수용액에서 킬레이트화되지 않은 가돌리늄(III) 이온을 감지하기 위한 폴리데옥시뉴클레오티드(44-mer aptamer) 분자의 사용에 대해 설명합니다. 이온의 존재는 센서의 형광 방출의 증가를 통해 감지됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
수용액에서 킬레이트화되지 않은 3가 가돌리늄 이온(Gd3+)의 존재를 결정하는 방법이 시연됩니다. Gd3+는 종종 리간드와 이온 사이의 불완전한 반응의 결과 또는 해리 산물로 가돌리늄 기반 조영제 샘플에 존재합니다. 이온은 독성이 있기 때문에 검출이 매우 중요합니다. 여기에서는 Gd3+용 압타머 기반 센서(Gd-sensor)의 설계 및 사용에 대해 설명합니다. 센서는 이온 농도 증가에 대한 반응으로 형광 변화를 일으키며 나노몰 범위(신호 대 잡음비 3, ~100nM)에서 검출 한계가 있습니다. 분석은 384웰 마이크로플레이트의 주변 pH(~7 - 7.4)에서 수성 완충액에서 실행할 수 있습니다. 이 센서는 나트륨, 칼륨 및 칼슘 이온과 같은 다른 생리학적으로 관련된 금속 이온에 대해 상대적으로 반응하지 않지만, 유로퓸(III) 및 테르븀(III)과 같은 다른 3가 란탄족에 비해 Gd3+에 특이적이지는 않습니다. 그럼에도 불구하고, 란탄족은 조영제 또는 생물학적 시스템에서 일반적으로 발견되지 않으며, 따라서 센서는 수성 조건에서 킬레이트화되지 않은 Gd3+를 선택적으로 측정하기 위해 사용될 수 있습니다.
서론
기술의 고유의 감도에 의해 제한된다 임상 진단에서 자기 공명 영상 (MRI)의 중요성이 증가는 신규 가돌리늄 계 조영제 (GBCAs 1)의 개발에 대한 연구의 빠른 성장을 가져왔다. GBCAs은 이미지 품질을 개선하기 위해 투여되는 분자이며, 그들은 일반적으로 여러 자리 리간드에 배위 3가 가돌리늄 이온 (하나님 3+)의 화학 구조를 갖는다. 이 복합체는 독성 3+ unchelated 하나님으로 매우 중요합니다; 이는 신장 질환 또는 장애이 일부 환자에서 신원 성 전신 섬유증의 발병과 연관되어있다. 따라서, 수성 자유 이온을 검출하는 GBCAs의 안전을 확보하는 수단이있다. GBCA 솔루션 unchelated 하나님 3+의 존재는 종종 리간드 및 이온 복합체의 해리 또는 displacemen 간의 불완전한 반응의 결과다른 생물학적 금속 양이온 (3)에 의한 t.
현재 하나님 3+, 융통성 및 적응성 (4)의 측면에서 크로마토 그래피 및 / 또는 분광 최고 순위를 의존들의 존재를 결정하기 위해 사용하는 여러 기술 중. 강점 중 높은 감도 및 정확도 (리스트를, 복수 하나님 3+....
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프로토콜
참고 : 분자 생물학 수준의 물이 모든 버퍼 및 솔루션 준비에 사용됩니다. 모든 일회용 튜브 (마이크로 원심과 PCR) 및 피펫 팁 DNase-과의 RNase-무료입니다. 사용하기 전에 모든 화학 물질에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 사용하는 것이 좋습니다.
앱타 머는 재고 솔루션 1. 준비
- 상업적으로 polydeoxynucleotide의 2 가닥을 구입합니다. 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)로 정제와 두 가닥을 주문한다.
1 (GD-앱 타머를) 가닥 :
5 '- / 56 FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
스트랜드 2 (QS) :
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - 하나님 - 앱 타머 및 QS 100 μM 각각의 원액을 물에 각각의 가닥을 녹인다.
- -20 ° C에서 이러한 솔루션을 저장합니다. 솔루션은 지금까지 3 년 동안 안정하다.
- FREEZ을 최소화하기 위해전자 해동 사이클, 10 μL 씩의 주식 솔루션을 저장합니다.
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결과
unchelated 하나님 3+의 존재 GD-센서 용액의 전형적인 형광 변화는도 2에 도시되어있다. 방출은 형광 배 변화 (그림 2A) 또는 임의의 단위로 읽기 원시 형광 (그림 2B)로 나타내 어질 수 (AFU). 두 플롯> 3 μM에서 신호의 1 μM 및 채도 아래 하나님의 농도에 대한 선형 범위 3+와 매우 유사 교정 곡선을 얻었다. 검출 한계는 3 신호대 잡음비와 ~ 100 ㎚이다.
관심 GBCA를 함유하는 용액에서 unchelated 하나님 3+의 존재는 "빈"솔루션에 비해 센서의 형광의 증가로 변환된다. 하나님-DOTA 단지, 다른 것보다 더 높은 순도의 하나의 2 개의 다른 배.......
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토론
앱타 머는 기반 GD-센서 관측 unchelated 하나님 3+의 농도에 비례하는 형광 방출의 증가 사용. 사용한 시료의 양을 최소화하기 위해, 분석은 웰 당 45 μL의 총 샘플 부피의 384 웰 마이크로 플레이트에서 실행될 수있다. 이 설계에서, 플루오 레세 인 (FAM) 및 dabcyl DAB ()의 선택은 주로 시약의 비용에 기초 하였다 발광 파장, 형광의 다른 쌍을 수정 및 소광 제 (11)를 사용할 수있다.
이것은 센서 최상의 결과를 얻을 것을 주목하는 것이 중요하다 중요한 단계 중 하나는 GD-앱 타머 및 QS 사이의 최적의 하이브리드 화를 달성하는 분석 완충액에서 95 ° C 및 서냉 (단계 2.4)에 대한 가열은 가닥. 이전의 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 열 순환기를 사용할 수없는 경우, 95 ℃에서 항온 수조에서 수행 될 수있다. 제어하는 또 다른 주요 매개 변수는 t입니다그 버퍼 용액의 조성; 조영제를 용해 단계 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
귀중한 과학적 의견을 제시해 주신 뉴욕 컬럼비아 대학의 Milan N Stojanovic 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 California State University East Bay(CSUEB)와 CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher의 자금 지원을 받습니다. O.E., T.C. 및 AL은 CSUEB CSR(Center for Student Research) 펠로우십의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Gd-aptamer | IDTDNA | 입력 서열 및 형광단 변형 순서 형태 | : 방출 파장이 다른 형광단을 사용할 수 있습니다. 압타머는 다른 회사에서 주문할 수도 있습니다. |
| 담금질 가닥 | IDTDNA | 주문 형태의 입력 서열 및 담금질 변형 | 형광단과의 최적 에너지 전달을 위한 다른 담금질제가 사용될 수 있습니다. 압타머는 다른 회사에서 주문할 수도 있습니다. |
| 분자 생물학 등급 물 | 특정 제조업체 없음, DEPC 또는 비 DEPC 처리 모두 똑같이 잘 작동합니다 | ||
| 가돌리늄 (III) 염화물 무수 | 스트렘 | 936416 | 독성 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| 염화 마그네슘 무수 | MP Biomedicals | 0520984480 - 100g | |
| 염화나트륨 | Acros 유기물 | ||
| 염화칼 | Fisher Scientific | P333-500 | |
| 수산화나트륨, 펠릿 | Fisher Scientific | BP359 | 부식성 |
| 염산 | Fisher Scientific | SA49 | 독성 및 부식성 |
| 384웰 낮은 플랜지 검은색 평면 바닥 폴리스티렌 NBS 플레이트 | Corning | 3575 | 플레이트 독서가 필요합니다. |
| Nalgene Rapid-Flow 멸균 일회용 보틀 탑 필터 | Thermo Scientific | 5680020 | 보틀 탑에는 0.2 미크론 PES 멤브레인이 장착되어 있습니다 |
| 일회용 멸균 병 250 mL | Corning | 430281 | 크거나 작은 병을 사용할 수 있습니다 |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | DNAse 및 RNAse가 없는 | ||
| 0.2 mL PCR 튜브 | 인 경우 특정 제조업체 없음DNAse 및 RNAse가 없는 | ||
| Micropipets | 특정 제조업체 없음 | ||
| 적절한 크기의 | DNAse 및 RNAse가 없는 | ||
| 한Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | 다른 제조업체의 플레이트 리더도 똑같이 잘 작동합니다 |
참고문헌
- Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).
- Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for car....
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재인쇄 및 허가
