단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질-단백질 상호 작용은 수천 개의 세포 과정에 관여하며 뚜렷한 공간적 맥락에서 발생합니다. 전통적으로 공동 면역침전법(co-immunoprecipitation)은 단백질과 단백질의 상호작용을 검출하는 데 널리 사용되는 기법입니다. 후속 웨스턴 블롯 분석은 공동 면역침전된 단백질을 시각화하는 가장 일반적인 방법입니다. 최근에는 근접 결찰 분석법이 in situ 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하는 강력한 도구가 되었으며 이 방법으로 단백질-단백질 상호 작용을 정량화할 수 있는 가능성을 제공합니다. 기존의 면역세포화학과 유사하게, 근접 결찰 분석 기법은 항원에 대한 1차 항체의 접근성을 기반으로 하지만, 이와 대조적으로 근접 결찰 분석법은 롤링 서클 PCR을 포함하는 고유한 기법으로 단백질-단백질 상호 작용을 검출하는 반면, 기존 면역세포화학은 단백질의 공동 국소화만 보여줍니다.
핵 인자 90 (NF90) 및 RNA 결합 모티프 단백질 3 (RBM3)은 이전에 상호 작용 파트너로 입증되었습니다. 이들은 주로 핵에 국한되어 있지만 세포질로 이동하여 세포질 구획의 신호 전달 경로를 조절하기도 합니다. 여기에서는 공동면역침전(co-immunoprecicipation) 및 근접 결찰 분석(proximity ligation assay)을 통해 핵과 세포질 모두에서 NF90-RBM3 상호작용을 비교했습니다. 또한 공간 분포 및 단백질-단백질 상호 작용의 특성과 관련하여 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하는 데 있어 이 두 기술의 장점과 한계에 대해 논의했습니다.
서론
핵 인자 90 (NF90)은 인터루킨 -2 후 전사 및 miRNA의 생합성 1-3의 규제의 바이러스 감염에 대한 반응 조절 등 다양한 기능을 가진 멀티 이소 단백질이다. RBM3는 RNA 결합 단백질 번역 및 miRNA의 생합성에 관여 저체온증 저산소증 4-6을 포함하는 다양한 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 최근에, 우리는 단백질 복합체 7 NF90 및 RBM3를 발견했다. NF90 RBM3과의 상호 작용은 단백질 펼친 응답 7 단백질 키나제 RNA 같은 소포체 키나제 (PERK) 활성을 조절하는 것이 필수적이다. NF90 및 RBM3 모두 핵하지만 세포질에 작은 NF90의 비율과 RBM3 셔틀에 주로 위치하며, PERK 활동을 조절하는 특정 기능을 위해 서로가 예를 결합한다. 따라서, 어느 것을 나타낼 수 있고, 세포 내 구획에서-NF90 RBM3 상호 작용의 분포를 시각화하는 것이 중요각각의 구획에서의 다양한 역할.
수십 년 전에, 효모 두 하이브리드 (Y2H)는 두 단백질 (8) 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 개발되었다. 그러나, 융합 단백질의 인공 건설, 거짓 양성 결과는이 방법의 적용을 제한하고있다. 오랫동안,....
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프로토콜
1. 공동 면역 침전
- 씨앗 하나 6 웰 플레이트에 웰 당 2 × 10 5 세포에서 HEK293 세포 2 ㎖의 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 함께 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) 보충 100 U / mL의 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균) .
- 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 세포를 성장.
- 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 5 분 500 XG에 원심 분리하여 수확 세포.
- 상업 핵 및 세포질 추출 시약을 사용하여 핵 및 세포질 분수를 준비합니다. 일부 수정과 제조업체의 지시 사항을 따르십시오.
- 하나의 공동 면역 실험 (한 6 웰 플레이트의 3 우물에서 약 90 %의 컨 플루)에 대한 3 × 10 6 세포를 사용합니다. 최고 속도로 15 초 동안 300 μl의 차가운 세포질 추출 용액 (CER의 I)와 소용돌이를 추가합니다.
- 얼음에 30 분 동안 품어. 배양, vorte 중5 초마다 10 분 동안 X.
- 5 초 동안 16.5 μl의 차가운 세포질 추출 용액 II (CER II), 소용돌이를 추가하고 얼음에 5 분 동안 품어.
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결과
도 1 및 NF90 RBM3 모두 핵 단백질과 작은 부분이 세포질에 존재하는 것을 보여준다. 특히, RBM3에 대한 긍정적 인 스테인드 세 가지 밴드가 있습니다. 20 kDa의 아래 작은이 RBM3의 정확한 크기를 반영 (RBM3의 예측 분자량이 17 kDa의)입니다. 다른 두 밴드의 기원은 조사가 남아있다. 미끼 단백질로 RBM3와 공동 면역 침전 실험 NF90-RBM3 상호 작용은 핵 및 세포질에서 소수 민족에 주로 존재하는 것으로 나타났습니다. 공동 면역 침전 데이터는 각각의 단일 단백질의 현지화를 지원합니다.
도 2a에 도시 된 바와 같이, NF90 및 RBM3 주로 핵하지만 시튜 세포질에 위치한다. 두 단백질 모두 구획에 완벽한 공동 현지화을 보여줍니다. 근접 내고 분석은 패.......
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토론
두 방법에 대한 몇 가지 장점뿐만 아니라 단점이있다. 비교적 새로운 기술로서, 인접 결찰 분석법의 명백한 이점은 단일 세포 수준 대신 이기종 셀 배치의 단백질 - 단백질 상호 작용을 규명 할 수있는 가능성이다. 높은 크기 및 (공 초점 현미경으로 예) 해상도의 이미지는 하나의 형광 반점을 계산하여 정량화에 대한 가능성을 제공합니다. 대조적으로, 웨스턴 블랏과 공동 면역 침전 기술의 통상적 인 조합은 단지 적절한 로딩 컨트롤 IP 샘플에 대해 결정하기 곤란하기 때문에, 주로 단백질 밴드를 반 정량 할 수있다. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용은 공 면역 침전 또는 융합 태그 인공 과발현 시스템에 필요한 생체 물질, 예를 들어, 세포 또는 조직, 다량의 상호 작용을 검출 할 수있는 기회를 향상시키기 위해 적용되며, 약하거나 과도 때 . 또한, 검출 t이러한 질량 분석법 등의 고감도 echniques 실험의 품질을 향상시킬 수있다. 그러나, 원료의 양에 대하여 근접 결찰 정량법 명확한 이점을 갖는다.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 스위스 국립과학재단(SNSF, 31003A_163305)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 둘베코의 변형된 독수리' s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약 | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) 항체 | BD Transduction Laboratories | 612154 | WB의 경우 1:1,000, ICC/PLA |
| ProteinTech | 14363-1-AP | WB의 경우 1:1,000, ICC/PLA | |
| Lamin A/C 항체 | 세포 신호 전달 기술 | #2032 | WB에 1:1,000을 사용합니다. |
| 항-GAPDH 항체 | Abcam | ab8245 | 는 WB 에 대해 1:1,000을 사용합니다; |
| 일반 토끼 IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| 항토끼 IgG, HRP 연계 2차 항체 | 세포 신호 기술 | #7074 | WB 에 대해 1:5,000을 사용합니다; |
| 항-마우스 HRP 2차 항체 | Carl Roth | 4759.1 | WB 에 대해 1:5,000을 사용합니다. |
| Clarity Western ECL 블로팅 기질 | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS 시료 버퍼(4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer(20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE 전송 버퍼(20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF 멤브레인 | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8웰 배양 슬라이드 | Corning BioCoat | 354632 | |
| 파라포름알데히드(PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 염소 anti-mouse IgG (H+L 항체), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L 항체), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| 듀올링크 PLA 프로브 안티 래빗 MINUS | 시그마 | DUO92005 | |
| 듀올링크 검출 시약 레드 | 시그마 | DUO92008 | |
| 듀올링크 세척 버퍼 형광 | 시그마 | DUO82049 | |
| DAPI가 있는 듀오링크 장착 매체 | 그마 | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | 시그마 | 81381 | |
| 현미경 | 올림푸스 | AX-70 | |
| CCD 카메라 | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X선 필름 | Fujifilm | Super RX | |
| 필름 가공기 | Fujifilm | FPM-100A |
참고문헌
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization....
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