우리는 단일 포유류 세포를 분류하고 각 세포에서 최대 96개의 관심 대상 유전자의 발현을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법에는 절대 전사체 수를 추정할 수 있도록 내부 qPCR 표준을 사용하는 것이 포함됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
세포의 벌크 집단에서 유전자 발현을 측정하면 해당 집단 내에서 개별 세포의 상당한 전사체 변이를 모호하게 할 수 있습니다. 단일 세포 유전자 발현 측정은 유전자 발현에서 잡음의 역할을 평가하고, 유전자 쌍 발현의 상관 관계를 식별하고, 자극에 다르게 반응하는 세포의 하위 집단을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 조직 배양에서 성장하는 집단에서 분리된 단일 포유류 세포에서 최대 96개의 유전자 발현을 측정하는 절차를 설명합니다. 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 용해 완충액으로 분류되며, 관심 mRNA 종은 역전사 및 증폭됩니다. 그런 다음 한 번에 최대 96개의 샘플에 대해 최대 96개의 qPCR 분석을 수행하는 미세유체 real-time PCR 기계를 사용하여 유전자 발현을 측정합니다. 또한 각 전사체의 절대 수를 추정할 수 있도록 PCR 앰플리콘 표준물질의 생성 및 사용에 대해서도 설명합니다. 단일 세포에서 유전자 발현을 측정하는 다른 방법과 비교하여, 이 접근법은 RNA-Seq보다 저렴한 비용으로 RNA FISH보다 더 뚜렷한 전사체를 정량화할 수 있습니다.
서론
집단 내의 개별 셀은 균일 생리적 자극 1,2,3,4 널리 상이한 응답을 표시 할 수있다. 인구의 세포의 유전 적 변이는 응답이 다양한 한기구이지만, 심지어 세포의 클론 인구에서, 응답의 변동성을 증가시킬 수있는 몇 가지가 아닌 유전 적 요인도 있습니다. 예를 들어, 각각의 단백질과 다른 중요한 신호 분자의 농도는 하류의 유전자 발현 프로파일의 변동을 초래하는, 셀별로 달라질 수있다. 또한, 유전자 활성화 버스트 7, 8, 9 당 사체 비교적 적은 수로 제한 될 수있다 사체 (5), (6)의 짧은 지속 기간의 버스트에서 발생할 수있다. 이러한유전자 활성화에 확률 성이 크게 생물학적 반응의 다양성에 기여하고, 생리 학적 자극에 반응하는 미생물 (....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 사전 준비
- 발현을 측정한다 관심의 96 유전자까지 선택합니다.
주 : 이들 유전자 중 적어도 하나는 ACTB 또는 GAPDH 같은 "하우스 키핑 유전자의"이어야, 즉 실험에 사용 된 조건하에 상대적으로 일정한 수준으로 발현되는 것으로 알려져있다. 이 유전자는 긍정적 정렬 웰 (단계 8.1) 및 증폭 된 샘플 (단계 10.1)을 식별하는 데 사용된다.
참고 : 예를 들어, 실험, 공지 기능 (11), (14) 및 가정용 제어를 선택했다으로 GAPDH의 다양한 p53과의 직접 대상을 잘 특징. 표적 유전자와 본 연구에 사용 된 프라이머 서열의 전체 목록을 참조 (11)을 참조하십시오. - 15 (과학 문헌 또는 프라이머 디자인 도구 등의 프라이머-BLAST 등을 사용하여, 예를 들어) 관심의 유전자와 관련된 잠재적 인 프라이머 쌍을 확인합니다. 프라이머를 가지고합성 S와 뉴 클레아없는 물 100 μM의 재고 농도를 유지한다.
참고 :이 프라이머는 15-25 기지 여야합니다; 앰플 리콘을 긴 90-130 염기쌍 (BP)를 생성; 하나는 게놈 DNA의 증폭의 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
프로토콜의 일반적인 개요는 세포 치료, FACS에 의해 단일 세포를 분리하는 단계를 포함한도 1에 도시 된 생성 및 단일 세포 용 해물, 단일 세포의 cDNA 라이브러리 확인의으로부터의 cDNA 라이브러리의 프리 앰프 정렬 웰 및 qPCR에 의한 유전자 발현의 측정.
단일 셀 분리 및 유전자 발현 분석을위한 준비에있어서, 먼저 각각의 관심 대상 유전자 유효 올리고 뉴클레오티드 프라이머 쌍을 식별 할 필요가있다. 그림 2는 프라이머 품질 관리 방법의 두 가지 예를 보여줍니다. 용융 곡선은 프라이머 쌍은 테스트중인과 qPCR에 다음 생성됩니다. 유효한 프라이머는 단일 피크 (도 2A, 녹색 곡선)과 용융 곡선을 초래한다. 여러 봉우리 (그림 2A,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리는 배양에서 성장 부착 세포 집단에서 개별 포유 동물 세포를 분리하는 각 셀에서 약 96 유전자의 발현을 분석하기위한 방법을 제시하고있다. 이 방법은 잘 작동하는 좋은 사전 준비는 매우 중요하다. 프라이머는 단일 셀 측정의 품질을 결정으로서 특히 주목 사체 (1.2~1.3 단계) 특정 설계 및 테스트 프라이머 쌍은, 시간 소모적이지만 중요한 단계이다. 신뢰할 수있는 프라이머 쌍을 얻을되고 나면, 그들은 관심의 성적에서의 cDNA를 증폭하는 데 사용됩니다; 앰플 리콘은 표준 (1.4 단계) 할 몰량에 함께 결합됩니다. 표준 절대 성적 계수를 추정하기 위해 필요하므로이 단계는 매우 중요하다; 표준 한번 만들어 분주하고, 세포 선별 유전자 발현 측정의 모든 후속 라운드를 사용한다. 마찬가지로, 세포 분류되어있는 날에, 그것은 특히 importan 인t은 용해 버퍼의 판 (3.7 및 3.11 단계) 할 때 신중하게 낮은 결합 피펫 팁과 마이크로 원심 튜브를 사용하여 표준을 희석합니다. (단계 4.2) 셀 소터를 목표로 또 다른 중.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는이 프로토콜의 개발 과정에서 셀 정렬을 수행하는 그녀의 도움에 대해 CCR ETIB 유동 세포 계측법 코어에서 V. 카푸어에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한이 프로토콜의 개발하는 동안 qPCR에를 수행에서의 원조 M. Raffeld과 CCR LP 분자 진단 장치 및 J. 주홍 및 NHLBI DNA 시퀀싱 및 유전체학 코어 감사합니다. 이 연구는 NIH의 교내 프로그램에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| RNase 억제제가 포함된 고용량 cDNA 역전사 키트 | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel 추출 키트 | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT 고감도 dsDNA 분석 키트 | 써모피셔 | Q33120 | |
| 2.0ml 저접착 미세 원심 분리기 튜브 | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA 현탁액 버퍼 | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR 튜브 | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 동적 어레이 DNA 결합 염료 샘플 및 분석 로딩 시약 키트 | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 배지 | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| 소 태아 혈청, 인증(미국) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| 항생제-항진균제 솔루션 | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect 원스텝 qRT-PCR 키트 | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal 밀봉 필름, 멸균 | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE 헬스케어 생명과학 | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40 µ m 세포 여과기 | Corning | 352340 | |
| 엑소뉴클레아제 I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark 또는 BioMark HD(미세유체 qPCR 기계) | 플루이다임 | ||
| 실시간 PCR 분석 소프트웨어 | Fluidigm | ||
| MATLAB 소프트웨어 | MathWorks |
참고문헌
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
