방법 논문

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

DOI:

10.3791/55196

⸱

2017년 11월 1일

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

이 논문에서

요약

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여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

초록

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재생 의학에 대 한 주요 목표 중 하나입니다 생성 및 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 파생 된 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 유지 보수. 최근까지, HSCs로 hPSCs를 차별화 하는 노력 있다 주로 HSC 잠재력, 부족 하 고 대신 노 른 자 삭 조를 닮은 창시자 조 혈을 생성 하 게 됩니다. 이 결과 조 혈 창시자 다양 한 성인 조 혈 장애, 림프 성 계보의 특히 그의 질병 모델링 생체 외에서 유틸리티를 제한 수 있습니다. 그러나, 우리는 최근 우리 여기 개요 무대 관련 감독된 분화 프로토콜을 사용 하는 hPSCs에서 erythro-myelo-림프 multilineage 확실 한 조 혈 창시자를 생성 하는 방법을 설명 했습니다. 매트릭스-코팅 plasticware 지하실 멤브레인에 hPSCs의 효소 분리 통해 embryoid 몸 (EBs)이 형성 된다. EBs는 재조합 BMP4, 이후 GSK3β 억제 물, CHIR99021 확실 한 조 혈 모 프로그램에 지정 된 의해 mesoderm로 구분 됩니다. 또는, 기본 조 PORCN 억제 물, IWP2에 의해 지정 됩니다. 더 조는 재조합 VEGF의 추가 지원 조 혈 cytokines를 통해 구동 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 생성 결과 조 혈 창시자 질병 및 발달 모델링, 생체 외에서사용 될 가능성이 있다.

서론

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인간 만능 줄기 세포 (hPSCs) 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 포괄로 정의 되 고 적절 한 성장 조건 하에서 자기 갱신을 받은 뿐만 아니라의 독특한 능력을가지고 또한, 모든 세포 유형으로 분화 하는 능력 3 개의 세균 층에서 파생 하는 그러나: endoderm, mesoderm, ectoderm1. 이러한 독특한 능력으로 인해 hPSCs 재생 의학, 질병, 모델링과 세포 기반 요법2에 대 한 큰 약속을 잡으십시오. 여러 셀 형식 hPSCs에서 성공적으로 분화 되어 있다, 하는 동안 한 가지 중요 한 문제는 독점적으로 성인 같은 hPSC 파생 된 조 혈 줄기 세포 (HSCs)와 최종 조 혈 창시자의 생체 외에서 사양입니다.

HPSCs에서 인간의 HSCs의 발전에 하나의 가능성이 장벽이 인간 배아3내에서 여러 조 혈 프로그램의 존재입니다. 나온다, "원시 조," 불리는 첫 번째 프로그램 extraembryonic 노 른 자 삭 조직에서 유래 하 고 erythroblast 창시자 (EryP-CFC), macrophages, 및 없으며 일시적 생산 최....

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프로토콜

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1. 시 약

  1. 얻기 셀 라인; hESCs 또는 hiPSCs 1, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 29, OP9 DL4 기질 30 , 31.
  2. 시 약 준비
    1. PBS에 젤라틴의 0.1 %w / v 솔루션을 준비. 압력가 마로 소독 하 여 살 균 하십시오 그리고 aliquoting 후 4 ° C에서 저장.
    2. 준비 젤라틴 코팅 plasticware
        입니다. 0.1% 젤라틴 용액의 1.5 mL와 코트 6-잘 요리. 실 온에서 15 분 동안 품 어. 즉시 사용 하기 전에, 나머지 젤라틴 솔루션 발음.
    3. 15 %v / v FBS와 항생제 1 x IMDM 여 MEF 미디어를 준비. 사용 전에 2 m L-글루타민 m와 400 µ M monothioglycerol (MTG) 보충 하 고 4에서 저장 ° c.
    4. 준비 20 %v / v 녹아웃 혈 청 교체 (KOSR) DMEM/F12의 솔루션으로 hPSC 문화 미디어, 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 1....

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결과

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HPSCs에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 창시자의 유도 묘사한 회로도 그림 1에서 그림입니다. Mesoderm 정식 WNT 차별화, 조 혈 原 사양에 따라 2-3 일 동안 발생 하는 신호에 의해 패턴.

대표적인 흐름 cytometric 분석 및 스 분석 실험 조 혈 차별화 hPSC 파생 된 문화를 형성 하는 식민지는 그림 2에 표시 됩니다. IWP2 대우 차별화 문화 고유 CD34 보장할+CD43− 와 CD34낮은 /−CD43+ 인구, 그러나 CHIR 처리 차별화 문화 해야한다 <<.......

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토론

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이 프로토콜 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 분화에 대 한 빠른, 혈 청, 기질-없는 방법을 설명합니다. 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 mesodermal 규격은 유일 하 게 정식 WNT 신호 전달의 분자 억제제를 이용 하는 우리의 프로토콜을 사용 하 여 안정적으로 얻을 수 있습니다. 반면 PORCN 억제제 IWP234 에 의해 WNT 억제 지정 원시 조 혈 mesoderm26단계 관련 WNT 활성화 GSK3β 억제제 CHIR9902133 에 의해 확실 한 조 혈 mesoderm 상승을 제공 합니다. 메모의이 방법은 튼튼하게 주지 않는다 상승 engraftable HSC 같은 인구 (표시 되지 않음). 그러나,이 방식으로 생성 하는 확실 한 조 혈 창시자는 그들의 잠재적인 미래에 변환 응용 프로그램을 강조 transgene 유도 engraftment 잠재적인35

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공개 사항

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 부의 내과, 혈액 부, 워싱턴 대학의과 대학에 의해 지원 되었습니다. CD는 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소에서 T32HL007088에 의해 지원 되었다. CMS는 혈액학 학술 상을의 미국 사회에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Iscove의 변형 Dulbecco's Medium (IMD)Corning10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell ratedGemini Bioproducts100-500
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30396.03
L-glutamine, 200 mM 용액Life Technologies25030-081
페니실린-스트렙토마이신Life 기술15070-063
0.25% 트립신-EDTA생명 기술25200056
0.05% 트립신-EDTA생명 기술25300054
젤라틴, 돼지 피부, A형시그마-알드리치G1890
알파-MEM생명 기술12000-022
DMEM-F12코닝10-092-CV
녹아웃 혈청 교체Life Technologies10828028"KOSR"
비필수 아미노산(NEAA)Life Technologies11140050
b-메르캅토에탄올, 55mM 용액Life Technologies21985023
염산Sigma-AldrichH1758
Fraction V, 소 혈청 알부민Fisher ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2 보충제Life Technologies17502048
B27 보충제, 비타민 A없음 Life Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
성장 인자 감소 MatrigelCorning354230"MAT"
-흡수산시그마-알드리치A4403
인간 혈청 트랜스페린시그마-알드리치10652202001
모노티오글리세롤(MTG)시그마-알드리치M6145
콜라겐분해효소 B로슈11088831001
콜라겐분해효소 II라이프 테크놀로지17101015
DNaseICalbiochem260913
인산염 완충 식염수(PBS)생명 기술14190144
bFGFR& D 시스템233-FB
BMP4R & D 시스템314-BP
액티브 AR & D 시스템338-AC
VEGFR & D 시스템293-VE
SCFR& D 시스템255-SC
IGF-1R& D 시스템291-G1
IL-3R& D 시스템203-IL
IL-6R& D 시스템206-IL
IL-7R& D 시스템207-IL
IL-11R& D 시스템218-1L
TPOR& D 시스템288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 리간드(FLT3-L)R& D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensin IISigma-AldrichA9525
Losartan PotassiumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4BD Biosciences560650희석 1:100; T 세포 분석
CD8 PE 클론 RPA-T8BD Biosciences561950희석 1:10; T 세포 분석
CD34 APC 클론 8G12BD Biosciences340441희석 1:100; EHT 분석
CD34 PE-Cy7 클론 8G12BD Biosciences348801희석 1:100; 혈인성 내피
CD43 FITC 클론 1G10BD Biosciences555475희석 1:10; 혈인성 내피
CD45 APC-Cy7 클론 2D1BD Biosciences557833희석 1:50; T 세포 분석
CD45 eFluor450 클론 2D1BD Biosciences642284희석 1:50; EHT 분석
CD56 APC 클론 B159BD Biosciences555518희석 1:20; T 세포 분석
CD73 PE 클론 AD2BD Biosciences550257희석 1:50; 혈인성 내피
CD184 APC 클론 12G5BD Biosciences555976희석 1:50; 혈인성 내피
4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)BD Biosciences564907희석 1:10,000; T 세포 분석
OP9 DL4 세포Holmes, R. 및 JC Zuniga-Pflucker. 콜드 스프링 Harb 프로토콜, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q 정수 시스템EMD Millipore
5% CO2 인큐베이터37°C에서 설정
멀티가스 인큐베이터37°C에서 설정, 5% CO2, 5% O2
6웰 조직 배양 플레이트Corning353046
24웰 조직 배양 플레이트Corning353226
6웰 저접착 조직 배양 플레이트Corning3471
24웰 저접착 조직 배양 플레이트Corning3473
35mm 조직 배양 접시Corning353001
블런트 엔드 니들, 16 게이지Corning305198
3cc 주사기Corning309657
5 mL 폴리프로필렌 시험관Corning352063
5 mL 폴리스티렌 시험관Corning352058
15 mL 폴리프로필렌 원뿔Corning430791
50 mL 폴리프로필렌 원뿔Corning430921
2 mL 혈청학적 피펫Corning357507
5 mL 혈청학적 피펫Corning4487
10 mL 혈청학적 피펫Corning4488
25 mL 혈청학적 피펫Corning4489
세포 스크레이퍼Corning353085
2.0 mL cryovialCorning430488
5 mL 시험관(40 µ 포함); M 세포 여과기Corning352235
40 µ M 세포 여과기Corning352340
세포 배양 원심 분리기
Biosafety hood
FACS AriaII 또는 동급
LSRii 또는 동급
FlowJo 소프트웨어TreeStar
수조37°C
로 설정0.22 & 마이크로; M 여과 시스템코닝
오토클레이브
4 C 냉장고
- 20 C 냉장고
- 80 C 냉장고
L스 형 형

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic developme....

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태그

GSK3PORCNVEGFFACS

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