내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

요약

우리는 단일 포유류 세포를 분류하고 각 세포에서 최대 96개의 관심 대상 유전자의 발현을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법에는 절대 전사체 수를 추정할 수 있도록 내부 qPCR 표준을 사용하는 것이 포함됩니다.

초록

세포의 벌크 집단에서 유전자 발현을 측정하면 해당 집단 내에서 개별 세포의 상당한 전사체 변이를 모호하게 할 수 있습니다. 단일 세포 유전자 발현 측정은 유전자 발현에서 잡음의 역할을 평가하고, 유전자 쌍 발현의 상관 관계를 식별하고, 자극에 다르게 반응하는 세포의 하위 집단을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 조직 배양에서 성장하는 집단에서 분리된 단일 포유류 세포에서 최대 96개의 유전자 발현을 측정하는 절차를 설명합니다. 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 용해 완충액으로 분류되며, 관심 mRNA 종은 역전사 및 증폭됩니다. 그런 다음 한 번에 최대 96개의 샘플에 대해 최대 96개의 qPCR 분석을 수행하는 미세유체 real-time PCR 기계를 사용하여 유전자 발현을 측정합니다. 또한 각 전사체의 절대 수를 추정할 수 있도록 PCR 앰플리콘 표준물질의 생성 및 사용에 대해서도 설명합니다. 단일 세포에서 유전자 발현을 측정하는 다른 방법과 비교하여, 이 접근법은 RNA-Seq보다 저렴한 비용으로 RNA FISH보다 더 뚜렷한 전사체를 정량화할 수 있습니다.

서론

집단 내의 개별 셀은 균일 생리적 자극 ^1,2,3,4 널리 상이한 응답을 표시 할 수있다. 인구의 세포의 유전 적 변이는 응답이 다양한 한기구이지만, 심지어 세포의 클론 인구에서, 응답의 변동성을 증가시킬 수있는 몇 가지가 아닌 유전 적 요인도 있습니다. 예를 들어, 각각의 단백질과 다른 중요한 신호 분자의 농도는 하류의 유전자 발현 프로파일의 변동을 초래하는, 셀별로 달라질 수있다. 또한, 유전자 활성화 버스트 ^{7, 8, 9} 당 사체 비교적 적은 수로 제한 될 수있다 사체 ^{(5), (6)의} 짧은 지속 기간의 버스트에서 발생할 수있다. 이러한유전자 활성화에 확률 성이 크게 생물학적 반응의 다양성에 기여하고, 생리 학적 자극에 ^반응하는 미생물 ⁽¹⁰⁾ 및 포유 동물 세포 ^{(1)에 2} 선택적인 이점을 제공 할 수있다. 인해 변형 모두 유전 및 비유 전적 소스, 자극에 대한 응답에서 특정 셀의 유전자 발현 프로파일은 벌크 응답의 측정으로부터 구한 평균 유전자 발현 프로파일과 크게 다를 수있다. 개별 세포가 자극에 응답하여 변화 표시되는 범위를 결정하는 개별 세포의 분리를위한 기술을 필요로 관심 사체에 대한 발현 수준을 측정하고, 얻어진 발현 데이터의 계산 분석.

비용의 넓은 범위를 덮고, 단일 세포에서의 유전자 발현을 분석하기위한 몇 가지 방법이 있으며, 전 사체의 수 프로브 및정량의 정확성. 예를 들어, 단일 셀 RNA-SEQ은 전사 따르면 개별 셀에서 가장 높은 발현 유전자 고유 사체 수천 정량화하는 능력의 다양한 깊이를 구비하고; 비용 감소를 계속하지만 그러나, 이러한 시퀀싱 깊이와 관련된 비용이 엄청날 수있다. 반대로, 현장 하이브리드 (smRNA의 FISH)에서 단일 분자 RNA의 형광에 대한 성적 증명서의 정확한 정량을 제공에도 낮은 발현 관심의 유전자에 따라 합리적인 비용으로 유전자; 그러나, 표적 유전자의 소수만이 방법에 의해 주어진 셀에서 분석 될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 정량 PCR 기반의 분석은, 이러한 기술 사이의 중간을 제공합니다. 이 분석은 96 개의 셀을 한 번에 관심 96 사체까지 정량화하는 마이크로 유체 실시간 PCR 기계를 사용한다. 상기 한 방법들의 각각은 필요한 하드웨어 비용이 있지만, 개별의 qPCR 분석의 비용은 상대적이며낮은. 이 프로토콜은 마이크로 유체 실시간 PCR 기기의 제조업체 (프로토콜 ADP 41, 플루)에 의해 제안 된 하나에서 적응된다. PCR을 기반 접근 방식의 각 증명서의 절대 수의 추정을 가능하게하기 위해, 우리는 여러 실험을 통해 사용할 수있는 준비된 표적 유전자의 증폭의 내부 통제의 사용을 할 수있는 프로토콜을 확장했다.

이 기술의 일례로서, MCF-7 인간 유방암 세포에서 p53 유전자에 의해 조절 유전자 발현의 정량화 ^11를 설명한다. 세포는 DNA 이중 가닥 휴식을 유도하는 화학 제로 도전. 이전의 연구는 DNA 이중 가닥 나누기에 p53의 응답이 모두 p53의 수준 ^(12)의 측면에서 별개의 표적 유전자 ^(11)의 활성화에 개별 셀의 이질성의 큰 거래를 나타내는 것으로 나타났습니다. 또한, p53의 100 개 이상의 발현을 조절세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 ^{13, 14을} 포함한 다수의 다운 스트림 경로에 관여 표적 유전자를 잘 특성화. 각 세포에서 p53에 매개 반응은 복잡하고 변수 모두이기 때문에, 접근법에서 시스템 이익 분석은 거의 100 표적 유전자는 예컨대 이하에 설명하는 개별 세포를 동시에 탐색 할 수있다. (예 : 단일 셀 분리 및 용해를위한 대안의 방법)를 약간의 수정 프로토콜 용이 포유 동물 세포 유형 성적 및 세포 반응의 다양한 연구에 적용 할 수 있습니다.

적절한 사전 준비로, 세포 선별 유전자 발현 측정 라운드는 3 일 동안이 프로토콜에 따라 수행 될 수있다. 다음 타이밍 제안 : 사전에 관심있는 성적표를 선택 파악하고 그 transcr에서의 cDNA를 증폭 프라이머 쌍을 확인IPTS, 그리고 표준과 그 프라이머를 이용하여 프라이머 믹스를 준비합니다. 1 일에, 세포 치료, 수확을 다음과 세포를 분류, 역전사 및 특정 대상 증폭을 수행하고, 비법 인 프라이머를 제거하는 엑소 뉴 클레아 제와 샘플을 취급합니다. 제 2 일에, qPCR에를 사용하여 정렬 세포에 대한 품질 관리를 수행합니다. 마지막 3 일에 qPCR에 미세 유체를 이용하여 정렬 세포에서 유전자 발현을 측정한다. 그림 1은 관련된 단계를 요약 한 것입니다.

프로토콜

1. 사전 준비

1. 발현을 측정한다 관심의 96 유전자까지 선택합니다.
   주 : 이들 유전자 중 적어도 하나는 ACTB 또는 GAPDH 같은 "하우스 키핑 유전자의"이어야, 즉 실험에 사용 된 조건하에 상대적으로 일정한 수준으로 발현되는 것으로 알려져있다. 이 유전자는 긍정적 정렬 웰 (단계 8.1) 및 증폭 된 샘플 (단계 10.1)을 식별하는 데 사용된다.
   참고 : 예를 들어, 실험, 공지 기능 ^{(11), (14)} 및 가정용 제어를 선택했다으로 GAPDH의 다양한 p53과의 직접 대상을 잘 특징. 표적 유전자와 본 연구에 사용 된 프라이머 서열의 전체 목록을 참조 (11)을 참조하십시오.
2. ¹⁵ (과학 문헌 또는 프라이머 디자인 도구 등의 프라이머-BLAST 등을 사용하여, 예를 들어) 관심의 유전자와 관련된 잠재적 인 프라이머 쌍을 확인합니다. 프라이머를 가지고합성 S와 뉴 클레아없는 물 100 μM의 재고 농도를 유지한다.
   참고 :이 프라이머는 15-25 기지 여야합니다; 앰플 리콘을 긴 90-130 염기쌍 (BP)를 생성; 하나는 게놈 DNA의 증폭의 가능성을 감소시키기 위해 존재하는 경우, 엑손 접합부에 걸쳐; 60 ± 1 ° C의 용융 온도를 가지고, 최소한의 이차 구조 ^{(16)이있다.} 이 프라이머는 관심의 성적에서의 cDNA를 증폭하고, 염료 기반 qPCR에 결합 DNA의 유전자 발현을 측정, 주요 역 전사에 사용됩니다.
3. 프라이머를 확인합니다.
   1. 먼저, 관심있는 세포로부터의 cDNA를 얻었다. 제조업체의 지침 또는 표준 분자 생물학 방법 ^(17)에 따라 RNA 수확 키트를 사용하여 세포에서 수확 RNA. 제조업체의 지침 또는 표준 운전 방식에 따라-역 전사 랜덤 헥사와 역전사 키트를 사용하여 cDNA를로 RNA를DS ^17.
   2. 각각의 프라이머 쌍에 대해, DNA 앞으로, 염료 마스터 믹스를 결합하고 프라이머를 반대하고, 이전 단계의 cDNA를, 제안 된 반응 조건의 마스터 믹스 제조업체의 권장 사항을 다음과 같이 qPCR에를 설정합니다. 용융 곡선 습득을 포함하는 마스터 믹스 제조자가 추천 열 사이클링 프로토콜을 사용하여 실시간 PCR 기계에서 이들 반응을 실행.
   3. qPCR을 한 후, 2 % w / v를 아가 로스 겔상에서 증폭 된 DNA 시료를 실행하고, 표준 프로토콜을 따르는 ¹⁷ DNA의 삽입 성 염료 통해 DNA를 시각화.
   4. 유전자의 cDNA로부터 연속 희석 표준 곡선을 구성하여 프라이머 쌍의 효율을 결정 표준 프로토콜 ^{(16)에있어서} (단계 1.3.1에서 제조).
      주 : 좋은 프라이머 쌍 겔 ^(16)에 예상 된 위치에 하나의 잘 정의 된 피크 단일 밴드의 용융 곡선을 ^{수득한다,} 클래스 = "외부 참조"> 17 (그림 2)입니다. 용융 곡선은 "숄더"다수의 피크 또는이 있거나 겔 다중 대역 또는 얼룩을 갖는 경우, 프라이머는 오프 - 표적 서열을 증폭하는 경우. 오프 - 표적 서열을 증폭하고 필요에 따라 이전의 검증 단계를 반복하는 것으로 관찰 된 모든 프라이머를 재 설계. 좋은 프라이머 쌍은 표준 곡선 ^16이 R ≥0.985와 90~110% 효율을 가질 것이다; 어떤 프라이머를 재 설계하는 이러한 범위 외부의 효율성 또는 R ^2가.
4. 정제 된 DNA의 증폭에서 표준을 준비합니다.
   1. 각각의 검증 프라이머 쌍의 경우 :
      1. 프라이머와 주형 DNA의 농도, 반응 조건, 및 PCR 사이클링 조건 또는 표준 PCR 프로토콜을 사용하는 중합 효소 제조사의 권고에 따라 고성능 DNA 중합 효소를 사용하여 cDNA를으로부터 관심 영역을 증폭"외부 참조"> 17.
      2. 2 % w / V 아가로 오스 겔에서 증폭 된 cDNA를 실행하고 염료 ⁽¹⁷⁾ 인터하는 DNA와 밴드를 시각화. 깨끗한 면도날을 사용하여 앰플 리콘을 나타내는 밴드를 절제하고, 마이크로 원심 튜브 겔 조각을 놓는다.
      3. 제조업체의 지시에 따라, 예컨대 아가 레이즈 기반 추출 ¹⁷ 스핀 칼럼 겔 추출 키트 같은 표준 겔 추출 방법을 이용하여 겔에서 증폭 물을 정제.
      4. 제조자의 지시에 따른 형광 계 dsDNA 정량 키트를 사용하여 앰플 리콘의 농도를 측정한다. 앰플 리콘 μL 당 분자의 수를 얻기 위해 앰플 리콘 서열에 근거하여 공지 된 앰플 리콘의 분자량 측정 dsDNA 농도 나눈다.
      5. 2.0 ml의 낮은 바인딩 미세 원심 분리 관에서 DNA 현탁액 버퍼의 부피로 정제 된 앰플 리콘 2 μL를 추가되도록 A의 최종 농도licon 5 × 10 ⁸ 분자 / μL이다.
   2. 모든 증폭이 정제되었을 때, 2.0 ml의 낮은 바인딩 microcentrifuge 관에서 각 정제 된 앰플 리콘의 18 μl를 결합한다. 1800 ㎕의 총 부피를 위하여 DNA 현탁액 버퍼를 추가; 따라서, 각 앰플 리콘의 농도를 5 × ¹⁰⁶ 분자 / μL이다.
      참고 : 알려진 몰량에 대한 관심의 모든 유전자에서의 cDNA 증폭가 포함이 혼합물은, 단일 셀 qPCR에 표준이 될 것입니다.
   3. 소용돌이이 "5e6"철저히 표준, 2,000 XG에 10 초 동안 스핀, 낮은 결합 PCR 튜브에 20 μL 씩에 나눕니다. -80 ° C에서 분취 량을 저장합니다.
5. 특정 표적 증폭 (STA) 프라이머 믹스 (10 배)를 준비합니다.
   1. 15 ML 원뿔 튜브 (192 개) 각 100 μM 재고 프라이머의 25 μl를 결합한다. 5000 ㎕의 총 부피를 위하여 DNA 현탁액 버퍼를 추가한다.
      참고 :이 혼합물의 각 프라이머의 농도는 500 ㎚이다. 분류 세포의 각 플레이트는 프라임 역전사 특정 표적 증폭이 프라이머 믹스의 105.6 μl를 사용합니다. 여기 주어진 프라이머 혼합물의 부피는 정렬 판 (45)을 만들기에 충분하다. 한번만해야되도록 프라이머 믹스 충분히 큰 부피를하는 것이 바람직하다; 필요에 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
   2. 110 μL 씩에 분할 텍싱에 의해 철저하게 혼합하고, -20 ° C에서 분취를 저장합니다.
6. 미세 유체 칩 기반 qPCR에에서 사용하기 위해, 분석 믹스, 각각의 프라이머 쌍 하나를 준비합니다.
   1. 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에, 특정 유전자에 해당하는 100 μM 역방향 프라이머 3.0 μL, DNA 현탁액 완충액 24.0 μL, 그리고 배 분석 로딩 시약 30.0 μL를 100 μM 정방향 프라이머 3.0 μl를 결합 .
   2. 소용돌이이 판, -20 ° C에서 10 500 XG에 초, 및 상점의 스핀.
7. 이 열 사이클링 프로그램을 만듭니다 RTSTA을 (전사 및 특정 대상 증폭 역 표 1)과 EXOI (엑소 뉴 클레아 제 I 처리를 표 2).

2. 치료

1. 들은 실험 연구의 조건에 따라, 치료시 목적하는 합류로 성장할되도록 조직 배양 접시에서 포유 동물 세포를 접시. 본 연구에 제시된 예, 판 (4) × ¹⁰⁵ MCF-7 p53이 금성 셀 ¹⁸ RPMI에서 6cm 접시 당 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U가 / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신과 함께 250 NG /가 50 % 포화 상태에 도달 할 때까지 5 % CO _2와 37 ° C에서 이틀 동안 ml의 암포 테리 신 B를 품어에게 세포.
2. 실험 연구에 기초하여 관심있는 상태를 설정하기 위해 셀을 처리한다. 본 연구에서 제시된 예를 들어, / ㎖ neocarzino 400 NG와 MCF-7 p53의 - 금성 세포를 배양3 시간, 8.5 시간, 14 시간, 24 시간 동안 스타틴.

셀 정렬 3. 용해 버퍼 준비

참고 : 용해 버퍼의 한 판을 만드는 것은 약 1 시간 소요됩니다. 셀 정렬이 비효율적없이 검출 셀과 많은 우물을 얻을 수있는 판 있도록하는 것이 바람직하고 정렬 여러이다.

1. PCR을위한 준비 DNA의 오염 제거 솔루션 벤치, 피펫, 튜브 랙, 차가운 PCR 플레이트 홀더, 장갑을 청소합니다.
2. 클레아없는 물을 1.5 ML 튜브의 주식 RNA 분해 효소 억제제를 추가하여 2.64 U / μL로의 RNAse 억제제를 희석.
   주 :이의 RNAse 억제제가 서브 μL 부피 피펫 팅없이 용해 완충액에 첨가 할 수있다.
3. 표 3에 열거 된 구성 요소를 결합하여 세포 용해 완충액을 만든다.
4. 별도의 튜브에 세포 용해 완충액 92.4 ㎕를 이동; 이는 앰플 리콘 표준의 용해 버퍼 될 것입니다.
5. 사용 보라W-결합 피펫 팁과 마이크로 원심 튜브, DNA 서스펜션 버퍼, 200 ㎕를 각각 3.1 페이지 / μL, 6.2 페이지 / μL로 희석하여 대장균 DNA의 500 μl를 준비합니다.
6. 세포 용해 용 완충액 3.1 PG / μL 대장균 DNA의 184.8 μL를 추가한다.
   참고 : E. 콜라이 캐리어 비특이적 DNA 프라이머 결합 가능성의 범위를 확장함으로써 프라이머 이량은 PCR 생성물을 초래할 가능성을 감소시키는 역할을한다.
7. 표준을 준비합니다.
   1. 5e5, 5e4, ... 5e0 6 개의 낮은 결합의 microcentrifuge 튜브 라벨.
   2. 은 "5e5"튜브에 DNA 서스펜션 버퍼의 90 μl를 추가합니다.
   3. 다른 다섯 튜브에 각각 6.2 페이지 / ㎕를 대장균 DNA의 90 μl를 추가합니다. 얼음에있는 모든 튜브를 유지합니다.
      주 : 기준으로 캐리어 DNA를 통합은 한 셀 웰에 필적하는 표준 웰 DNA의 총 질량을 만든다; 이 홍보를 감소표준 농도는 튜브 또는 피펫 팁에 결합하는 DNA에 의해 영향을받을 것이다 obability.
   4. 저장에서 (단계 1.4에서 제조 된 각 앰플 리콘의 5 × 10 ⁶ 분자 / μL)은 "5e6"표준의 나누어지는 가져 가라. 소용돌이 짧게 짧게 스핀 (500 XG에 5 초)는 액체가 관의 맨 아래에 있는지 확인합니다.
   5. 낮은 결합 피펫 팁을 사용하여 "5e5"튜브에 5e6 표준의 10 μl를 추가합니다. 간단히 소용돌이, 스핀 (500 XG에 5 초), 얼음에 다시 튜브를 넣어.
   6. 은 "5e4"튜브에 "5e5"관에서 피펫 10 μL. 간단히 소용돌이, 스핀 (500 XG에 5 초), 얼음에 다시 넣어.
   7. 모든 튜브 표준의 희석을 할 때까지, 이전 튜브에서 10 μl를 수신하는 각각의 관이 연속 희석을 반복합니다.
8. 캡 (12) PCR 튜브의 행을 준비합니다. 각 튜브에 "셀"용해 버퍼의 67 μl를 배포합니다. (5 튜브를 모자와 짧게 스핀 다운초) 500 XG에 필요한 경우.
9. 12- 채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트 (도 3)의 제 7 행의 각 웰에 PCR 튜브의 행에서 "셀"용해 완충액 9 μL를 배포한다.
10. 판의 마지막 행의 각 웰에 "표준"용해 버퍼 7 μl를 배포합니다 (그림 3).
11. 낮은 결합 피펫 팁을 사용하여 판지도 (그림 3)에 따라 아래 행의 각 웰에 표준 2 μl를 추가합니다.
    참고 : 등 (10) 분자, 5 × 10 ⁰ 분자 / ㎕의 표준 금액의 2 μL
12. 10 세포 및 100 세포 웰에 3.1 PG / μL 대장균 DNA 2㎕의 추가; 무 세포 우물에 6.2 페이지 / ㎕를 대장균 DNA의 2 μl를 추가합니다.
    주 : 각 1 셀 10 세포, 100 세포는 물론 하나의 인간 세포의 게놈 DNA의 질량을 근사 대장균 DNA 6.2 PG있다. 각 표준 및 무 세포도 12.4 페이지 O를 가지고F 대장균 DNA, 약 2 인간의 세포 '의 가치.
13. 세포가 정렬을위한 준비가 될 때까지 4 ° C에서 5 500 XG에 초, 및 저장에 대한 멸균 열 인감, 스핀을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.

4. 셀 분류기 설치

1. 판지도 (그림 3)에 따라 96 웰 플레이트에 정렬 형광 활성화 셀 소터 프로그램; 어떤 세포는 우물 H1-H8 또는 H11-H12로 분류 될 수 없습니다.
2. 셀 소터가 잘 PCR 플레이트에 정렬을 목적으로되어 있는지 확인합니다.
   1. 가능한 최소로 정렬 스트림의 각도를 설정; 이 설정은 셀 측면 충돌보다는 웰의 바닥으로 정렬 될 가능성을 증가시킨다.
   2. 기계를 목표로, 기계 ^(19)의 지시에 따라, 빈 PCR 플레이트를 밀봉하고 빈 접시의 밀봉에 PBS의 "종류"물방울에 테스트 스트림을 사용; 방울은 일에 착륙한다웰의 중심 위의 위치에서 실의 E면. 최상의 결과를 위해, 판의 길이 및 폭에 걸쳐 목적을 확인.
   3. 액 적이 올바른 위치에 착륙하지 않을 경우, 실의 표면을 닦아 장비 제조업체의 지시에 따라 셀 소터를 재조정하고 정렬 스트림 방울이 정확하게 증착 될 때까지 반복한다.

5. 셀 수확 및 정렬

1. 세포주에 대한 적절한 세포를 Trypsinize. 예를 들어, MCF-7 세포에 대해, 0.05 % 트립신 1 ㎖로 세포를 씻어, 세포로부터 배지를 흡인하고, 37 ° C, 5 % CO _2에서 5 분 동안 0.05 % 트립신 2 ㎖로 세포를 부화 .
2. 트립신 세포에 세포 배양 배지 8 ㎖에 첨가하고 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액 10ml를 모두 전송할. 400 X g에서 4 분 동안 원심 분리기.
3. 뜨는을 기음과 PBS + 2 % FBS에서 세포 펠렛을 resuspend.
   참고 : 작은 부유 볼륨이 세포를 집중 세포 정렬을 용이하게; 500 μL의 재 부유 볼륨은 50 %의 포화 상태에서 세포의 6cm 요리에 적합합니다.
4. 세포 덩어리를 제거하기 위해 40 ㎛의 필터를 통해, 튜브 계측법 피펫 흐름 ㎖로 5에 세포 현탁액을 전송.
5. 액체가 웰의 바닥에있을 것을 보장하는 세포를 선별하기 전에 4 ° C에서 30 초 동안 400 XG에 용해 완충액의 플레이트를 원심 분리기.
6. 셀 소터에 세포 현탁액에 튜브를 삽입합니다. 용해 버퍼의 접시에 봉인을 열고 조심스럽게 셀 소터 제조업체의 지침 ¹⁹ 판지도에와 다음에 따라 플레이트에 관심있는 세포를 정렬합니다. 하나의 셀이 최대 순도 정렬되도록하려면, "단일 셀"모드에서 시스템을 실행하고 앞으로 기반 게이팅 및 측면 분산 ¹⁹ 세포 계측법 표준 흐름을 사용합니다.
   참고 :에서실험 예 게이트 개별 셀 ^(11)의 가장 밝은 15 %를 분리 p53이 금성 형광에 기초하여 상기 셀.
7. 4 ° C에서 1 분 동안 400 XG에 새로운, 멸균 열 인감 및 원심 분리기와 함께 접시를 밀봉합니다. 열 자전거 타는 사람에 접시를 놓고 RTSTA 프로그램을 (단계 1.7 참조)를 실행합니다.
   주 :이 정렬 된 세포에서의 mRNA의 역전사 수행하고 관심 사체의 cDNA의 증폭.

6. 엑소 뉴 클레아 제 치료

1. 표 4에 열거 된 성분을 조합하여 희석 엑소 뉴 클레아 제 I 섞는다. 캡 (12) PCR 튜브의 행을 준비합니다. 각각의 튜브에 희석 엑소 뉴 클레아 제 I의 30.5 μl를 배포합니다. 튜브를 캡과 액체가 관의 바닥에있을 것을 보장하기 위해 잠시 동안 (500 XG에서 5 초)를 스핀.
2. RTSTA이 완료되면, 500 x g에서 5 초 동안 샘플 플레이트 스핀. 12- 채널 피펫을 사용하여, 희석 엑소 뉴 클레아 3.6 μL 배포I 플레이트의 각 웰에.
3. 멸균 열 인감과 스핀 짧게 (500 XG에 5 초)와 함께 접시를 밀봉합니다. 열 자전거 타는 사람에 접시를 놓고 EXOI 프로그램을 (단계 1.7 참조)를 실행합니다.
   참고 : 그들이 미래 PCR을 방해하지 않도록이 단계는 특정 대상 증폭 한 후 남아있는 프라이머를 저하시킨다.

7. 샘플 희석

1. 엑소 뉴 클레아 제 처리를 완료하면, 시료 판의 각 웰에 TE 완충액 32.4 μL를 추가; 이것은 선택적 정류소이며, 샘플을 며칠 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

qPCR에 사용 8. 정렬 품질 관리

주 : 셀 정렬 완벽 비효율적이기 때문에,이 단계는, 상기 정렬 플레이트의 웰은 실제로 셀을받은 식별 할 필요가있다. 이들 샘플은 추가적인 분석을 위해 사용될 수있다.

1. qPCR에 의한 각 샘플에서 하우스 키핑 유전자 발현을 측정합니다.
2. 단계 1.1에서 선택한 하우스 키핑 유전자 중 하나에 대한 중합 효소 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 프라이머에 따라 96 반응에 DNA 결합 염료 qPCR에 마스터 믹스 900 μl를 준비; 특정 효소에 달려이 반응 등의 반응 완충액, 효소, 프라이머의 정확한 농도는 사용된다.
3. 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 9 μl를 배포합니다. 상기 PCR 판으로 잘 대응하는 샘플 플레이트에서 샘플 1 μl를 추가합니다.
4. 마스터 믹스의 제조에서 제시 열 사이클링 프로토콜을 사용하거나 표준 프로토콜 ^20에 따라 실시간 PCR 기계에서 실행 판.

qPCR에 데이터 ^(20)를 분석; 아래 정렬 품질 관리 단계에서 qPCR의 데이터의 예는도 4에 도시되어있다.

1. 무 세포가 우물에서 측정이 낮은 (배경) 수준을 보여 있는지 확인유전자 발현 또는 전혀 표현.
2. 높은 유전자 발현 및 무 세포 우물과 유사한 모든 표현 또는 전혀 표현의 배경 수준, 부정적인 샘플 양의 샘플 : 1 셀 우물에서 측정을 두 그룹으로 명확하게 나눌 있는지 확인합니다.
   참고 : 높은 유전자 발현과 샘플이 실제 정렬 된 세포를 나타낸다 배경 식 사람들은 추가 분석에서 제외되어야한다.
3. 10 셀 100 셀 우물에서 측정 비효율적 정렬이 원하는 것보다 그 우물이 적은 세포가 발생할 수있는 가능성을 허용, 긍정적 인 1 셀 우물에 비해 높은 유전자 발현을 반영하는지 확인합니다.
4. 표준 우물에서 측정이 균일합니다 (C의 _{t 값이} 고르게 분포되어 있는지, 즉) 로그 공간에 분산되어 있는지 확인합니다.

모든 긍정적 인 한 세포 샘플을 식별 한 후, 긍정적 인 1-CE를 매핑하기 위해 "샘플 믹스"판지도를 만들새로운 96 웰 플레이트 상에 게요 샘플. 이 판의지도 기준 8 개의 우물을 포함합니다. 예를 들어 그림 5를 참조하십시오.

미세 유체 qPCR에 사용 9. 유전자 발현 측정

참고 :이 섹션의 모든 단계를 들어, 첫 번째 정류장 피펫은 시약 거품의 형성을 최소화합니다.

1. 8 PCR 튜브의 행을 엽니 다. 샘플의 다수의 판이있을 경우 8 PCR 튜브의 제 2 열을 열고 튜브 1-8 라벨. 이 행은 여러 판에서 표준을 풀링에 대한 것입니다.
2. 1.5 ㎖의 튜브에 색소 샘플 로딩 시약 결합 DNA의 36 μL와 DNA 결합 염료 qPCR의 마스터 믹스 360 μL를 혼합한다. 소용돌이 짧게 2,000 × g으로 10 초 동안 스핀. 각 튜브에 48 μl를 배치, 8 PCR 튜브의 레이블이없는 행에이 혼합물 (396 μL)를 나눕니다.
3. 8- 채널 피펫을 사용하여, 각 웰에 마스터 믹스 / 샘플 로딩 시약 혼합물을 3.3 μL 배포새로운 96 웰 PCR 플레이트. 이 판, 레이블 "샘플 믹스를."
4. 각 시료의 PCR 플레이트 :
   1. 소용돌이 500 × g으로 10 초 10 초 스핀의 판. 덮개를 제거하고 우물을 판지도에 표시된 1 셀 플레이트를 믹스는이 샘플에 잘 대응하는 각각의 양의 1 세포 샘플의 2.7 μl를 전송합니다.
   2. 샘플의 하나의 플레이트가있는 경우의 샘플 웰에 상응하는 각각의 증폭 된 표준의 2.7 μl를 전사 플레이트 맵에 따라 플레이트 믹스.
   3. 샘플의 다수의 판이있을 경우, PCR 튜브의 행에 표시된 대응하는 위치로 각각 증폭 표준 2.7 μl를 옮긴다. 이미 모든 표준 샘플의 현재 판에서 기준을 추가합니다. 밀봉 필름을 사용하여 수행 할 때 샘플 플레이트를 밀봉.
5. 샘플의 여러 번호판이 경우 다음과 같습니다
   1. 표준을 함유하는 PCR 튜브의 행 와동2,000 X g에서 10 초 10 초 스핀. (가) 잘 샘플에 대응에 혼합 표준의 각 튜브에서 2.7 μl를 이동 플레이트의지도에 따라 판을 믹스.
6. 판지도에 표시 클레아없는 물 2.7 μL와 NTC 우물을로드합니다. 필요할 때까지 샘플 4 ° C에서 접시와 저장소를 믹스 인감.
7. 새로운 미세 유체 qPCR에 칩의 바닥 오프 스티커 껍질. 여전히 캡과 제어 선 유체 주사기를 사용하여 느슨하게 각각 누산기 스프링을 아래로 밀어 제어 선 유체 150-200 μL 각 어큐뮬레이터 주입.
8. 로딩 기계에 칩을 삽입하고 "프라임"스크립트를 실행합니다. 이것은 ~ 20 분 소요됩니다.
9. 프라이밍이 소용돌이를 수행하고 분석 믹스의 판을 아래로 회전하면 샘플 믹스 (단계 1.6에서 준비).
10. 8- 채널 피펫을 사용하여, 도면에 따른 미세 유체 qPCR에 칩의 좌측에 각각 분석 믹스 4.5 μl를 전송할 g> 그림 6. 피펫은 매우 신중 웰의 바닥에 기포를 생성하지 않도록한다. 완료되면, 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 분석 믹스 및 저장의 판을 밀봉.
11. 도 6에있어서, 미세 유체 칩 qPCR의 오른쪽에 각 샘플 믹스 4.5 μl를 옮긴다. 로딩 기계에 칩을 삽입하고 "믹스를로드"스크립트를 실행합니다. 이것은 ~ 90 분 소요됩니다.
12. , 미세 유체 실시간 PCR 기계를 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 시작하고 따뜻하게하기 위해 램프를 켭니다. 이것은 ~ 20 분 소요됩니다.
13. 로드 믹스 스크립트가 완료되면에서 더 라인이 없는지 확인 칩-이 로딩 문제를 나타냅니다. 조심스럽게 스카치 테이프 또는 실험실 테이프를 사용하여 칩에서 먼지 입자를 제거합니다. 미세 유체 실시간 PCR 기계에 칩을 삽입하고 데이터 수집 스크립트를 실행합니다. 결과를 검사하고 추가 분석을 위해 데이터를 내보낼 분석 소프트웨어를 사용합니다.

_title "> 10. 데이터 분석

1. qPCR의 증폭 곡선 ⁽²⁰⁾ (곡선은 표준 S 자형 증폭 곡선과 유사하지 않은 즉,) 가난한 품질을 표시하는 측정을 제거합니다.
2. 30 개 이상의 가난한 품질 또는 제로 측정하거나하는 하우스 키핑 유전자 발현 (단계 1.1 참조) 다른 샘플의 대부분보다 훨씬 낮다 (그림 7)에 대한 샘플을 제거합니다.
3. 각각의 유전자의 경우, 각 샘플의 용융 피크 위치의 중앙값으로서의 정 용융 피크의 위치를 ​​추정한다. 측정은 중간에서 이상 1 ° C에 위치한 용융 피크가있는 경우, 고려 ^(20)이 측정을 제거합니다.
4. 각각의 유전자를 들어, 스프레드 시트 또는 스크립트 언어 ^(20)를 사용하여 각 시료의 mRNA의 수를 추정하기 위해 표준 곡선을 생성한다.
   참고 :이 실험의 기준 (10)로 구성, 100, 1,000, 10,000 분자dsDNA의 관심의 각 사본에 해당. 역전사 완벽 효율적이라면의 mRNA 및 cDNA를 단일 가닥 때문에, 표준은 20, 200, 2000 및 20,000의 mRNA 분자에 상응한다. 실제로,이 경우가 있으므로이 E _RT가 역전사의 효율이다 E _RT, × 분자 단위로 추정 등의 측정을 표현한다.
   1. 각 표준 웰의 경우, m, ssDNA를 증폭 이전의 분자수 (dsDNA의 분자 수의 두 배) (예를 들어, 20 분자, 분자 (200) 등)를 식별한다.
   2. 각 표준 잘 들어, qPCR에 ^20에서 C의 _{t 값을} 식별합니다.
   3. m 및 C의 _t의 값으로, 각각의 유전자에 대한 파라미터 A 및 B를 표준 곡선을 생성하기 위해 다음 식을 사용하여 선형 회귀를 수행하며 같이 ^R이 값을 찾기적합도의 n 개의 표시 :
      
   4. 표준 곡선으로부터, 각 유전자에 대한 PCR 효율 E를 계산한다 :
      
      참고 : 1.0 (예를 들어, E> 1.1) 물리적 현실보다는 훨씬 더 큰 E 값; 선형 회귀에 대한 R ^값이 훨씬 미만 1.0 (예, R ² <0.985)는 표준 확실하게 작동하지 않는 것을 의미한다. 이러한 문제는 일반적으로 최소 앰플 리콘 표준 믿을 정량의 임계 값 이하로 떨어지면, 따라서 낮은 표준은 선형 회귀로부터 배제되어야한다는 것을 나타낸다. 적절한 선형 회귀는 적어도 세 가지 고유 한 기준을 이용하여 제조 할 수없는 경우, 유전자 발현 측정을 버린다.
   5. 선형 회귀에 충분한 경우, 생성 된 적합 파라미터 A 및 B를 사용하여 <mRNA의 수를 추정하기 위해 각각의 유전자 / EM>를 측정 C _{t의 값으로부터} 각각의 단일 세포 샘플에서 해당 유전자 (E × _RT 분자 단위) m의 _추정치를 분자 :
      
   6. 모든 측정 m의 _추정치를 지정 <1 m의 _추정 = 또한 0으로, qPCR에에서 더 증폭 따라서 m의 _추정 = 0으로 더 C의 _{t 값이} 모든 측정을 지정합니다.
      참고 : _{동부 표준시} 가장 낮은보다 작거나 회귀에 사용되는 최고 수준의보다 큰 m와 측정 표준 곡선으로부터 외삽에 의해 발견된다. 이러한 추정치는 반드시 잘못된 것은 아니지만주의 간주되어야한다.
5. 단일 세포 유전자 발현 데이터를 시각화.
   1. beeswarm 플롯 (도른, J.와 성령, T. 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/filee 확인각 포인트는 특정 셀에서 유전자 발현을 나타내고있는 체인지 / 37105); 예는도 8에 도시된다.
   2. 은 "바이올린"의 폭은 상기의 특정 레벨 주위 유전자 발현의 측정 주파수를 나타내고있는 바이올린 플롯 (도른, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661)을 만들기 분석 세포의 인구; 예는도 8에 도시된다.
      주 : 더 복잡한 분석은 유전자 ^{(21, 22)의} 쌍 사이의 식의 관계를 조사하고 유전자 발현 네트워크를 추론 할 수있다.

결과

프로토콜의 일반적인 개요는 세포 치료, FACS에 의해 단일 세포를 분리하는 단계를 포함한도 1에 도시 된 생성 및 단일 세포 용 해물, 단일 세포의 cDNA 라이브러리 확인의으로부터의 cDNA 라이브러리의 프리 앰프 정렬 웰 및 qPCR에 의한 유전자 발현의 측정.

단일 셀 분리 및 유전자 발현 분석을위한 준비에있어서, 먼저 각각의 관심 대상 유전자 유효 올리고 뉴클레오티드 프라이머 쌍을 식별 할 필요가있다. 그림 2는 프라이머 품질 관리 방법의 두 가지 예를 보여줍니다. 용융 곡선은 프라이머 쌍은 테스트중인과 qPCR에 다음 생성됩니다. 유효한 프라이머는 단일 피크 (도 2A, 녹색 곡선)과 용융 곡선을 초래한다. 여러 봉우리 (그림 2A,

토론

우리는 배양에서 성장 부착 세포 집단에서 개별 포유 동물 세포를 분리하는 각 셀에서 약 96 유전자의 발현을 분석하기위한 방법을 제시하고있다. 이 방법은 잘 작동하는 좋은 사전 준비는 매우 중요하다. 프라이머는 단일 셀 측정의 품질을 결정으로서 특히 주목 사체 (1.2~1.3 단계) 특정 설계 및 테스트 프라이머 쌍은, 시간 소모적이지만 중요한 단계이다. 신뢰할 수있는 프라이머 쌍을 얻을되고 나면, 그들은 관심의 성적에서의 cDNA를 증폭하는 데 사용됩니다; 앰플 리콘은 표준 (1.4 단계) 할 몰량에 함께 결합됩니다. 표준 절대 성적 계수를 추정하기 위해 필요하므로이 단계는 매우 중요하다; 표준 한번 만들어 분주하고, 세포 선별 유전자 발현 측정의 모든 후속 라운드를 사용한다. 마찬가지로, 세포 분류되어있는 날에, 그것은 특히 importan 인t은 용해 버퍼의 판 (3.7 및 3.11 단계) 할 때 신중하게 낮은 결합 피펫 팁과 마이크로 원심 튜브를 사용하여 표준을 희석합니다. (단계 4.2) 셀 소터를 목표로 또 다른 중...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
RNase 억제제가 포함된 고용량 cDNA 역전사 키트	ThermoFisher	4374966
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530S
QIAquick Gel 추출 키트	Qiagen	28704
Quant-iT 고감도 dsDNA 분석 키트	써모피셔	Q33120
2.0ml 저접착 미세 원심 분리기 튜브	USA Scientific	1420-2600
DNA 현탁액 버퍼	Teknova	T0221
Axygen 0.2ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR 튜브	Corning	PCR-02-L-C
GE 96.96 동적 어레이 DNA 결합 염료 샘플 및 분석 로딩 시약 키트	Fluidigm	100-3415
HyClone RPMI 1640 배지	GE Healthcare Life Sciences	SH30027.01
소 태아 혈청, 인증(미국)	ThermoFisher	16000-044
항생제-항진균제 솔루션	Corning	30-004-CI
Neocarzinostatin	Sigma	N9162
ELIMINase	Decon Labs	1101
SUPERase-In	ThermoFisher	AM2696
CellsDirect 원스텝 qRT-PCR 키트	ThermoFisher	11753500
E. coli DNA	Affymetrix	14380 10 MG
ThermalSeal 밀봉 필름, 멸균	Excel Scientific	STR-THER-PLT
BD FACSAria IIu	BD Biosciences
HyClone Trypsin 0.05%	GE 헬스케어 생명과학	SH30236.01
PBS, 1x	Corning	21-040-CV
Falcon 40 µ m 세포 여과기	Corning	352340
엑소뉴클레아제 I	New England BioLabs	M0293S
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX	Bio-Rad	172-5210
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
IFC Controller HX (loading machine)	Fluidigm
BioMark 또는 BioMark HD(미세유체 qPCR 기계)	플루이다임
실시간 PCR 분석 소프트웨어	Fluidigm
MATLAB 소프트웨어	MathWorks