방법 논문

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

DOI:

10.3791/55222

⸱

2017년 1월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Allergy Unit, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, 2Division of Medicine, Department of Public Health and Clinical Medicine, Umeå University, 3Divison of Infectious Diseases, Department of Clinical Microbiology, Umeå University

이 논문에서

요약

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인간의 수지상 세포(DC)를 포함한 폐 상주 면역 세포는 흡입된 병원체와 알레르겐에 대한 방어에 매우 중요합니다. 그러나 인간의 폐 조직이 부족하기 때문에 연구가 제한적입니다. 이 연구는 면역조직화학 및 유세포 분석을 사용하여 폐 DC를 연구하기 위한 인간 점막 기관지 내 생검을 처리하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

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폐는 무해한 입자 외에도 병원체, 알레르겐 및 독소를 포함하는 외부 환경에 지속적으로 노출됩니다. 내성을 유지하거나 면역 반응을 유도하기 위해서는 면역 체계가 흡입된 항원을 적절하게 처리해야 합니다. 폐 수지상 세포(DC)는 과장된 염증 반응으로 인해 폐에 부수적 손상을 일으키지 않고 필요할 때 면역을 시작하기 위해 섬세한 균형을 유지하는 데 필수적입니다. 인간 혈액 내 DC와 같은 면역 세포의 표현형과 기능에 대한 자세한 이해는 있지만, 특히 건강한 개인의 인간 폐 조직 샘플에 대한 연구가 부족하기 때문에 폐와 같이 접근하기 어려운 조직에서 이러한 세포에 대한 지식은 훨씬 더 제한적입니다. 이 연구는 기관지 내 생검 샘플링을 위해 기관지 내시경 검사를 받는 건강한 사람의 폐 조직 상주 DC의 상세한 공간 및 표현형 특성화를 생성하는 전략을 제시합니다. 각 개인으로부터 여러 개의 작은 생검을 수집할 수 있으며, 이후 초미세 절편을 위해 내장하거나 고급 유세포 분석을 위해 효소로 분해할 수 있습니다. 요약된 프로토콜은 정상 상태 조건에서 낮은 빈도의 DC만 포함하는 작은 조직 샘플에서 최대한의 정보를 얻을 수 있도록 최적화되었습니다. 본 연구는 DC에 초점을 맞추고 있지만, 설명된 방법은 점막 폐 조직에서 발견되는 다른 (면역) 관심 세포를 포함하도록 직접 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 유육종증 또는 폐암과 같은 기관지 내시경 검사가 진단을 확립하는 데 필요한 폐 질환을 앓고 있는 환자로부터 얻은 샘플에도 직접 적용할 수 있습니다.

서론

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폐는 외부 환경과 연속적인 접촉이 높은 질환을 유발하는 능력 모두에 무해 입자와 미생물에 노출된다. 따라서, 침입 병원균에 대한 강력한 면역 반응을 탑재 면역계에 중요하지만, 질병의 원인이없는 흡입 항원에 대한 내성을 유지하는 것도 중요하다. 강력한 면역 감시를 제공하기 위해 호흡기는 수지상 세포를 포함하여 면역 세포의 네트워크 늘어서있다. 수지상 나이브 T 세포를 활성화 할 수있는 독특한 능력을 가진 전문적인 항원 제시 세포이다. 인간 폐, 상주 수지상 항원 다음 프로세스가 발생하여 T 세포를 1, 2, 3으로 표시 및 활성화에 대한 폐 림프절로 전송.

인간 면역계 DCS는 디스탱으로 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다CT하지만 중복 기능 : CD1c +와 CD141 + 골수성 수지상 세포 (MDC에) 및 CD123 + 형질 DC가 (올라가고) 4, 5. 인간 수지상 가장 상세한 기술은 혈액 유래 연구 동안, 인간의 폐는 T 세포 자극 용량 6, 7, 8, 9 DC 서브 세트 드문 인구 항구 것이 이제 명백하다. 그러나, 누적 데이터는 수지상 세포를 포함하는 면역 세포가 자신의 해부학 적 위치 (10)에 따라 빈도, 표현형 및 기능에 차이가 있음을 보여준다. 따라서, 로컬 면역 관용에 대한 그들의 기여를 이해하기 위해 관련 조직에서 면역 세포를 연구하는 것이 중요하다. 함께 찍은,이 혈액 DC가 더 쉽게 사용 가능하고 접근에도 불구하고, 폐 질환을 해결하면 폐 상주 수지상 세포를 연구 할 필요성을 강조 인간한다.

인간 폐 상주 수지상 조사 제의 연구는 주로 면역 11, 12, 13을 이용하여 조직 절편에서 형태 및 HLA-DR의 CD11c와 같은 하나의 마커의 발현에 의존했다. 대조적으로, 통상적으로 유세포에 의존 더 최근의 연구는 다양한 면역 세포 서브 세트를 연구 분석한다. 그 고유 특정 DC 서브 세트를 식별하는 하나의 세포 표면 마커를 찾는 것은 어렵다 때문에, 연구의 전위 한계는 단지 4 색은 유세포인가하는 수지상 세포와 유사한 표현형 마커와 세포 집단 등의 위험이있다. 예를 들어, 중 CD11c 모든 골수성 수지상 세포와 단핵 세포의 대부분에 표현된다. 한편, 연구 고급 유동 세포 계측법 패널을 적용하여 환자의 수술 적 절제로부터 비 암성 폐 조직은 통상적으로 사용 된외부 참조 "> 10, 14, 15, 16은, 이들 희소 인구 건강한 피험자의 DCS 본 진정 대표 불분명 않는다. 전체적으로 연구 인해 수술 제거 또는 전부를 인간 폐 조직이 부족하다는 사실에 크게 제한된다.

이러한 한계들을 극복하기 위해,이 작품은 공간 분포와 기관지 내시경을 받아야 건강한 지원자에서 얻은 점막 기관지 생검에서 수지상 세포의 표현형 식별에 대한 자세한 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 작은 생검 각에서 수집 될 수 있고,이어서 절편 분석 고급 유세포 분석을위한 분해 효소를 사용하여 면역 조직 화학 또는 임베디드 될 수있다. bronchoscopies 얻은 기관지 생검 형태의 폐 조직을 사용하는 것은 가능 명세서를 수행 할 수있게하는 장점을 부여udy는 건강한 지원자에서, 폐의 개복 수술과는 달리 분명한 이유, 흉부 수술이 필요한 환자에게 제한되어있다. 또한, 건강한 지원자에서 기관지 중 샘플링되는 조직은 폐 질환을 가진 환자의 폐 조직의 영향을받지 않는 영역에 대조적으로, 생리 학적으로 정상인. 한편, 생검 작은 여러 생검 풀링에도 검색된 셀의 수는 수행 될 수있는 분석의 유형을 제한한다.

본 연구는 수지상 세포에 초점을 맞추고 있지만, 직접 확장 할 수 있습니다 설명하는 방법은 인간의 점막 폐 조직에있는 관심의 다른 (면역) 세포를 포함합니다. 또한, 프로토콜은 기관지 같은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 유육종증, 폐 암으로 진단을 확립의 일부 폐 질환을 앓고있는 환자로부터 얻은 샘플에 직접 적용 할 수있다.

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프로토콜

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참고 :이 연구는 우메 아, 스웨덴의 지역 윤리 심의위원회에 의해 승인되었다.

인간의 주제에서 샘플링 기관지 생검 1. 기관 지경

  1. 모든 참가자의 동의를 얻습니다.
  2. 경구 용 미다 졸람 (4-8 mg) 및 정맥 glycopyrronium (0.2-04 mg을)를 기관지 전에 30 분으로 주제를 취급합니다. 후두와 기관지에 리도카인으로 국소 마취를 적용합니다. 리도카인 4 % ~ 3 ㎖와 제목 양치질을하자 혀베이스와 후두 주사기를 통해 후두에 3 ㎖를 적용합니다. 리도카인 스프레이의 8-10 투여와 국소 마취를 최적화합니다. 제목 앉아이 단계를 수행합니다.
  3. 앙와위에서 주제와 플라스틱 마우스 피스를 통해 입을 통해 유연한 비디오 기관 지경을 삽입합니다. 기관 지경을 통해 말단 기관 및 기관지의 국소 마취를 완료 할 목적으로 만든 스프레이 카테터를 사용합니다. 여기에, 약의 복용량을 사용리도카인 2 % ~ 10 mL로.
  4. 6-9 주 카리나에서 기관지 점막 생검과 유창 집게를 사용하여 주 기관지 부문 (그림 1) 가져 가라. 기관지 내시경을 다음과 병원을 떠나기 전에, 2-4 시간 동안 주제 나머지를하자 가벼운 식사와 함께 그를 / 그녀를 제공합니다.

2. 글리콜 메틸 아크릴 레이트 (GMA) 수지의 생검을 포함하기

주 : GMA의 면역 프로토콜은 원래 사우 샘프 턴 대학, 조직 화학 연구 (17)에서 개발되었다.

  1. 고정 : 면역 조직 화학 법의 경우, 집게로부터 생검을 제거하고 (얼음 - 냉각 탈수 아세톤 및 프로테아제 저해제 3 ㎖을 함유하는 유리 병에 직접 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드 (35 밀리그램 / 100 ml의 아세톤)을 넣고 요오도 아세트 아미드 (370 밀리그램 / 100 ml의 아세톤 )). -20 ° C (그림 2)에서 하룻밤 조직을 수정합니다.
    참고 : 다음 단계를 PERFO한다적절한 니트릴 장갑 흄 후드에서 rmed. 매립 키트 과민, 자극, 및 / 또는 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수있는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 모든 폐기물은 유해 폐기물로 폐기되어야합니다.
  2. 탈수 : 억제제와 아세톤을 제거하고 실온에서 15 분 (RT)에 대한 (억제제)없이 신선한 탈수 아세톤으로 교체합니다. 아세톤을 제거하고 15 분 동안 메틸 벤조 에이트로 교체합니다.
  3. 침투 : 글리콜 메타 크릴 레이트 단량체의 5 % 메틸 벤조 에이트 용액의 처리 액을 준비한다; 10 ㎖ 바이알 한 충분하다. 메틸 벤조 에이트 용액 오프 플라스틱 파스퇴르 피펫 흡입을 이용하여 처리 액 3ml를 교체. 생검 2 시간 동안 4 ° C에서 초과 처리 솔루션을 품어; 파스퇴르 피펫 용액 매립 포함한 모든 후속 용액 변화에 사용될 수있다.
  4. 처리 액마다 2 시간 (3X 2 시간 인큐베이션)이므로 생체의 합계 함침 시간을주고처리 액에 psies 적어도 6 시간이다. 생검을 식별하기 위해 삽입 캡슐의 상단에 종이 라벨을 삽입합니다.
  5. 글리콜 메타 크릴 레이트 단량체를 10 ml의 75 mg의 벤조일 퍼 옥사이드 매립 용액을 제조 하였다. 중합 반응을 시작하기 위해 매립 용액에 N, N -dimethylaniline 폴리 (에틸렌 옥사이드) 0.25 ㎖ (가속기)를 추가한다. 처리 액을 제거하고 집게를 사용하여 관련 매립 캡슐에 한 생검을 놓는다.
  6. 천천히 솔루션을 포함로 가기 포함 캡슐을 채우고 뚜껑을 닫습니다. 생검을 방해하고 큰 공기 방울을 생성하지 마십시오. 수지가 완전히 중합 될 때까지 4 ℃에서 캡슐을 품어.
  7. 실리카겔 약 5g을 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 -20 ° C에 보관 매립 생검.

GMA 내장 기관지 생검 3. 단면

  1. 현미경 슬라이드 코팅 : A의 현미경 슬라이드를 씻으정상주기에 식기 세척기. 슬라이드를 덮고 건조 공기로 할 수 있습니다.
  2. 증류수 10 % 폴리 -L- 리신 (PLL) 용액의 도포 액을 준비한다. 5 분 동안 코팅 용액의 슬라이드 잠수함, 다음 그들에게 자연 건조를 할 수 있습니다. 원래 상자에 건조 PLL 코팅 된 슬라이드를 저장합니다.
  3. 증류수에 0.1 %의 트윈 20을 시트 유리 스트립을 씻으십시오. 종이 타월로 70 % 에탄올 건조와 유리를 씻어. 칼 메이커를 사용하여 유리 스트립 유리 블레이드를 잘라. 절삭 날이 손상되거나 흠집되지 않도록 이동을 방지 용기에 블레이드를 저장한다.
  4. 생검 트리밍 : 캡슐 분배기의 생검 캡슐을 놓고 탄소 강철 단일 에지 블레이드를 사용하여 각면을 잘라. GMA 내장 조직 검사를 제거하고 그 단단히 놓습니다. 철강 블레이드를 사용하여 조직 검사 주위에서 초과 GMA을 낸다.
  5. GMA의 단면.
    1. 증류수 0.05 % 암모니아 용액을 준비합니다. 일에서 유리 나이프와 조직 검사를 배치전자 마이크로톰. 조심스럽게 블레이드 블록의 표면에 대해 평평하게 걸쳐 지도록 나이프 홀더 생검 블록의 각도를 조절함으로써 블레이드 생검 블록 정렬.
    2. 느린 절단 속도에 마이크로톰을 사용하여 2 μm의 두께 부분을 잘라 전송하고 암모니아수에 섹션을 떠 집게를 사용합니다. 부드러운 항원 검색을 허용하고 섹션의 전개, 45-90 초 동안 섹션을 플로트.
    3. 현미경 슬라이드에 섹션을 선택합니다. 빨리 톨루이딘 블루 염색에 의해 생검 조직 검사를 확인합니다.
    4. 50 ° C에 핫 플레이트 세트에 슬라이드를 건조 및 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 섹션을 여과 톨루이딘 블루 염색의 500 μl를 적용합니다. 녹색 링이 얼룩의 가장자리에 등장하기 시작할 때까지 뜨거운 접시에 절을 따뜻하게 한 다음 물로 씻어 내십시오.
    5. 광학 현미경을 사용하여, 생검 조직 검사를 확인합니다. 면역 조직 화학 염색에 사용되는 섹션은 손상되지 않은 얇은 판의 좋은 부분을 포함해야적은 수의 분비 가능한 한 작은 평활근과 고유 층과는 상피.
    6. 섹션 3.4.2에서와 같이, 좋은 조직학이 부분을 절단 및 면역 조직 화학 염색을위한 PLL 코팅 현미경 슬라이드로를 선택합니다. 분석을 위해 각 조직 검사에서 적어도 두 부분을 잘라. 적어도 1 시간 동안 건조 슬라이드. 건조 후, 절편 주석 호일로 래핑 할 수 있고, 최대 2 주 동안 -20 ℃에서 보관하거나 즉시 면역 염색 할 수있다.

GMA 내장 기관지 생검 4. 면역 조직 화학 염색

주 : 아 지드 화 나트륨은 독성이있다. 흄 후드 내의 0.1 % 나트륨 아 지드의 용액을 제조하고 산으로부터 멀리. 산에 접촉하면 유독 가스를 방출합니다.

  1. 다이아몬드로 만들어진 펜을 사용하여 섹션을 주위에 그려 염색 선반 위에 슬라이드를 정렬합니다.
  2. 퍼 옥시 다제 블록을 수행합니다. 0.1 % 아 지드 화 나트륨 용액에 0.3 %의 과산화수소를 퍼 옥시 다제 블록 용액을 제조 하였다. 출원Y 1 부에 퍼 옥시다아제 블록 ㎖를 30 분 동안 배양한다.
  3. 0.05 M 트리스 완충 식염수 (TBS), 산도 7.6의 세척 용액을 준비합니다. , TBS에서 3 배 5 분 슬라이드를 씻으십시오.
  4. DMEM의 1 % BSA 블록 솔루션을 준비합니다. 사전에 큰 볼륨, 나누어지는에서이 작업을 수행하고 필요한 때까지 동결. 슬라이드 드레인 비특이적 결합 된 항체를 차단하는 블록을 30 분 동안 용액 중에서 섹션을 배양한다. 비특이적 결합은 여전히 ​​발생하면, 이차 항체와 같은 종으로부터의 5 % 혈청 블록과 함께 30 분간 배양 단계를 포함한다.
  5. (:; 따라 CD1a 1로 희석 1,000 : 1,00 1 희석 CD45) 및 슬라이드에 적용하여 원하는 농도로 TBS에서 차 항체 (CD45 또는 따라 CD1a)를 희석. 섹션을 커버 슬립과 RT에서 밤새 품어.
  6. TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. (TBS에서 원하는 농도 (2)이 경우, 토끼 항 마우스 F (AB '에서 일차 항체 숙주 종에 대해 유도) 1:30 비오틴 차 항체 희석0 희석)과 슬라이드에 적용됩니다. 실온에서 2 시간 동안 품어.
  7. 사용하기 전에 스트렙 타비 딘 비오틴 - 퍼 옥시 다제 복잡한 적어도 30 분을 준비합니다. 모든 슬라이드를 커버하기에 충분 있는지 확인하십시오. TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. 슬라이드에 대한 해결책을 적용하고 실온에서 2 시간 동안 품어.
  8. TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. 3- 아미노 9 에틸 카바 졸 (제조업체의 지침에 따라 제조) (AEC) 퍼 옥시 다제 기질 용액을 준비합니다. 슬라이드에 적용하고 20 ~ 30 분 동안 또는 원하는 얼룩 강도가 개발 될 때까지 배양한다.
  9. 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻어. 2 분 동안 여과 마이어의 헤 마톡 솔루션 섹션을 Counterstain과. 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻으십시오.
  10. 슬라이드를 배출하고 영구적 인 수성 장착 매체와 섹션을 커버한다. 건조 오븐에서 80 ℃에서 슬라이드를 건조. 슬라이드 냉각 한 다음 DPX로 장착하고 커버 슬립을 배치 할 수 있습니다.

5. 세인트aining 분석

  1. 컴퓨터에 연결 탑재 된 카메라로 광학 현미경을 사용하여 40X 배율 섹션을 분석합니다.
    참고 : 세포 분석을 위해 적극적으로 부드러운 근육, 동맥, 큰 혈관과 일치하지 않는 또는 손상된 조직의 영역을 제외하고, 기관지 점막 고유 그대로 상피 세포 내 핵 세포를 염색 카운트.
  2. 세포 수를 평균 고유 층의 면적 및 상피의 길이에 대한 평균 세포 수를 수정한다. 고유 판 및 상피의 길이의 영역은, 화상 해석 프로그램을 사용하여 계산 될 수있다.

기관지 생검 6. 효소 소화

  1. 세탁기 생검 : 행크 완충 식염수 용액 (HBSS) (도 3) 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 무균 핀셋 장소 생검 그대로 사용. 30 rpm에서 락을 플랫폼에서 RT에서 5 분 동안 품어. 멸균 D에 조직 검사로 이동HBSS로 15ml의 튜브의 함유량을 경사하여 틱.
  2. DTT와 점액을 중단 : 5 mM의 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 포함 HBSS 10 ㎖로 튜브의 HBSS를 교체합니다. 멸균 집게를 사용하여 15 ML 튜브에 다시 조직 검사를 전송합니다. 30 rpm에서 락 플랫폼에서 실온에서 15 분 동안 품어.
  3. 15 초 동안 부드럽게 튜브를 소용돌이. HBSS DTT와 함께 15 ml의 튜브의 함유량을 경사 분리하여 멸균 접시 상 생검을 전송.
  4. 문화 매체에 조직 검사를 전송 : RPMI 1640 배지 10 ㎖로 튜브의 HBSS과 DTT를 교체합니다. 멸균 집게를 사용하여 15 ML 튜브에 다시 조직 검사를 전송합니다. 30 rpm에서 락 플랫폼에서 실온에서 10 분 동안 품어.
  5. 콜라게나 제와 DNase의와 생검을 소화.
    1. 1 M HEPES 용액을 함유하는 예비 가온 RPMI에서 콜라게나 제 II (0.25 ㎎ / ㎖)과의 DNase (0.2 ㎎ / ㎖)의 분해 용액을 제조 하였다. 48 웰 조직 숭배에 500 μL 잘 당 소화 용액 추가URE 판.
    2. 소화 용액 아니라 당 조직 검사를 놓습니다. 220 rpm에서 37 ° C에서 60 분 동안 진탕 플랫폼에서 접시를 품어. 피펫 30 분의 생검을 재 분산 한 후 아래로, 그리고 60 분 후가 완전히 조직들을 분해한다.
  6. 단일 세포 현탁액을 준비.
    1. 함께 수영장 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하여 50 ㎖ 튜브에 우물에서 소화 생검. 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 (인산염 완충 식염수 (PBS)를 함유하는 2 % 소 태아 혈청)으로 웰을 세척하여 잔여 세포를 수집한다.
    2. 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 세포 여과기에 남아있는 조직을 짠다. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에서 소화 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 얼음 - 냉각 된 FACS 완충액 5 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 수동으로 세포의 생존력을 평가하기 혈구 및 트립 판 블루 염색을 이용하여 세포 수를 계산.

7. 효소 분해 후 기관지 생검의 단일 세포의 유세포 분석

  1. FACS 완충액 200㎕를 약 1 × 106 세포의 세포 펠렛을 resuspend.
  2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 죽은 세포 배제에 대한 세포 생존 염료를 추가합니다.
  3. 의 FcR 차단 시약의 5 ​​μl를 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 품어.
  4. , CD16 (0.5 μL), HLA-DR (3 μL)의 CD11c (5 μL), CD123, CD45 (2 μL), 계보 (2 ㎕를 각 CD3, CD20, CD56, CD66abce 및 CD14)에 대한 세포 표면 항체 추가 (5 μL), CD1c (3 μL), 및 CD103 (2 μL), 4 ℃에서 15 분 동안 품어. 항체에 대한 세부 사항은 방법 섹션에서 찾을 수 있지만, 사용 사이토 정확한 흐름에 항체를 적정하고 최적화 할 수 있습니다. 400 X g에서 5 분 동안 PBS로 여분의 항체를 씻으십시오. 사이토의 흐름에 신선한 샘플을 취득 이상 acquisit 이전에 1 % 파라 포름 알데히드의 세포를 고정이온.
  5. 분석 (18) (그림 4) 세포 계측법 흐름을 사용하여 폐 조직 검사에서 인간의 수지상 세포를 식별합니다.
    주 : 분석 소프트웨어 유세포를 사용하여, 면역 세포가 CD45에 게이팅하여 다른 폐 세포로부터 구별된다. 죽은 세포는 LIVE / DEAD 염료에 대한 긍정적 인 세포로 제외 할 수 있습니다. 모든 살아있는 CD45 + 세포 계통 세포 (B 세포, T 세포, NK 세포, 호중구 및 단핵 세포)의 한 채널에서 CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 및 CD16에 대한 항체의 칵테일을 사용하여 배제 할 수있다. , HLA-DR + 세포가 인간의 모든 DC가의 식별을 허용 할 것을 다음과 같습니다. 이 중 CD11c MDC에 발현하는 CD11c 또는 각각의 부재에 기초하여 올라가고 구별 될 수있다. MDC에 더 CD1c + MDC에 또는 CD141 +로 나눌 수 있습니다.

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결과

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DC를 비롯한 인간 호흡기 조직 상주 면역 세포를 특성화 연구는 주로 수술로 인해 제거되거나 전체 인간 폐 조직이 부족하다는 사실을 한정한다. 여기서, 면역 세포 계측법을 사용하여 조직의 면역 세포를 분석하거나, 유동 건강한 지원자 및 개발 프로토콜 기관지 생검 (EBB)로부터 폐 조직을 얻는 덜 침습적 방법이 설명된다.

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토론

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이 논문은 면역 조직 화학 염색을 이용하여 건강한 인간의 폐 조직 상주 수지상의 상세한 공간 및 표현형 특성을 생성하고 기관지 동안 수집 된 기관지 점막 생검에 유동 세포 계측법하는 방법에 대해 설명합니다. 다음 단락에서 프로토콜의 중요한 단계를 자세히 설명합니다.

프로토콜과 중요한 단계

단면 및 면역 : 그것은 그들이 (단계 2.5)를 사용하지 않는 경우 -20 ℃에서 생검 블록을 유지하는 것이 중요하다. 따뜻한 블록 때로는 부드러운 될 수 있습니다 및 섹션도하지 않습니다. 또한, -20 ° C에서 블록을 유지하는 항원 부위를 보존하고 면역 조직 화학 염색을 사용하여 더 초래할 것이다.

단면 및 면역 조직 화학 다음 GMA 내장 조직 검사를 절편 때,에 섹션을 떠 할 수 암모니아수 3-4 용기가 편리합니다. 섹션이 포착되고, 엄마신선한 섹션 (단계 3.4)로 교체해야 애. 이것...

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는이 연구에 임상 자료를 공헌 한 자원 봉사자에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 모든 임상 자료의 수집을위한 보건 임상 의학, 의학 / 호흡기 의학 전공, 대학 병원, 우메 (Norrlands의 universitetssjukhus)의 부서의 직원들에게 감사하다.

이 작품은 스웨덴 연구 협의회, 스웨덴 심장 - 폐 재단, 전략적 연구를위한 스웨덴 재단과 카롤린스카 연구소에서 AS-S에 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160OlympusBF1T160
광원 OlympusExera CV-160
Fenestrated 펜치OlympusFB21C생검
Bite BlockConmed142920 mm x 27 mm
포도당 25%를500ml 정맥 주사
글리코피로늄 브로마이드 0.2mg/ml정맥 주사. 점액/타액 분비
Mixt를 방지합니다. Midazolam 1 mg/ml p.o추가 휴식에 사용할 수 있습니다
리도카인, 40mg/ml입 및 인후 투여 / 가글
리도카인 100mg/ml 스프레이목 뒤쪽에 투여
리도카인 20mg/ml 스프레이기관지경을 통해 기도에 투여
GMA 가공 및 임베딩
유리 바이알5ml
아세톤Sigma-Aldrich32201-1L
분자체, 4 ÅAlfa Aesar881203-4 mm 직경 펠릿
Phenylmethylsulfonyl fluorideSigma-AldrichP-76260.035 g/100 ml 아세톤
IodoacetamideSigma-AldrichI-61250.37 g/100 ml 아세톤
폴리에틸렌-플랫  TAAB 임베딩 캡슐TAAB 실험실C094500x 8mm 직경, 폴리에틸렌, 평평한 바닥 캡슐
캡슐 홀더TAAB 실험실C05425 8mm 캡슐
수용 JB-4 GMA 임베딩 키트Polysciences00226JB-4 솔루션 A (0026A-800), JB-4 솔루션 B (0026B-3.8), 과산화 벤조일 (02618-12)
메틸 벤조 에이시그마-알드리치27614-1L
습도 지시자가 있는 실리카 겔ScharlauGE00432.5-6 mm 
GMA 절편
유리 현미경 슬라이드ThermoFisher Scientific10143562CEF절단 가장자리, 서리 덥은 끝
Poly-L-Lysine 용액Sigma-AldrichP8920-500mL1:10 작업 용액
시트 유리 스트립Alkar
Tween 20Sigma-AldrichP2287Wash 용액(0.1% Tween20)
LKB 7800B 나이프메이커LKB
캡슐 스플리터TAAB 실험실C065
탄소강 단일 모서리 블레이드TAAB 실험실B054
바이스
암모니아, 25%VWR1133.10002ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
MicrotomeLeicaLeica RM 2165
광원LeicaLeica CLS 150 XE
스윙 암 스탠드가 있는 현미경LeicaLeica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped penHistolab5218
과산화수소 30% 용액AnalaR Normapur23619.264
아지드 나트륨Sigma-AldrichS8032
TrisRoche10708976001
염화나트륨VWR 화학 물질27810.295
소 혈청 알부민Millipore82-045-2Probumin BSA 진단 등급
Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM)Sigma-AldrichD5546
Anti-human CD45 항체BioLegend304002마우스 단클론, 클론 HI30, 동형 IgG1k. 500ng/ml
항인간 CD1a 항체AbD SerotechMCA80GAMouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a의 작동 농도. 10 &마이크로의 작업 농도; g/ml
마우스 단클론 IgG1 이소타입 제어Abcamab27479
마우스 단클론 IgG2a 이소타입 제어DakoX094301-2
Vectastain ABC Elite 표준 키트Vector LabsPK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kiteVector LabsSK-4200
Mayers haematoxylinHistoLab01820
영구 수성 장착 매체AbD SerotechBUF058C
건조 오븐
DPX 영구 장착 솔루션 VWR360292F
광학 현미경Leica LeicaDMLB
현미경 카메라LeicaLeica DFC 320
분석 소프트웨어LeicaLeica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-Aldrich55021C
디티오트레이톨 (DTT)시그마-알드리치DTT-RO
콜라겐분해효소 II시그마-알드리치C6885
DNase시그마-알드리치10104159001  ROCHE
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
포셉스
플랫폼 로커그랜트 악기PMR-30
50 ml 원뿔형 튜브Falcon14-432-22
40 µ m cell strainerFalcon352340
flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kitLife TechnologiesL34957
CD45BD555485
CD3BD557757
CD20BD
CD56Biolegend318332
CD66abceMiltenyi130-101-132
HLA-DRBD
CD14BD557831
CD16Biolegend302026
CD11cBD560369
CD1cMiltenyi130-098-009
CD141Miltenyi130-090-514
CD103Biolegend350212
파라포름알데히드Sigma-AldrichF8775
LSR II 유세포 분석기BD유세포 분석기
FlowJoFlowJo분석 소프트웨어
촬영하는 데 사용됩니다.트 포함 용 335829 555813

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

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