인간의 수지상 세포(DC)를 포함한 폐 상주 면역 세포는 흡입된 병원체와 알레르겐에 대한 방어에 매우 중요합니다. 그러나 인간의 폐 조직이 부족하기 때문에 연구가 제한적입니다. 이 연구는 면역조직화학 및 유세포 분석을 사용하여 폐 DC를 연구하기 위한 인간 점막 기관지 내 생검을 처리하는 프로토콜을 제시합니다.
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방법 논문
면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포
이 논문에서
요약
초록
폐는 무해한 입자 외에도 병원체, 알레르겐 및 독소를 포함하는 외부 환경에 지속적으로 노출됩니다. 내성을 유지하거나 면역 반응을 유도하기 위해서는 면역 체계가 흡입된 항원을 적절하게 처리해야 합니다. 폐 수지상 세포(DC)는 과장된 염증 반응으로 인해 폐에 부수적 손상을 일으키지 않고 필요할 때 면역을 시작하기 위해 섬세한 균형을 유지하는 데 필수적입니다. 인간 혈액 내 DC와 같은 면역 세포의 표현형과 기능에 대한 자세한 이해는 있지만, 특히 건강한 개인의 인간 폐 조직 샘플에 대한 연구가 부족하기 때문에 폐와 같이 접근하기 어려운 조직에서 이러한 세포에 대한 지식은 훨씬 더 제한적입니다. 이 연구는 기관지 내 생검 샘플링을 위해 기관지 내시경 검사를 받는 건강한 사람의 폐 조직 상주 DC의 상세한 공간 및 표현형 특성화를 생성하는 전략을 제시합니다. 각 개인으로부터 여러 개의 작은 생검을 수집할 수 있으며, 이후 초미세 절편을 위해 내장하거나 고급 유세포 분석을 위해 효소로 분해할 수 있습니다. 요약된 프로토콜은 정상 상태 조건에서 낮은 빈도의 DC만 포함하는 작은 조직 샘플에서 최대한의 정보를 얻을 수 있도록 최적화되었습니다. 본 연구는 DC에 초점을 맞추고 있지만, 설명된 방법은 점막 폐 조직에서 발견되는 다른 (면역) 관심 세포를 포함하도록 직접 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 유육종증 또는 폐암과 같은 기관지 내시경 검사가 진단을 확립하는 데 필요한 폐 질환을 앓고 있는 환자로부터 얻은 샘플에도 직접 적용할 수 있습니다.
서론
폐는 외부 환경과 연속적인 접촉이 높은 질환을 유발하는 능력 모두에 무해 입자와 미생물에 노출된다. 따라서, 침입 병원균에 대한 강력한 면역 반응을 탑재 면역계에 중요하지만, 질병의 원인이없는 흡입 항원에 대한 내성을 유지하는 것도 중요하다. 강력한 면역 감시를 제공하기 위해 호흡기는 수지상 세포를 포함하여 면역 세포의 네트워크 늘어서있다. 수지상 나이브 T 세포를 활성화 할 수있는 독특한 능력을 가진 전문적인 항원 제시 세포이다. 인간 폐, 상주 수지상 항원 다음 프로세스가 발생하여 T 세포를 1, 2, 3으로 표시 및 활성화에 대한 폐 림프절로 전송.
인간 면역계 DCS는 디스탱으로 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다CT하지만 중복 기능 : CD1c +와 CD141 + 골수성 수지상 세포 (MDC에) 및 CD123 + 형질 DC가 (올라가고) 4, 5. 인간 수지상 가장 상세한 기술은 혈액 유래 연구 동안, ....
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프로토콜
참고 :이 연구는 우메 아, 스웨덴의 지역 윤리 심의위원회에 의해 승인되었다.
인간의 주제에서 샘플링 기관지 생검 1. 기관 지경
- 모든 참가자의 동의를 얻습니다.
- 경구 용 미다 졸람 (4-8 mg) 및 정맥 glycopyrronium (0.2-04 mg을)를 기관지 전에 30 분으로 주제를 취급합니다. 후두와 기관지에 리도카인으로 국소 마취를 적용합니다. 리도카인 4 % ~ 3 ㎖와 제목 양치질을하자 혀베이스와 후두 주사기를 통해 후두에 3 ㎖를 적용합니다. 리도카인 스프레이의 8-10 투여와 국소 마취를 최적화합니다. 제목 앉아이 단계를 수행합니다.
- 앙와위에서 주제와 플라스틱 마우스 피스를 통해 입을 통해 유연한 비디오 기관 지경을 삽입합니다. 기관 지경을 통해 말단 기관 및 기관지의 국소 마취를 완료 할 목적으로 만든 스프레이 카테터를 사용합니다. 여기에, 약의 복용량을 사용리도카인 2 % ~ 10 mL로.
- 6-9 주 카리나에서 기관지 점막 생검과 유창 집게를 사용하여 주 기관지 부문 (그림 1) 가져 가라. 기관지 내시경을 다음과 병원을 떠나기 전에, 2-4 시간 동안 주제 나머지를하자 가벼운 식사와 함께 그를 / 그녀를 제공합니다....
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결과
DC를 비롯한 인간 호흡기 조직 상주 면역 세포를 특성화 연구는 주로 수술로 인해 제거되거나 전체 인간 폐 조직이 부족하다는 사실을 한정한다. 여기서, 면역 세포 계측법을 사용하여 조직의 면역 세포를 분석하거나, 유동 건강한 지원자 및 개발 프로토콜 기관지 생검 (EBB)로부터 폐 조직을 얻는 덜 침습적 방법이 설명된다.
이전 19 20 설명 된대로 건강한 자원 봉사자, 기관지 내시경을 시행 하였다. 6 ~ 9 1-2mm 3 기관지 점막 생검은 주 카리나와 유창 집게를 (그림 1A)를 사용하여 각 과목의 주요 기관지 부서에서 촬영되었다. 두 생검 GMA 내장이어서 공간 정보를 제공하기 위하여 면역 조직 화학.......
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토론
이 논문은 면역 조직 화학 염색을 이용하여 건강한 인간의 폐 조직 상주 수지상의 상세한 공간 및 표현형 특성을 생성하고 기관지 동안 수집 된 기관지 점막 생검에 유동 세포 계측법하는 방법에 대해 설명합니다. 다음 단락에서 프로토콜의 중요한 단계를 자세히 설명합니다.
프로토콜과 중요한 단계
단면 및 면역 : 그것은 그들이 (단계 2.5)를 사용하지 않는 경우 -20 ℃에서 생검 블록을 유지하는 것이 중요하다. 따뜻한 블록 때로는 부드러운 될 수 있습니다 및 섹션도하지 않습니다. 또한, -20 ° C에서 블록을 유지하는 항원 부위를 보존하고 면역 조직 화학 염색을 사용하여 더 초래할 것이다.
단면 및 면역 조직 화학 다음 GMA 내장 조직 검사를 절편 때,에 섹션을 떠 할 수 암모니아수 3-4 용기가 편리합니다. 섹션이 포착되고, 엄마신선한 섹션 (단계 3.4)로 교체해야 애. 이것.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는이 연구에 임상 자료를 공헌 한 자원 봉사자에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 모든 임상 자료의 수집을위한 보건 임상 의학, 의학 / 호흡기 의학 전공, 대학 병원, 우메 (Norrlands의 universitetssjukhus)의 부서의 직원들에게 감사하다.
이 작품은 스웨덴 연구 협의회, 스웨덴 심장 - 폐 재단, 전략적 연구를위한 스웨덴 재단과 카롤린스카 연구소에서 AS-S에 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| 광원 | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated 펜치 | Olympus | FB21C | 생검 |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| 포도당 25%를 | 500ml 정맥 주사 | ||
| 글리코피로늄 브로마이드 0.2mg/ml | 정맥 주사. 점액/타액 분비 | ||
| Mixt를 방지합니다. Midazolam 1 mg/ml p.o | 추가 휴식에 사용할 수 있습니다 | ||
| 리도카인, 40mg/ml | 입 및 인후 투여 / 가글 | ||
| 리도카인 100mg/ml 스프레이 | 목 뒤쪽에 투여 | ||
| 리도카인 20mg/ml 스프레이 | 기관지경을 통해 기도에 투여 | ||
| GMA 가공 및 임베딩 | |||
| 유리 바이알 | 5ml | ||
| 아세톤 | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| 분자체, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm 직경 펠릿 |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml 아세톤 |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml 아세톤 |
| 폴리에틸렌-플랫 TAAB 임베딩 캡슐 | TAAB 실험실 | C094 | 500x 8mm 직경, 폴리에틸렌, 평평한 바닥 캡슐 |
| 캡슐 홀더 | TAAB 실험실 | C054 | 25 8mm 캡슐 |
| 수용 JB-4 GMA 임베딩 키트 | Polysciences | 00226 | JB-4 솔루션 A (0026A-800), JB-4 솔루션 B (0026B-3.8), 과산화 벤조일 (02618-12) |
| 메틸 벤조 에이 | 시그마-알드리치 | 27614-1L | |
| 습도 지시자가 있는 실리카 겔 | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA 절편 | |||
| 유리 현미경 슬라이드 | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | 절단 가장자리, 서리 덥은 끝 |
| Poly-L-Lysine 용액 | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 작업 용액 |
| 시트 유리 스트립 | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash 용액(0.1% Tween20) |
| LKB 7800B 나이프메이커 | LKB | ||
| 캡슐 스플리터 | TAAB 실험실 | C065 | |
| 탄소강 단일 모서리 블레이드 | TAAB 실험실 | B054 | |
| 바이스 | |||
| 암모니아, 25% | VWR | 1133.1000 | 2ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
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| 50 ml 원뿔형 튜브 | Falcon | 14-432-22 | |
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| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
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| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
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| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II 유세포 분석기 | BD | 유세포 분석기 | |
| FlowJo | FlowJo | 분석 소프트웨어 |
참고문헌
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. ....
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