방법 논문

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및 현장에서 근접 내고 분석

DOI:

10.3791/55218

⸱

2017년 1월 16일

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

이 논문에서

요약

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단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

초록

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단백질-단백질 상호 작용은 수천 개의 세포 과정에 관여하며 뚜렷한 공간적 맥락에서 발생합니다. 전통적으로 공동 면역침전법(co-immunoprecipitation)은 단백질과 단백질의 상호작용을 검출하는 데 널리 사용되는 기법입니다. 후속 웨스턴 블롯 분석은 공동 면역침전된 단백질을 시각화하는 가장 일반적인 방법입니다. 최근에는 근접 결찰 분석법이 in situ 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하는 강력한 도구가 되었으며 이 방법으로 단백질-단백질 상호 작용을 정량화할 수 있는 가능성을 제공합니다. 기존의 면역세포화학과 유사하게, 근접 결찰 분석 기법은 항원에 대한 1차 항체의 접근성을 기반으로 하지만, 이와 대조적으로 근접 결찰 분석법은 롤링 서클 PCR을 포함하는 고유한 기법으로 단백질-단백질 상호 작용을 검출하는 반면, 기존 면역세포화학은 단백질의 공동 국소화만 보여줍니다.

핵 인자 90 (NF90) 및 RNA 결합 모티프 단백질 3 (RBM3)은 이전에 상호 작용 파트너로 입증되었습니다. 이들은 주로 핵에 국한되어 있지만 세포질로 이동하여 세포질 구획의 신호 전달 경로를 조절하기도 합니다. 여기에서는 공동면역침전(co-immunoprecicipation) 및 근접 결찰 분석(proximity ligation assay)을 통해 핵과 세포질 모두에서 NF90-RBM3 상호작용을 비교했습니다. 또한 공간 분포 및 단백질-단백질 상호 작용의 특성과 관련하여 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하는 데 있어 이 두 기술의 장점과 한계에 대해 논의했습니다.

서론

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핵 인자 90 (NF90)은 인터루킨 -2 후 전사 및 miRNA의 생합성 1-3의 규제의 바이러스 감염에 대한 반응 조절 등 다양한 기능을 가진 멀티 이소 단백질이다. RBM3는 RNA 결합 단백질 번역 및 miRNA의 생합성에 관여 저체온증 저산소증 4-6을 포함하는 다양한 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 최근에, 우리는 단백질 복합체 7 NF90 및 RBM3를 발견했다. NF90 RBM3과의 상호 작용은 단백질 펼친 응답 7 단백질 키나제 RNA 같은 소포체 키나제 (PERK) 활성을 조절하는 것이 필수적이다. NF90 및 RBM3 모두 핵하지만 세포질에 작은 NF90의 비율과 RBM3 셔틀에 주로 위치하며, PERK 활동을 조절하는 특정 기능을 위해 서로가 예를 결합한다. 따라서, 어느 것을 나타낼 수 있고, 세포 내 구획에서-NF90 RBM3 상호 작용의 분포를 시각화하는 것이 중요각각의 구획에서의 다양한 역할.

수십 년 전에, 효모 두 하이브리드 (Y2H)는 두 단백질 (8) 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 개발되었다. 그러나, 융합 단백질의 인공 건설, 거짓 양성 결과는이 방법의 적용을 제한하고있다. 오랫동안, 공동 면역 침전 특히 내인성 조건 9, 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는 주요 기술이다. 최고 감도 및 정밀도가 요구되는 경우, 질량 스펙트럼에서 사용되는 동안에 공동 면역 침전 된 단백질 복합체를 분석, 웨스턴 블롯, 가장 편리한 기술이다. 최근, 근접 결찰 분석은 동일계 10,11 모두에서 세포 및 조직에서의 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 신규 한 방법으로 개발되었다.

여기서는 NF9 캡처에서 가장 인기있는 공동 면역 침전 법 및 비교적 신규 근접 결찰 분석 방법에 비해세포 내 분수에 0 RBM3 상호 작용. 우리는 또한 장점과 두 가지 기술의 한계를 논의했다.

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프로토콜

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1. 공동 면역 침전

  1. 씨앗 하나 6 웰 플레이트에 웰 당 2 × 10 5 세포에서 HEK293 세포 2 ㎖의 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 함께 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) 보충 100 U / mL의 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균) .
  2. 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 세포를 성장.
  3. 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 5 분 500 XG에 원심 분리하여 수확 세포.
  4. 상업 핵 및 세포질 추출 시약을 사용하여 핵 및 세포질 분수를 준비합니다. 일부 수정과 제조업체의 지시 사항을 따르십시오.
    1. 하나의 공동 면역 실험 (한 6 웰 플레이트의 3 우물에서 약 90 %의 컨 플루)에 대한 3 × 10 6 세포를 사용합니다. 최고 속도로 15 초 동안 300 μl의 차가운 세포질 추출 용액 (CER의 I)와 소용돌이를 추가합니다.
    2. 얼음에 30 분 동안 품어. 배양, vorte 중5 초마다 10 분 동안 X.
    3. 5 초 동안 16.5 μl의 차가운 세포질 추출 용액 II (CER II), 소용돌이를 추가하고 얼음에 5 분 동안 품어.
    4. 4 ° C에서 5 분 동안 16,000 XG에 5 초 원심 분리기를위한 소용돌이.
    5. 새로운 사전 냉각 튜브에 뜨는 (세포질 추출물)를 전송하고, 사용까지 얼음에 보관하십시오.
    6. 때마다 최대 피펫 팅에 의해 5 배 아래로 1 ml의 차가운 PBS와 불용성 펠렛 (포함하는 핵)을 세 번 씻으십시오. 세척 후 PBS를 제거합니다.
    7. 15 초 동안 150 μl의 차가운 핵 추출 용액 (NER), 소용돌이를 추가하고 얼음에 1 시간을 품어. 배양하는 동안, 15 초 및 피펫 200 μl의 팁 10 시간마다 10 분 동안 소용돌이.
    8. 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에 15 초 동안 소용돌이와 원심 분리기.
    9. 새로운 사전 냉각 튜브에 뜨는 (핵 추출물)로 이동시켜 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
  5. 각각의 입력으로 핵 및 세포질 추출물의 볼륨의 10 %를 가져 가라.
  6. 에이1 ml의 최종 용적에 남아있는 추출물을 차가운 PBS를 위해 dd. 얼음에 사용할 때까지 보관하십시오.
    주 : 단백질 G 공역 자성 비드를 사용하는 경우 사전 클리어링이 필수적인 것은 아니다. 백그라운드가 높은 경우에는, 40 ㎕의 단백질 G 공역 자성 비드 (50 % 슬러리)와 회 전자에서 30 분 동안 4 ℃에서이 단계에서 해물 희석 한 용액을 배양하여 전 소거를 수행한다. 자기 랙 구슬에서 분리 된 상층 액 (사전 허가 해물). 구슬을 폐기하십시오.
  7. 단백질 G-복합 자석 구슬 몇 차 항체로, 4 μg의 토끼 다 클론 항 RBM3 항체 또는 토끼의 IgG (음성 대조군) 200 ㎕의 PBS에 플러스 트윈 20 버퍼와 단백질 G - 복합 자석 구슬 (50 % 슬러리) μL (40)을 품어 (PBST, 0.02 % 트윈 20)가 회 40 분 동안 실온 (RT)에서.
  8. 별도의 자기 랙 구슬과 뜨는 항체를 결합하고, 상층 액을 버린다. 200 μL PBST (0.02 %) 한 번 구슬을 씻으십시오.
  9. 1 추가용액은 비드 해물을 (또는 필요한 사전 허가 해물 경우)로 희석하고, 밤새 4 ℃에서 회전에 배양한다.
  10. 다음 날, 자기 랙에 의해 구슬과 상층 액을 분리하고, 상층 액을 버린다. 20 rpm의 고정 된 속도로 회 전자에 4 ° C에서 각각의 튜브 0.5 ml의 PBST (0.02 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오.
  11. 40 ㎕의 시료 완충액 (1X 상업용 샘플 버퍼의 50 mM 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT))를 첨가하여 비드로부터 단백질을 용출. 10 분 동안 70 ℃에서 가열한다. 새로운 1.5 ML 튜브에 스핀 다운 및 전송 액체.
  12. 10 분 동안 70 ℃에서 가열 (1X 상업용 샘플 완충액 50 mM의 DTT, 최종 농도)을 샘플 버퍼에 입력 해물을 희석. 프리 캐스트 4-12% 비스 - 트리스 젤 마지막 단계에서로드 입력과 면역 단백질. 각 웰의 적재 부피는 20 μl를 초과 할 수 없습니다. 35 분 동안 얼음에 1 배 상업 운전 버퍼에 전기 영동을 수행합니다.
    참고 :로드 핵 및 세포질 추출물셀의 동일한 초기 량을 반영 (2) (V / V를) : 1의 비율로 S.
  13. 4 ° C에서 2 시간 동안 30 V에서 1 배 상업 전송 버퍼에서 PVDF 막에 전달 단백질.
  14. 5 % 차단 막을 진탕 기에서 40 분 동안 RT에서 우유 PBST (0.1 % 트윈 20)를 미끄러 져.
  15. 밤새 4 ° C에서 PBST (0.1 %)에서 : 일차 항체와 멤브레인 (1,000 두 1에 희석) 품어.
  16. 쉐이커에 RT에서 PBST (0.1 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오.
  17. 1 시간 동안 RT에서 PBST (0.1 %)에서, (5000 모두 1로 희석) 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)와 함께 막을 인큐베이션 항 - 마우스 또는 항 - 토끼 이차 항체를 π 공역.
  18. 쉐이커에 RT에서 PBST (0.1 %)와 3 × 10 분을 씻으십시오.
  19. cm 2 막 당 0.2 ml의 강화 된 화학 발광 (ECL) 기판 혼합물을 사용하여, 5 분 동안 실온에서 품어. 빨간 불빛을 제외하고 이후이 단계에서 모든 빛을 피하십시오.
  20. 액체 버리고 필름 카세트에 X 선 필름에 노출. 자동 필름 홍보를 사용하여 필름 개발ocessing 기계.

2. 면역 세포 화학 및 근접 내고 분석

  1. 시드 0.4 ㎖의 DMEM 한 8 실, 폴리 D 라이신 코팅 된 슬라이드 챔버 당 1.5 × 104 세포의 HEK293 세포는 10 % FBS, 100 U / ㎖ 펜 연쇄상 보충.
  2. 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 세포를 성장.
  3. 대기음 매체 및 RT에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다.
  4. 대기음 PFA, 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 세척 3 × 10 분.
  5. Permeabilize 하시려면 1 시간 동안 실온에서 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 블록 셀.
  6. 밤새 4 ° C에서 통에 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 및 5 % NGS의 일차 항체와 함께 품어. 마우스 단일 클론 항 NF90 항체 토끼 다 클론 항 RBM3 항체 1을 희석 : PBS 100을 두 번 염색을 위해. 음성 대조군의 경우, 독립적으로 두 일차 항체 중 어느 하나를 생략하고, 제 3 제어 모두 항체 생략.
    참고 : 광고 차단 및 희석 시약을 사용하지 마십시오.
  7. 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 3 × 10 분을 씻으십시오.
  8. 면역 세포 또는 근접 내고 분석 프로토콜에 따라
    1. 면역 세포 화학
      1. 부화 1 : 500 희석 된 녹색 형광 염료가 결합 된 항 - 마우스 및 적색 형광성 염료 결합 항 - 토끼 이차 항체를 실온에서 1 시간 동안. 이후이 단계에서 빛을 피하십시오.
      2. 10 분 동안 실온에서 PBS로 5,000 : 4 ', 6-diamidin -2- phenylindol (DAPI)로 Counterstain과 핵 (1) 희석 하였다.
      3. 챔버 당 0.5 ml의 PBS로 3 × 10 분을 씻으십시오.
      4. 유리 슬라이드 건조에서 챔버를 제거합니다. 슬라이드 당 매체를 장착, 250 μ으로 마운트합니다.
    2. 근접 내고 분석
      1. 근접 내고 분석 프로브를 준비합니다. 믹스와 일을 결찰 수있는 다른 올리고 뉴클레오티드로 연결된 두 개의 근접 내고 분석 프로브 (항 - 마우스 및 안티 - 토끼 보조 항체를 희석하나 8 챔버 슬라이드 (cm 2 당 약 40 ㎕를 320 ㎕의 총 부피로 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 5 5 % NGS) 다른 두 연결 용액의 올리고 뉴클레오티드)을 모두 한 거친 첨가 . 실온에서 20 분 동안 인큐베이션.
      2. 유리 슬라이드에서 챔버를 제거하고 희석 프로브를 추가 할 수 있습니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 습도 인큐베이터에서 인큐베이션.
      3. 연결 용액을 준비합니다. 8 리가 ㎕를 혼합 64 μl를 5 × 결찰 재고 및 248 μL의 H 2 O
      4. 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 (A)에 2 × 5 분을 씻어 (키트와 함께 제공).
      5. 라이 게이션 용액을 첨가하고 30 분 동안 37 ℃에서 습도 인큐베이터에서 배양한다.
      6. 증폭 솔루션을 준비합니다. 이후이 단계에서 빛을 피 4 μL 중합 효소, 64 ㎕의 5 배 증폭 재고 및 252 μL의 H 2 O를 섞는다.
      7. 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 A에 2 × 2 분을 씻어
      8. 앰프 추가lification 용액을 100 분 동안 37 ℃에서 어두운 습도 인큐베이터에서 배양한다.
      9. 슬라이드에서 액체를 누른 1X 세척 버퍼 B에 2 × 10 분을 씻어 (키트와 함께 제공). 0.01x 세척 버퍼 B.에서 1 분 동안 세척
      10. 슬라이드를 건조 및 슬라이드 당 (DAPI)와 상업 장착 매체의 250 μl를 마운트.
  9. 10 배의 접안 렌즈와 20 배 대물 렌즈를 사용하여 현미경 형광 신호를 검사합니다. CCD 카메라에 의해 화상을 취득.

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결과

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도 1 및 NF90 RBM3 모두 핵 단백질과 작은 부분이 세포질에 존재하는 것을 보여준다. 특히, RBM3에 대한 긍정적 인 스테인드 세 가지 밴드가 있습니다. 20 kDa의 아래 작은이 RBM3의 정확한 크기를 반영 (RBM3의 예측 분자량이 17 kDa의)입니다. 다른 두 밴드의 기원은 조사가 남아있다. 미끼 단백질로 RBM3와 공동 면역 침전 실험 NF90-RBM3 상호 작용은 핵 및 세포질에서 소수 민족에 주로 존재하는 것으로 나타났습니다. 공동 면역 침전 데이터는 각각의 단일 단백질의 현지화를 지원합니다.

도 2a에 도시 된 바와 같이, NF90 및 RBM3 주로 핵하지만 시튜 세포질에 위치한다. 두 단백질 모두 구획에 완벽한 공동 현지화을 보여줍니다. 근접 내고 분석은 패...

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토론

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두 방법에 대한 몇 가지 장점뿐만 아니라 단점이있다. 비교적 새로운 기술로서, 인접 결찰 분석법의 명백한 이점은 단일 세포 수준 대신 이기종 셀 배치의 단백질 - 단백질 상호 작용을 규명 할 수있는 가능성이다. 높은 크기 및 (공 초점 현미경으로 예) 해상도의 이미지는 하나의 형광 반점을 계산하여 정량화에 대한 가능성을 제공합니다. 대조적으로, 웨스턴 블랏과 공동 면역 침전 기술의 통상적 인 조합은 단지 적절한 로딩 컨트롤 IP 샘플에 대해 결정하기 곤란하기 때문에, 주로 단백질 밴드를 반 정량 할 수있다. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용은 공 면역 침전 또는 융합 태그 인공 과발현 시스템에 필요한 생체 물질, 예를 들어, 세포 또는 조직, 다량의 상호 작용을 검출 할 수있는 기회를 향상시키기 위해 적용되며, 약하거나 과도 때 . 또한, 검출 t이러한 질량 분석법 등의 고감도 echniques 실험의 품질을 향상시킬 수있다. 그러나, 원료의 양에 대하여 근접 결찰 정량법 명확한 이점을 갖는다...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 스위스 국립과학재단(SNSF, 31003A_163305)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
둘베코의 변형된 독수리' s Medium (DMEM)SigmaD6429High glucose
4,500 mg/L
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
Penicillin-Streptomycin (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약Thermo Fisher Scientific78833
1,4-Dithiothreitol (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90/NF110) 항체BD Transduction Laboratories612154WB의 경우 1:1,000, ICC/PLA
ProteinTech14363-1-APWB의 경우 1:1,000, ICC/PLA
Lamin A/C 항체세포 신호 전달 기술#2032WB에 1:1,000을 사용합니다.
항-GAPDH 항체Abcamab8245는 WB 에 대해 1:1,000을 사용합니다;
일반 토끼 IgGSanta Cruzsc-2027
항토끼 IgG, HRP 연계 2차 항체세포 신호 기술#7074WB 에 대해 1:5,000을 사용합니다;
항-마우스 HRP 2차 항체Carl Roth4759.1WB 에 대해 1:5,000을 사용합니다.
Clarity Western ECL 블로팅 기질Bio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex, Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS 시료 버퍼(4x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer(20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE 전송 버퍼(20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF 멤브레인GE Healthcare Life Sciences10600021
Poly-D-Lysine 8웰 배양 슬라이드Corning BioCoat354632
파라포름알데히드(PFA)SigmaP6148
Normal goat serum (NGS)Gibco, Thermo Fisher ScientificPCN5000
염소 anti-mouse IgG (H+L 항체), Alexa Fluor 488 conjugateThermo Fisher ScientificA-11001
Goat anti-rabbit IgG (H+L 항체), Alexa Fluor 568 conjugateThermo Fisher ScientificA-11011
4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)SigmaD9542
Duolink PLA probe Anti-mouse PLUSSigmaDUO92001
듀올링크 PLA  프로브 안티 래빗 MINUS시그마DUO92005
듀올링크 검출 시약 레드시그마DUO92008
듀올링크 세척 버퍼 형광시그마DUO82049
DAPI가 있는 듀오링크 장착 매체그마DUO82040
Mowiol 4-88시그마81381
현미경올림푸스AX-70
CCD 카메라SPOTInsight 2MP Firewire
X선 필름FujifilmSuper RX
필름 가공기FujifilmFPM-100A
RBM3 항체의 경우 1:100 사용 는 의 경우 1:100 사용 는 는 은 시

참고문헌

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  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
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  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
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  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

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HEK293NF90 RBM3

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