방법 논문

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

DOI:

10.3791/55196

⸱

2017년 11월 1일

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

초록

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재생 의학에 대 한 주요 목표 중 하나입니다 생성 및 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 파생 된 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 유지 보수. 최근까지, HSCs로 hPSCs를 차별화 하는 노력 있다 주로 HSC 잠재력, 부족 하 고 대신 노 른 자 삭 조를 닮은 창시자 조 혈을 생성 하 게 됩니다. 이 결과 조 혈 창시자 다양 한 성인 조 혈 장애, 림프 성 계보의 특히 그의 질병 모델링 생체 외에서 유틸리티를 제한 수 있습니다. 그러나, 우리는 최근 우리 여기 개요 무대 관련 감독된 분화 프로토콜을 사용 하는 hPSCs에서 erythro-myelo-림프 multilineage 확실 한 조 혈 창시자를 생성 하는 방법을 설명 했습니다. 매트릭스-코팅 plasticware 지하실 멤브레인에 hPSCs의 효소 분리 통해 embryoid 몸 (EBs)이 형성 된다. EBs는 재조합 BMP4, 이후 GSK3β 억제 물, CHIR99021 확실 한 조 혈 모 프로그램에 지정 된 의해 mesoderm로 구분 됩니다. 또는, 기본 조 PORCN 억제 물, IWP2에 의해 지정 됩니다. 더 조는 재조합 VEGF의 추가 지원 조 혈 cytokines를 통해 구동 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 생성 결과 조 혈 창시자 질병 및 발달 모델링, 생체 외에서사용 될 가능성이 있다.

서론

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인간 만능 줄기 세포 (hPSCs) 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 포괄로 정의 되 고 적절 한 성장 조건 하에서 자기 갱신을 받은 뿐만 아니라의 독특한 능력을가지고 또한, 모든 세포 유형으로 분화 하는 능력 3 개의 세균 층에서 파생 하는 그러나: endoderm, mesoderm, ectoderm1. 이러한 독특한 능력으로 인해 hPSCs 재생 의학, 질병, 모델링과 세포 기반 요법2에 대 한 큰 약속을 잡으십시오. 여러 셀 형식 hPSCs에서 성공적으로 분화 되어 있다, 하는 동안 한 가지 중요 한 문제는 독점적으로 성인 같은 hPSC 파생 된 조 혈 줄기 세포 (HSCs)와 최종 조 혈 창시자의 생체 외에서 사양입니다.

HPSCs에서 인간의 HSCs의 발전에 하나의 가능성이 장벽이 인간 배아3내에서 여러 조 혈 프로그램의 존재입니다. 나온다, "원시 조," 불리는 첫 번째 프로그램 extraembryonic 노 른 자 삭 조직에서 유래 하 고 erythroblast 창시자 (EryP-CFC), macrophages, 및 없으며 일시적 생산 최고의 특징 이다. 특히,이 프로그램은 HSCs, 상승 수 주지도 않습니다 그것을 일으키 다 T와 B 림프 창시자. 그러나, 노 른 자 삭은 뚜렷이 일으키 erythro 골수성 조상 (EMP4,5,6,,78) 같은 제한 된 확실 한 조 혈 창시자 그리고 erythroid 불충분 한 림프 액 multipotent 조상 (LMPP9). 그러나, EMPs도 LMPPs는 완전히 multipotent 또는 HSC 같은 engraftment 성인 받는 사람의 수입니다. 대조적으로, 나중에 개발, 고아 하 게 정의 된 "확실 한" 조 혈 모 프로그램은 HSC를 포함 하 여 모든 성인 조 혈 계보를 야 기한 적절 한 태아의 대동맥-생식-mesonephros 지역에 지정 됩니다. Hemogenic (그가) 내 피3,10,11에서에서 내 피-하-조 혈 전환을 통해 노치 종속 패션에서 발생 하는이 내 배아 확실 한 조 혈 모 세포의 사양 ,12,,1314. 재구성 능력, 외 잠재적인 multilineage 및 이러한 셀의 노치 의존을 사용할 수 있는 EMP (검토 참조3,13 LMPP에서 이러한 확실 한 조 혈 창시자를 구별 ).

에 따라 장치를 마더보드에 hPSCs에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 사양 관리를 이해 하는 것입니다 가능성이 확실 한 조 혈 창시자 hPSC 라인의 다양 한 걸쳐의 재현 생산에 중요 한. 최근까지 multipotent 원시적이 고 확실 한 조 혈 창시자 분리 수 hPSC 차별화 프로토콜15,,1617,18, 존재 하지 않았다 19,20,21,22,23,,2425. 먼저 소 태아 혈 청 (FBS) 및 실질 공동 문화를 사용 하 여 많은 접근 원시적이 고 확실 한 조 혈 잠재적인15,16의 혼합물으로 hPSC 차별화의 조 혈 잠재력 설명 17,,1922,,2325. 더 많은 조 혈 혈 청 무료 프로토콜 항구 조 혈 잠재적인18,20,21, hPSCs에서 mesoderm의 사양에 대 한 신호 요구 사항 설명 그러나 24., 이러한 방법은 여전히 두 프로그램 전부의 다른 유형의 혼합물을 상승 했다, 임상 응용 및 이해 발달 메커니즘에 그들의 사용 제한 될 수 있습니다.

우리는 최근 ACTIVIN/NODAL 및 WNT 신호 hPSC 파생 mesoderm18,26에서에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 사양에 대 한 단계-특정 신호 요구 사항을 설명 하는 데 이러한 연구에 내장 . 후자 이었다 특히 독특한 무대 관련 WNT 신호 조작의 그것의 사용 중 독점적으로 기본 또는 독점적으로 확실 한 조 혈 창시자26의 사양에 대 한 수 있습니다. Mesoderm 사양 중 정식 WNT 신호 IWP2 PORCN 억제제와 억제 CD43 지정에 결과+ EryP CFC 및 감지 림프 잠재력과 골수성 창시자. 예리한 대조에서는, 정식 WNT 신호 GSK3β 억제 물, CHIR99021와 차별화의 동일한 단계에서의 자극 감지 CD43의 완전 한 부재에 결과+ EryP-CFC, 동시에 선도 하는 동안에 CD34의 사양+CD43− 그. 이 인구 보유 골수성, HBG-erythroid, 및 T-림프 잠재력을 표현. 이후 분석 CD7327,28 와 CD18428, 그리고 조 혈 잠재력의 표현 부족으로 그는 노치 종속28이 확인. 추가, 단일 셀 클론 분석 이러한 확실 한 조 혈 모 계보 multipotent 단일 셀28에서 파생 될 수 있는 시연 했다. 함께 찍은, 이러한 연구 단계 관련 WNT 신호 조작 순수 원시 조 혈 창시자, 또는 multipotent 노치 종속 확실 한 조 혈 창시자 지정할 수 나타냅니다.

여기, 우리는 그 독점적으로 기본 또는 최종 조 혈 창시자, 정식 WNT mesodermal 패턴, 그리고 그들의 다운스트림 조 혈 계보 중 신호 분석 실험의 조작을 통해 수익률 차별화 전략 개요. 이 프로토콜은 hPSCs 재생 의학 응용 프로그램에서 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 생산에 관심이 수사에 큰 가치입니다.

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프로토콜

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1. 시 약

  1. 얻기 셀 라인; hESCs 또는 hiPSCs 1, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 29, OP9 DL4 기질 30 , 31.
  2. 시 약 준비
    1. PBS에 젤라틴의 0.1 %w / v 솔루션을 준비. 압력가 마로 소독 하 여 살 균 하십시오 그리고 aliquoting 후 4 ° C에서 저장.
    2. 준비 젤라틴 코팅 plasticware
        입니다. 0.1% 젤라틴 용액의 1.5 mL와 코트 6-잘 요리. 실 온에서 15 분 동안 품 어. 즉시 사용 하기 전에, 나머지 젤라틴 솔루션 발음.
    3. 15 %v / v FBS와 항생제 1 x IMDM 여 MEF 미디어를 준비. 사용 전에 2 m L-글루타민 m와 400 µ M monothioglycerol (MTG) 보충 하 고 4에서 저장 ° c.
    4. 준비 20 %v / v 녹아웃 혈 청 교체 (KOSR) DMEM/F12의 솔루션으로 hPSC 문화 미디어, 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 1 x 항생제, 55 μ M β-mercaptoethanol, 2 m L-글루타민, m 그리고 10 ng/mL bFGF. 2 µ m 필터를 소독 하 고 4 어둠 속에 저장 필터 ° c.
    5. 2 µ m 필터, aliquot, 소독 하 고 4에서 어둠 속에 저장 5 %v / v KOSR DMEM/F12 4mm HCl. 여과기의 솔루션으로 서 혈 청 자유로운 준비 세척 미디어 ° c.
    6. 게 1 mg/mL DNase 나 DNase를 용 해 하 여 솔루션 내가 얼음에 얼음 처럼 차가운, 살 균 이온을 제거 된 물으로 3-4 h. 필터 2 µ m 필터와 소독 및 보관-20에서 aliquots ° c.
    7. 준비 세척 미디어 중지 솔루션: 추가 10 %FBS 및 10 µ g/mL DNase 나. 정지 솔루션 준비 한다 사용 직전.
    8. 준비 (예를 들어, 라고도 매트 hereon matrigel) 지하실 멤브레인 매트릭스 혼합물 솔루션.
      참고: 모든 단계를 준비 하 고 매트 혼합물을 사용 하 여 수행 해야 얼음 또는 4 ° C. Thaw 하룻밤에 4 ° C에서 얼음 매트를 냉동. 10 mL을 추가 하 여 매트 1:1 희석 차가운 IMDM와 하룻밤에 4 ° C에서 얼음 냉 기. 추가 20 mL와 매트 혼합물을 희석 차가운 IMDM와 하룻밤에 4 ° C에서 얼음 냉 기. 미리 냉장된 튜브와 저장소 사용까지-20 ° C에서 약 수. 때 사용 하기 위해 준비, 4 ° c.에 하룻밤 매트 혼합물을 녹여
    9. 코트 매트
        세포 배양 배지.
        참고: 모든 단계 코팅 매트 플레이트의 얼음에 수행 되어야 합니다. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에 미리 진정 6 잘하고 24-잘 접시. 때 코트 접시 준비 얼음에 넣어. 4 x 희석 매트, 제거 하 고 다시 어떤 초과 솔루션을 사용 하 여 각 잘 코트. 30-60 분 동안 얼음에 두고 과잉 매트 발음. 코팅의 72 h 이내 3 h. 사용의 최소 37 ° C 5% CO 2 인큐베이터에서 매트 코팅된 접시 건조.
    10. 10%의 솔루션을 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 10 %w / v BSA 3-4 반장 4 병 빛 차단 및 저장소 2 µ m 필터와 소독 필터 4 ° C에서 얼음 처럼 차가운, 증류수, 이온을 제거 된 물에 용 해 하 여 ° c.
    11. 는 Ascorbic 산 성 솔루션을 준비합니다. 천천히 5 mg/mL 해결책 3-4 h. 소용돌이 해산 때까지 때때로 ice에 얼음 처럼 차가운, 증류수, 이온을 제거 된 물에 L-아 스 코르 빈 산의 분해. 필터 2 µ m 필터와 소독 및 보관-20에서 aliquots ° c.
    12. 과 IMDM:Ham의 솔루션을 제작 하 여 혈 청 무료 차별화 (SFD) 미디어 준비 ' s F-12, 0.5 %BSA, B27, 및 0.5 x N2 보충 x 1을 추가 합니다. 저장소 4 ° C. 추가 1 x L-글루타민, 50 µ g/mL 의약품, 400 µ M MTG, 150 µ g/mL 홀로 처리가 즉시 이전 사용.
    13. 제조 업체 당 줄기 세포 세럼 무료 문화 미디어 (예를 들어, StemPro, 라고도 SP34 hereon) 준비 ' s 지시. 저장소 4 ° C. 추가 1 x L-글루타민, 50 µ g/mL 의약품, 400 µ M MTG, 150 µ g/mL 홀로 처리가 즉시 이전 사용.
    14. 녹이는 콜라 ii 0.2 %w / v를 1:4 FBS:PBS 솔루션에서의 최종 농도에 0.2% 콜라 II 솔루션을 준비합니다. 적어도 15 분 2 µ m 필터 솔루션을 소독 및 보관-20에서 aliquots 필터에 대 한 37 ° C 물 목욕에 분해 ° c.
    15. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 버퍼를 준비 하는 5%의 솔루션으로 사용 하 여 즉시 이전 IMDM에서 FBS.
      16. Α-MEM, 20 %FBS, 2 m L-글루타민, m의 솔루션으로
    16. 준비 OP9 미디어 및 1 x 항생제. 2 µ m 필터와 소독을 4 저장 필터 ° c.
    17. 이전 aliquoted 3 mL 수량 또는 100 mL 병으로 스 기반 미디어 (예를 들어, MethoCult, 라고 멕 hereon)를 얻을. 100ml, MeC, 도착 시 사용 하는 경우 2.5 mL aliquots 14 mL 원뿔 튜브에 나눕니다.
      참고: 모든 aliquots aliquots 즉시 이전에 해빙 한다-20 ° C. 멕 매체에 저장 한다 사용.

2. HPSCs의 mesoderm 차별화

  1. 성장에서 hPSC 셀 라인 MEFs에 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 70-80 %confluency.
    참고: hPSCs는 날카로운 undifferentiated 테두리 있어야.
  2. 준비 매트 코팅 plasticware 뿌리고는 hPSCs 전에 24 h.
    참고: 매트 코팅 6-잘 접시의 총 수는 hPSC 라인에 걸쳐 다릅니다. 일반적으로, 3 6 잘 요리 MEFs에 confluent hPSCs의 6-잘 접시 당 충분 하다. 얼마나 많은 매트 코팅 6 잘 요리 후속 차별점 사용 해야 확인 하려면 첫 번째 차별화 하기 전에 confluent hPSCs:MAT 웰 스 (1:4, 1:3, 1:2, 등)의 다른 비율
    1. 수행 재판 급지대 고갈.
      참고: 매트는 hPSCs에 도금 후 24 h 크기에 약 10-20 셀의 셀 덩어리와 함께 80-90% 합칠 되어야 합니다.
  3. HPSC 미디어를 발음 하 고 37 ° C 0.25% 트립 신-EDTA 각 1 분 Aspirate에 대 한 고 1 mL 중지 미디어를 각 잘 추가 1 개 mL를 추가. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시에서 셀 다쳤어요. 각 잘 1 mL 워시 버퍼 추가.
    1. 2 mL 혈 청 학적인 피펫으로와 triturate 3-5 번 셀의 큰 덩어리를 휴식과 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송. 5 분에 대 한 330 x g에서 hPSCs 원심
  4. 사용할 수 매트 코팅 plasticware의 당 2 mL에 해당 hPSC 미디어의 전체 볼륨에 셀을 resuspend. 2 mL/hPSCs의 잘은 plasticware를 추가 하 고 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 밤새 품 어.
  5. 24 시간 후, 미디어를 발음 하 고 37 ° C 0.05 %1 분에 대 한 트립 신-EDTA 트립 신-EDTA를 발음 하 고 1 mL 중지 미디어 추가. 셀 스 크레이 퍼와 함께 적극적으로 세포를 다쳤어요. 각 잘을 1 mL 세척 미디어를 추가 합니다. 2 mL 혈 청 학적인 피펫으로 triturate 셀 1-2 회와 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 5 분에 대 한 220 x g에서 세포를 원심
    참고: 트립 신-EDTA 치료 수 오의 시간의 길이ld는 각 hPSC 라인에 대 한 조사에 의해 결정 됩니다. 트립 신 처리 단일 셀 분리를 야기 하지 않고 가능한 오랫동안 적용 되어야 한다. 이 단계 매트 코팅 접시에서 모든 hPSCs를 분리 해야 하지만 단일 셀 분리 발생 하지. 결과 EBs는 평균 6-10의 세포, 이어야 한다.
  6. 미디어 발음. 5 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 부드럽게 20 mL 세척 미디어 셀 resuspend. 5 분에 대 한 220 x g에서 원심 분리기
  7. 부드럽게 하루 0 미디어 (표 1)에 EBs를 resuspend. 차별화 미디어 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 6-잘 낮은 부착 세포 문화 접시의 각 음에 포함 하는 EBs의 2 개 mL를 분배. 장소는 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (멀티 가스) 인큐베이터에.
    참고: 0 미디어: SFD 미디어 10 ng/mL BMP4 보충 (표 1). HPSCs의 모든 두 접시, 한 6-잘 낮은 부착 세포 문화 접시 사용.
  8. 24 시간 나중에, 추가 2 mL 1 일 미디어 (표 1). 멀티 가스 인큐베이터에서 하룻밤 셀을 품 어.
    참고: 1 일 미디어: SFD 미디어 10 ng/mL BMP4와 각 음 (표 1)을 10 ng/mL bFGF 보충.
  9. 후, 18 h는 부드럽게 5 mL 혈 청 학적인 피펫으로와 스핀에서 100 x g 5 분 세척에 대 한 EBs를 수확 하 고 10 mL IMDM 전체 문화를 결합. 5 분 Aspirate는 미디어에 대 한 100 x g에서 스핀.
    참고: 파편 문화에 존재 합니다. 낮은 속도 (100 x g)에서 원심 분리 단계가 파편을 제거 합니다.
  10. 부드럽게 SFD 미디어 주 2 미디어 (표 1), 보충에 EBs를 resuspend 하 고 6-잘 낮은 부착 세포 배양 배지로 잘 당 2 mL를 분배. 30 h. 위해 37 ° C 멀티 가스 인큐베이터에서 품 어
    참고: 주 2 미디어: 10 ng/mL BMP4, 그리고 5 ng/mL bFGF, 그리고 적절 한 WNT 주 작동 근 또는 길 항 근 (표 1).
    1. 추가 3 µ M 확실 한 조 혈 창시자를 지정 하는 CHIR99021. 3 µ M 또는 추가 IWP2 및 1 ng/mL Activin A 원시 조 혈 창시자 지정.
  11. 계속 조 혈 原 사양 섹션 3.

3. CD34의 사양 + 조 혈 창시자

  1. 30 h 후 격리와 차별화의 3 일에 2 mL 혈 청 학적인 피펫으로 EBs. 50 mL 원뿔 튜브에 전송 및 5 분 부드럽게 resuspend와 IMDM의 10 mL로 씻어 330 x g에서 원심. 330 x g 5 분에 다시 세포를 원심
  2. 3 일 미디어 (표 2)에 EBs를 resuspend 하 고 낮은 부착 6 잘 플레이트의 각 음에 2 mL를 분배. 셀에 72 h. 위해 37 ° C 멀티 가스 화기를 품 어
    참고: 주 3 미디어: SP34, 15 ng/mL VEGF와 5 ng/mL bFGF (표 2) 보충. 차별화의 3 일에 수확 하는 미디어의 산도 (즉, 노란색-오렌지 미디어) 변경 크게 잘 당 더 많은 미디어를 추가 합니다. 또는 사용 하 여 적은 EBs 잘 당 하루 0.
  3. 후 72 h 외피의 각 음을 하루 6 미디어 (표 2)의 2 개 mL를 추가 합니다. 추가 48 h. 위해 37 ° C 멀티 가스 인큐베이터에서 품 어
    참고: 주 6 미디어: SP34 미디어와 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPO, 20 ng/mL 일리노이-6, 10 ng/mL IL-11, 50 ng/mL IGF-1 (표 2) 보충. 더 많은 미디어 단계 3.1에서에서 추가 된 경우 다음 추가 미디어의 상응 하는 금액 3.2 단계에서 최종 사이토카인 농도 동일 하 게 유지.
  4. 는 차별화의 날 8 CHIR99021 처리 EBs 격리합니다. 제 4 이동.
  5. IWP2-대우 EBs는 50 mL 원뿔 관으로 분화의 8 일에 수확 하 고 있다. 5 분에 대 한 330 x g에서 원심 분리기는 부드럽게 하루 8 미디어 (표 2)에서 resuspend. 낮은 부착 요리에서 37 ° C 5% CO 2 인큐베이터에서 24 h에 대 한 품 어. 제 4 이동.
    참고: 주 8 미디어: SP34 미디어 100 ng/mL SCF와 2 IU EPO, 10 ng/mL 일리노이-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L, 30 ng/mL IL-3 (표 2) 보충.

4. 효소 분리의 EBs 및 조 혈 原 절연

  1. 분리 혈 청 학적인 피펫으로 50ml 원뿔에 EBs 튜브. 5 분 Aspirate는 상쾌한 오프에 대 한 330 x g에서 원심 분리기.
  2. 는 EBs에 0.25 %Trypsin-EDTA의 2 개 mL를 추가합니다. 8 분 추가 5 ml 정지 솔루션의 37 ° C 물 욕조에 5 미 품에 대 한 소용돌이. 5 분 Aspirate는 상쾌한 오프에 대 한 330 x g에서 원심 분리기.
  3. 콜라 II의 5 ml에서는 EBs를 resuspend. 5 소용돌이 s 고 37 ° C 물 욕조에 품 어. 60 분, 5 소용돌이 후 s 정지 솔루션의 5 mL을 추가. 330 x g 5 분 Aspirate는 상쾌한 오프에서 스핀.
  4. 1 mL FACS 버퍼의 셀 resuspend. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포를 전달 합니다. 이 모든 undissociated 세포 덩어리를 제거 합니다.
  5. 셀을 계산합니다. 14 mL 원뿔 튜브에 aliquot 1 x 10 6 셀. 330 x g 5 분 Resuspend에서 셀 FACS 버퍼에서 5 x 10 6 셀/mL의 농도에서 세포를 스핀. 흐름 cytometric 컬러 컨트롤에 대 한 각 조건에서 셀의 약 수와 수영장 10%. 어둠 속에서 얼음에 30 분에 대 한 항 체에서 세포를 품 어.
    : 참고 테이블의 자료에 fluorophore 조합 제안.
    1. IWP2에 대 한 치료 셀 안티 CD34 및 안티-CD43 항 체 사용.
    2. CHIR99021에 대 한 치료 셀 안티 CD34, 안티-CD43, 안티-CD73, 및 안티-CD184 항 체 사용.
  6. FACS 버퍼를 사용 하 여 두 번 셀 린스. 5 분 Resuspend 5 x 10 6 셀/mL의 최종 농도에 세포에 대 한 330 x g에서 회전.
  7. 분석 또는 격리 cytometry에 의해 세포입니다. 원시 조 혈 창시자에 대 한 분석 CD34 그리고 CD43 식 ( 그림 2A). 확실 한 조 혈 창시자에 대 한 그 격리 (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) FACS ( 그림 2B)에 의해. 튜브 냉장된 FACS 버퍼를 포함 하는 셀을 수집.
  8. 에서 확실 한 조 혈 잠재력을 평가 하기 위해 그 절연, 내 피-하-조 혈 전환에 대 한 섹션 5 또는 7 T-림프 분석 결과 대 한 계속. 원시 조 혈 연합사 분석 실험, 계속 섹션 6.

5. 내 피-하-조 혈 전환

  1. 스핀 격리 된 CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − 5 분에 대 한 330 x g에서 셀 Resuspend 그 셀에서 200, 000 셀/mL (미디어 표 2). 50 µ L aliquots 96 잘 낮은 부착 세포 문화 접시에 있는 셀을 배포 합니다. 품 어는 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 멀티 가스 인큐베이터에서 하룻밤 셀.
    참고: 그는 미디어: SP34 미디어 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL 일리노이-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL 일리노이-3, 보충10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL 쉬, 10 µ g/mL Angiotensin II, 및 2 × 10 5 셀/mL (표 2)에서 100 µ M Losartan 칼륨.
  2. 24 잘 매트 코팅 판 (단계 1.2.7.1 참조), 필요에 따라 준비.
  3. 셀 집계 합니다 6-10의 세포의 덩어리에 하룻밤. Reaggregated 셀 각 50 µ L 볼륨, 부드럽게 전송 셀 24-잘 매트 코팅 접시의 중앙에 다음 날 아침에. 셀 연결 된 때까지 4-6 시간, 37 ° C 멀티 가스 인큐베이터에 접시를 부드럽게 장소.
  4. 셀 연결 후 각 음을 신선한 그 미디어의 1 mL를 추가 합니다. 조 혈 모 세포를 볼 수 있습니다 때까지 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 멀티 가스 인큐베이터에 셀을 품 어 (일반적으로 5-7 일; 그림 2D)입니다. 아래 100 배 확대 가벼운 현미경을 사용 하 여 시각화.
  5. 부드럽게 셀에서 그 미디어를 제거 하 여 확실 한 조 혈 창시자를 수확. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해이 미디어를 전달 하 고 수집 합니다. 에 잘 부착 세포 추가 0.5 mL 0.25% 세포를 트립 신-EDTA와 5 분 추가 0.5 mL 정지 솔루션을 각 영역에 대 한 37 ° C에서 품 어. 함께 모든 점착 풀을 동일한 40 µ m 셀 여과기를 통해 세포와 비 부착 한 세포를 통해 전달 합니다. 5 분에 대 한 330 x g에서 스핀
    1. 섹션 6에 진행이 대량 문화의 CFC 잠재력을 평가 하.
  6. 셀 FACS 버퍼에 두 번 세척. 5 분에 대 한 330 x g에서 회전
  7. Resuspend 5 x 10 6 셀/mL에 FACS 버퍼에 셀. 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 안티 CD45 및 안티 CD34 항 체와 세포 얼룩 (fluorophores 테이블의 재료에 제안).
  8. 셀 FACS 버퍼에 두 번 세척. 5 분에 대 한 330 x g에서 회전
  9. 격리는 CD34 + CD45 + FACS ( 그림 2E)에 의해 세포. 냉장된 FACS 버퍼에 셀 정렬.
  10. 확실 한 CD34 평가 + CD45 + 필요한 (CFC 분석 결과 제 6, 7, 림프 잠재력 또는 다른 탐정 시작 분석 결과)로 조 혈 창시자.

6. 연합사 분석 결과

  1. 녹여 CFC 분석 결과 대 한 사용 하는 각 샘플에 대 한 멕 aliquots.
  2. 멕 분석 (단계 4.5, 4.7, 5.5, 또는 5.9) 되도록 셀을 추가 합니다. 소용돌이 철저 하 고 제조 업체에 따라 기포 분산 될 때까지 5-10 분에 대 한 멕 문화 서 ' s 지시. 16를 사용 하 여 ½ 3 mL 주사기에 바늘 계기, 멕의 2 개 mL를 조심 스럽게 제거.
    참고: 일반적인 도금 밀도 범위 1000-20000 셀/mL, 예상된 조상 주파수에 따라에서.
  3. 신중 하 게, 1 mL 멕 셀 혼합 두 35 m m 조직 문화 접시의 각 분배. 균등 하 게 부드럽게 고 접시를 회전 하 여 35mm 요리에 MeC를 배포 합니다. 각 장소는 15 cm 조직 문화 접시에 위의 요리는 물으로 가득합니다. 37 ° C 5% CO 2 배양 기에서 품 어.
  4. 멕 문화 40 X 확대를 사용 하 여 가벼운 현미경을 사용 하 여 시각화. 얻은 다양 한 Cfc 계량. 분석 기본 연합사 분석 실험 ( 그림 2C) 도금 후 8-10 일. 도금 후 14 일 최종 연합사 분석 실험 분석. 대표 연합사 분석 결과 식민지 형태학 그림 2 층에서 볼 수 있습니다.

7. T 세포 분석 실험 설정 최종 조 혈 잠재적인 하

    ,를 100 m m 조직 문화 접시 30 합칠 때까지 세포 성장 OP9 DL4 31 ,
  1. 32.
    1. thaw OP9 DL4 세포 T 세포 분석 실험을 도금 하기 전에 72 96 h. 10 ml OP9 미디어 OP9 DL4 셀 resuspend 및 10 cm 격판덮개로 분배. 70-90% 합칠 때까지 37 ° C 5% CO 2 배양 기에서 성장.
    2. 100 mm 접시에서 OP9 DL4 세포를 수확 하는 미디어를 제거 하 고 추가 5 mL 0.25 %5 분에 대 한 트립 신-EDTA 5ml OP9 미디어와 트립 신 활동을 중지. 회전 5 분 Resuspend에 대 한 330 x g에서 셀 1 mL OP9 미디어에서에서 셀 및 셀.
      참고: 한 10 cm 접시 confluent OP9 DL4 셀의 얻을 것입니다 약 10 x 10 6 OP9 DL4 셀.
    3. 48 h T 세포 분석 실험, 플레이트 2 x 10 6 셀 12 mL OP9 이전 미디어 24-잘 접시 (0.5 mL/음). 37 ° C 5% CO 2 배양 기에서 성장.
  2. 2000-10000 셀 (으로 단계 4.5, 4.7, 5.5, 또는 5.9) 분석을 보충 OP9 미디어 OP9 DL4 셀의 1을 추가: 30 ng/mL SCF (처음 6 일의 경우에), 5 ng/mL 일리노이-7, 그리고 5 ng/mL FLT3 L. 품 어 37 ° C 5% CO 2 inc ubator입니다. 이 단계에서 발생 하는 미디어 변경.
  3. 모든 4-5 일, 6-잘 접시에 신선한 OP9 DL4 stromal 세포 T 세포 창시자 통로. 1 mL를 피펫으로 셀 triturate 고 수 풀 제거를 40 µ m 필터를 통해 전달 합니다. 미디어에서 5 분 Aspirate에 대 한 330 x g에서 회전 합니다. 5 ng/mL 일리노이-7 5 ng/mL Flt3-L, 및 신선한 OP9 DL4 셀에 보충 하는 신선한 OP9 미디어의 2 mL에 셀 resuspend.
    참고: 이전에 뿌리고, 48 h 12 ml OP9 미디어, 2 x 10 6 신선한 OP9 DL4 셀 접시 및 6-잘 접시에 2 mL/잘 배포.
  4. 적어도 21 일 후 공동 문화, 적극적으로 triturate는 세포와 세포 파편을 제거 하는 40 µ m 필터를 통해 전달. 5 분 동안 330 x g에서 회전 하 고는 상쾌한 발음.
  5. 셀 차가운 FACS 버퍼에 두 번 세척. 5 분에 대 한 330 x g에서 회전
  6. Resuspend 5 x 10 6 셀/mL에 FACS 버퍼에 셀. 얼룩 (조합 재료의 테이블에에서는 제안된 fluorophore) 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 안티 CD45, CD56 안티, 안티-CD4, 및 안티-CD8 항 체와 세포. 라이브/죽은 세포 얼룩 (DAPI, 등) 분석에서 파편을 제거 하려면 적용.
  7. 셀 FACS 버퍼에 두 번 세척. 5 분에 대 한 330 x g에서 회전
  8. T-림프 구 창시자 ( 그림 3)의 존재를 평가 하기 위해 교류 cytometer를 사용 하 여 셀을 분석.

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결과

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HPSCs에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 창시자의 유도 묘사한 회로도 그림 1에서 그림입니다. Mesoderm 정식 WNT 차별화, 조 혈 原 사양에 따라 2-3 일 동안 발생 하는 신호에 의해 패턴.

대표적인 흐름 cytometric 분석 및 스 분석 실험 조 혈 차별화 hPSC 파생 된 문화를 형성 하는 식민지는 그림 2에 표시 됩니다. IWP2 대우 차별화 문화 고유 CD34 보장할+CD43− 와 CD34낮은 /−CD43+ 인구, 그러나 CHIR 처리 차별화 문화 해야한다 <<...

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토론

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이 프로토콜 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 분화에 대 한 빠른, 혈 청, 기질-없는 방법을 설명합니다. 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 mesodermal 규격은 유일 하 게 정식 WNT 신호 전달의 분자 억제제를 이용 하는 우리의 프로토콜을 사용 하 여 안정적으로 얻을 수 있습니다. 반면 PORCN 억제제 IWP234 에 의해 WNT 억제 지정 원시 조 혈 mesoderm26단계 관련 WNT 활성화 GSK3β 억제제 CHIR9902133 에 의해 확실 한 조 혈 mesoderm 상승을 제공 합니다. 메모의이 방법은 튼튼하게 주지 않는다 상승 engraftable HSC 같은 인구 (표시 되지 않음). 그러나,이 방식으로 생성 하는 확실 한 조 혈 창시자는 그들의 잠재적인 미래에 변환 응용 프로그램을 강조 transgene 유도 engraftment 잠재적인35

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 부의 내과, 혈액 부, 워싱턴 대학의과 대학에 의해 지원 되었습니다. CD는 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소에서 T32HL007088에 의해 지원 되었다. CMS는 혈액학 학술 상을의 미국 사회에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Iscove의 변형 Dulbecco's Medium (IMD)Corning10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell ratedGemini Bioproducts100-500
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30396.03
L-glutamine, 200 mM 용액Life Technologies25030-081
페니실린-스트렙토마이신Life 기술15070-063
0.25% 트립신-EDTA생명 기술25200056
0.05% 트립신-EDTA생명 기술25300054
젤라틴, 돼지 피부, A형시그마-알드리치G1890
알파-MEM생명 기술12000-022
DMEM-F12코닝10-092-CV
녹아웃 혈청 교체Life Technologies10828028"KOSR"
비필수 아미노산(NEAA)Life Technologies11140050
b-메르캅토에탄올, 55mM 용액Life Technologies21985023
염산Sigma-AldrichH1758
Fraction V, 소 혈청 알부민Fisher ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2 보충제Life Technologies17502048
B27 보충제, 비타민 A없음 Life Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
성장 인자 감소 MatrigelCorning354230"MAT"
-흡수산시그마-알드리치A4403
인간 혈청 트랜스페린시그마-알드리치10652202001
모노티오글리세롤(MTG)시그마-알드리치M6145
콜라겐분해효소 B로슈11088831001
콜라겐분해효소 II라이프 테크놀로지17101015
DNaseICalbiochem260913
인산염 완충 식염수(PBS)생명 기술14190144
bFGFR& D 시스템233-FB
BMP4R & D 시스템314-BP
액티브 AR & D 시스템338-AC
VEGFR & D 시스템293-VE
SCFR& D 시스템255-SC
IGF-1R& D 시스템291-G1
IL-3R& D 시스템203-IL
IL-6R& D 시스템206-IL
IL-7R& D 시스템207-IL
IL-11R& D 시스템218-1L
TPOR& D 시스템288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 리간드(FLT3-L)R& D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensin IISigma-AldrichA9525
Losartan PotassiumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4BD Biosciences560650희석 1:100; T 세포 분석
CD8 PE 클론 RPA-T8BD Biosciences561950희석 1:10; T 세포 분석
CD34 APC 클론 8G12BD Biosciences340441희석 1:100; EHT 분석
CD34 PE-Cy7 클론 8G12BD Biosciences348801희석 1:100; 혈인성 내피
CD43 FITC 클론 1G10BD Biosciences555475희석 1:10; 혈인성 내피
CD45 APC-Cy7 클론 2D1BD Biosciences557833희석 1:50; T 세포 분석
CD45 eFluor450 클론 2D1BD Biosciences642284희석 1:50; EHT 분석
CD56 APC 클론 B159BD Biosciences555518희석 1:20; T 세포 분석
CD73 PE 클론 AD2BD Biosciences550257희석 1:50; 혈인성 내피
CD184 APC 클론 12G5BD Biosciences555976희석 1:50; 혈인성 내피
4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)BD Biosciences564907희석 1:10,000; T 세포 분석
OP9 DL4 세포Holmes, R. 및 JC Zuniga-Pflucker. 콜드 스프링 Harb 프로토콜, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q 정수 시스템EMD Millipore
5% CO2 인큐베이터37°C에서 설정
멀티가스 인큐베이터37°C에서 설정, 5% CO2, 5% O2
6웰 조직 배양 플레이트Corning353046
24웰 조직 배양 플레이트Corning353226
6웰 저접착 조직 배양 플레이트Corning3471
24웰 저접착 조직 배양 플레이트Corning3473
35mm 조직 배양 접시Corning353001
블런트 엔드 니들, 16 게이지Corning305198
3cc 주사기Corning309657
5 mL 폴리프로필렌 시험관Corning352063
5 mL 폴리스티렌 시험관Corning352058
15 mL 폴리프로필렌 원뿔Corning430791
50 mL 폴리프로필렌 원뿔Corning430921
2 mL 혈청학적 피펫Corning357507
5 mL 혈청학적 피펫Corning4487
10 mL 혈청학적 피펫Corning4488
25 mL 혈청학적 피펫Corning4489
세포 스크레이퍼Corning353085
2.0 mL cryovialCorning430488
5 mL 시험관(40 µ 포함); M 세포 여과기Corning352235
40 µ M 세포 여과기Corning352340
세포 배양 원심 분리기
Biosafety hood
FACS AriaII 또는 동급
LSRii 또는 동급
FlowJo 소프트웨어TreeStar
수조37°C
로 설정0.22 & 마이크로; M 여과 시스템코닝
오토클레이브
4 C 냉장고
- 20 C 냉장고
- 80 C 냉장고
L스 형 형

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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