높은 콜히친 농도 이상 처리 시간은 적절한 변성과 하이브리드에 대한 호환되지 않는 매우 응축 된 염색체로 연결됩니다. 또한, 응축 된 염색체와 확산 중기 세포의 복잡한 재 배열의 정확한 식별은 달성하기 쉬운 일이 아니다. 22, 26g 사이의 체중을 가진 마우스에서 2 시간 동안 100 μL 0.05 % 콜히친의 복강 내 투여는 중기 세포의 충분한 수가 약간 좁은 염색체 확산 생성한다. 두번째 중요한 단계는 저장성 처리이다.볼륨, 처리 시간, 및 저장성 용액 영향 염색체 형태학의 온도와 유리 슬라이드 상 염색체 확산. 짧은 시간 또는 서브 - 최적의 온도에서 저장 액 처리 중첩 염색체 확산 중기 ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 국립 항공 우주국 통해 아칸소 공간 그랜트 협회와 국립 우주 바이오 메디컬 연구소에 의해 지원되었다, 부여 NNX15AK32A (RP) 및 RE03701 (MH-J), 및 P20의 GM109005 (MH-J), 미국 재향 군인의 관리 ( MH-J). 우리는 원고의 준비 편집 지원 크리스토퍼 Fettes, 의료 과학 아칸소 대학의 환경 및 산업 보건학과에 대한 프로그램 코디네이터, 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
포름 아미드시그마 - 알드리치221198-100ML
SSC 버퍼 20 회; ConcentrateSigma-AldrichS6639-1L
SKY 실험실 시약 마우스응용 스펙트럼 이미징FPRPR0030/M40
CAD - 집중 항체 검출 키트응용 스펙트럼 이미징FPRPR0033
단일 페인트 맞춤형 - 3가지 색상; 마우스 염색체 1: 빨간색, 마우스 염색체 2: 녹색, 마우스 염색체 3: 아쿠아응용 스펙트럼 이미징FPRPR0182/10
유리 커버슬립Fisher Scientific12-545B
트윈 20Fisher ScientificBP337-100
염산, 37%, AcrosOrganics Fisher ScientificAC45055-0025 
Fisherbrand 유리 염색 접시  나사 캡 포함Fisher Scientific08-816
KaryoMAX 염화칼륨 용액 Life Technologies10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
콜세미드 분말Fisher Scientific50-464-757 
히스토파크-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, 모델 25 137Cs 조사기J. L. Shepherd & Associates모델 484B
주사기 1 mLBD Biosciences647911
에틸 알코올, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), 칼슘 및 마그네슘 없음Fisher ScientificICN1860454
소 태아 혈청Fisher Scientific10-437-010
메탄올Fisher ScientificA454SK-4
빙하 아세트산Fisher ScientificAC295320010
Zeiss 현미경ZeissAXIO Imager.Z2

참고문헌

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