방법 논문

Drosophila 그루밍 행동의 부량

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⸱

DOI:

10.3791/55231

⸱

2017년 7월 19일

 ,  , 
1Department of Biology, Williams College

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 미용 행동을 측정하기위한 견고하고 정량적 인 데이터를 산출하는 Drosophila 의 확장 가능한 개별 그루밍 분석 기술을 설명합니다. 이 방법은 일정 기간 동안 비 - 손질 된 동물의 몸에 염료 축적의 차이를 비교하는 것에 기초합니다.

초록

Drosophila 손질 행동은 앞다리와 뒷다리의 조율 된 움직임을 필요로하는 복잡한 다단계 이동 모터 프로그램입니다. 여기에 우리는 Drosophila 그루밍의 작거나 큰 규모의 연구를 위해 비용 효율적이고 확장 가능한 미용 분석 프로토콜과 새로운 챔버 디자인을 제시합니다. 파리는 브릴리언트 옐로우 (Brilliant Yellow) 염료를 사용하여 몸 전체에 뿌려지며 챔버 내에서 몸에서 염료를 제거 할 시간이 주어집니다. 파리는 염료를 용해시키기 위해 일정량의 에탄올에 침전됩니다. 손질되지 않은 동물에 대한 염료 - 에탄올 샘플의 상대 분광 흡광도가 측정되고 기록됩니다. 이 프로토콜은 개개의 파리에 대한 염료 축적의 정량적 데이터를 산출하며, 이는 샘플을 통해 쉽게 평균화되고 비교 될 수 있습니다. 이를 통해 실험 설계가 돌연변이 동물 연구 또는 회로 조작을위한 손질 능력을 쉽게 평가할 수 있습니다. 이 효율적인 절차는 다양하고 확장 가능합니다. 우리는 w를 보여준다.Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR )에 대한 WT 동물과 돌연변이 동물 사이의 프로토콜 및 비교 데이터의 ork-flow.

서론

Drosophila melanogaster ( D. melanogaster )의 정리는 여러 독립 모터 프로그램의 조정을 포함하는 견고한 타고난 행동입니다 1 . 과일 파리는 먼지, 미생물 및 시력과 같은 정상적인 생리 기능을 억제하거나 심각한 면역 장애를 일으킬 수있는 다른 병원체를 청소합니다. 기계 2 와 면역 활성화 3 을 감지하고 반응 할 때, 파리는 충분히 깨끗하고 몸의 다른 부위로 갈아 엎기 전까지 다리를 함께 또는 대상 신체 부위에 반복적으로 문지릅니다. 파리는 틀에 박힌 패턴 1 , 4 에서 크게 발생하는 뚜렷한 관찰에서 손질 동작을 수행합니다. 그루밍 신호가 우선시 될 때 행동 계층이 분명해진다. 회로 및 활동 패턴이 지원에서 확인되었습니다.계층의 최상 정리 프로그램이어서 5 단정되는 신체 부위에서 병렬 신호를 발생하고 제 억제 FA 모델. 가장 우선 순위가 머리에 주어진 다음 복부, 날개 및 마지막으로 흉부 5 .

D. melanogaster 의 미용 프로그램은 신경 회로, 조절 분자 신호 및 신경 전달 물질을 연구하기위한 이상적인 시스템입니다. 예를 들어 뉴로 파이브 로민 기능 6 의 손상, Drosophila fragile X 정신 지체 단백질 ( dfmr1 ) 7의 손실 및 bisphenol A (BPA) 8 노출은 모두 신경 섬유종증의 개별 인간 증상과 유사한 과도한 손질 및 기타 행동을 일으키고, 연약 X 증후군, 자폐 스펙트럼 장애 및 주의력 결핍 과잉 행동 장애 (ADHD)의 양상을 보였다. 정리 행동은 또한 habitua 수 있습니다테드 차별적 행동 소성의 연구로이 운동 프로그램을 빌려주는 돌연변이 균주 2에서. Drosophila에 의해 모델화 될 수있는 신경 현상의 범위는 파리의 스스로를 손질하는 능력을 측정하기위한 새로운 비교 접근법을 요구합니다.

소포 성 모노 아민 전달체와 도파민 및 기타 생체 아민의 체내에서의 상대적 작용은 과실 파리루 행동을 중재하는 것으로 나타났습니다 9 , 10 . 티라민, 옥토 파민의 전구체는, 또한 적게 7에 정리 트리거 동안 옥토 파민 도파민은 참수 파리에 필적 뒷다리 손질 활성을 자극한다. 4 개의 도파민 수용체가 D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 . 이 프로토콜에서 설명하는 그루밍 분석 방법을 사용함으로써, 우리는 (15) 동작을 정리 유형 I 군 도파민 수용체 DopR (벙어리 DopR, dDA1) 뒷다리에서의 역할을 결정 하였다.

그루밍은 마커 염료 또는 형광 분진으로 동물 전체를 털어 내고 나서 동물이 완전히 손질 할 수있는 청결 정도를 간접적으로 계량하여 측정 할 수 있습니다 5 , 16 . 신체에 남아있는 먼지의 나머지 부분은 전반적인 행동에 대한 상대적 마커로 사용할 수 있습니다. 신랑에게 충분한 시간을 준 후에 더스티 파리는 몸단결 행동에있어서 특정한 적자를 나타낼 수 있습니다. 손질 조사가 더욱 광범위 해짐에 따라, 프로토콜은 목 결합 신경 ( 10) 에 약리학 적 치료를 추가하기위한 목을 베는 것, 손질에 대한 반응을 이끌어 내기 위해 촉각 자극을주는 것 ( 2 )행동의 비디오 녹화 15 . 미용 관찰의 직접 관찰은 시각적 관찰을 사용하고 특정 미용 이벤트의 빈도 및 기간을 수동으로 기록하여 쉽게 연구 할 수 있습니다 4 .

우리는 3D 프린터 또는 레이저 커터로 제작할 수있는 15 개의 그루밍 챔버를 설계했으며, 청사진 디자인은 복제를 위해 사용할 수 있습니다 15 . 이 디자인은 두 개의 합쳐진 중심 판을 사용하여 매쉬로 매칭되고 분리 된 구멍과 2 개의 추가 슬라이딩 상단 및 하단 판을 사용하여 파리 및 / 또는 염료가 각각 적재됩니다. 분진이 날아 오르는 것을 허용 한 후에는 에탄올에 넣어서 염료를 용해시키고 염료의 파장에서이 용액의 흡광도를 측정합니다. 플레이트 판독기는 여러 개의 병렬 샘플에 사용할 수 있으며 단일 판독 분광 광도계는 개별 샘플에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 핸들링으로 인한 오류를 최소화하고더 작고 비용 효율적인 규모로 시험 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 줄리 심슨 (Julie Simpson)과 앤드류 시드 (Andrew Seeds)가 개척 한 방법으로 온도에 민감한 회로 조작을위한 가열 요소가있는 더 큰 그루밍 챔버를 사용하여 파생 및 수정되었습니다 5 . 다음 프로토콜은 전신의 몸단장을 정량화하고 개별 신체 부위에 염료 축적을 정량화하는 대체 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 WT와 DopR 돌연변이 사이의 표본 비교 데이터와 그루밍 행동에 대한 간단한 성과 지표를 계산하는 방법을 제시합니다.

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프로토콜

1. 준비

  1. 배양기 바이 얼에서 손질실로 라이브 Drosophila 를 옮기기위한 흡인기를 준비하십시오. 흡인기는 마취가 후속 행동 관찰에 영향을주지 않도록 의식 동물을 행동 실로 옮길 수 있습니다.
    1. 가위를 사용하여 타이 옹 튜빙 ID 1/8 ", OD ¼"1.5 피트를 자릅니다. 1 mL 일회용 마이크로 피펫 팁 끝에서 최소 1 인치 정도 잘라냅니다. 커팅 팁 위에 1cm 정사각형 메쉬 (0.196 인치 열림)를 잡습니다.
      참고 : 대부분의 1mL 팁에는 팁이 패키지 상자에있는 그라데이션 선이 있으며 일반적으로 그 선으로 잘라냅니다.
    2. 메쉬 / 컷 팁 위에 새로운 1 mL 마이크로 피펫 팁을 넣습니다. 두 가지 팁 사이에 메쉬 모양을주의 깊게 관찰하십시오. 새 팁의 내부는 파리를위한 홀딩 챔버를 만듭니다.
    3. 새 마이크로 피펫 팁의 끝 부분을 잘라내어 싱글 플라이 통과가 가능하도록 구멍을 넓 힙니다. 홀e는 그루밍 챔버 (직경 약 1.5-2 mm)의 개구부와 대략 일치 할 것이다.
    4. 중첩 된 팁을 타이 간 튜빙의 끝 부분에 꼭 맞게 조심하십시오. 팁을 튜브 안으로 밀어 넣고 진공 압력을 허용하도록 단단히 고정시킵니다.
    5. 튜빙의 다른 쪽 끝에서 200μL 마이크로 피펫 팁의 팁을 잘라 내고 좁은 컷 엔드를 튜빙에 끼 웁니다. 이것은 흡인기의 "입"쪽입니다.
  2. 먼지 분취 튜브를 준비하십시오. 약량의 계량 종이에 약 5 mg의 Brilliant Yellow 염료를 잰다. 먼지를 0.6mL 미세 원심 분리 관에 부어 넣고 뚜껑을 꼭 닫으십시오.
    참고 : 일부 라텍스 장갑은 염료를 투과 할 수 있으므로 분취 준비 중에 니트릴 장갑을 사용할 것을 권장합니다.
  3. 실험의 모든 샘플에 대해 1.2 단계를 반복합니다 (각 챔버의 모든 파리마다 하나씩).
  4. 에탄올 (EtOH) 튜브 준비 : 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 100 % EtOH 1 ML을 피펫. 유전자형 또는 조건에 대해 튜브 라벨을 지정하십시오.
  5. 실험의 모든 샘플에 대해 1.4 단계를 반복합니다 (각 챔버에서 매 비행마다 하나씩). Grooming 분석을 완료하기 위해 EtOH 튜브를 캡핑하고 저장하십시오. 또한 적어도 하나의 "Blank"시료를 포함해야하며,이 시료는 음성 대조군에 대해 파리가없는 1 mL EtOH이어야합니다.
  6. 슬라이딩 천판 (작은 구멍 포함)을 조이고 바닥 판 (더 큰 구멍이있는)을 떼어내어 먼지를 추가하여 각 그루밍 챔버를 조립하십시오.
  7. 필요한 각 미용실을 윗면이 아래로 향한 테이블 위에 평평하게 놓습니다. 플라이 입구면이 아래로 향하게합니다.
  8. 원하는 우물 위에 챔버의 표면에 대해 튜브를 두드려 각 챔버에 5mg Brilliant Yellow 염료 분취 량을 적재합니다. 모든 먼지가 메쉬를 통해 상단 플레이트로 떨어지는 것을 확인하기 위해 테이블을 향해 챔버를 두드립니다.
  9. 원추형 구멍의 넓은 끝이 바깥 쪽을 향하게 구멍이 우물 위에 놓이지 않도록 각 챔버에 바닥 판을 조이십시오. 봇 보안뚜껑을 단단히 밀착시켜 염료를 미끄러지거나 방출하지 않도록하십시오.
  10. 챔버를 뒤집어 테이블에 몇 번 평평하게 두드려서 먼지가 메시를 통해 떨어지면서 바닥 판에 놓습니다.
  11. 작은 구멍이 15 개의 우물과 정렬되도록 챔버의 상단 플레이트를 "열린 위치"로 밀어서 개별 우물에 파리를 도입하십시오.

2. 플라이 더 스팅 및 그루밍

  1. 빨대를 사용하는 것처럼 흡인기의 한쪽 끝을 천천히 빨아 흡입구를 흡입기에 넣으십시오. 가볍게 불어 넣고 구멍을 목표물쪽으로 향하게하여 파리를 넣으십시오.
  2. 실험을 위해 사용 된 각 우물에 하나의 파리를 대기음. 웰을 로딩 한 후, 플라이가 챔버에 갇히도록 탑 플레이트를 슬라이드시키고, 다른 웰을 로딩하는 동안 플라이의 탈출을 방지하기 위해 전체 챔버를 로딩하는 동안 그 웰의 개구 상에 테이프를 위치시킨다. 여러개의 파리가 한 번에 흡인된다면e 글쎄, 오직 하나의 파리가 남아있을 때까지 그 구멍을 밝혀 둡니다.
  3. 필요한 모든 우물이 파리로 채워진 후, 바닥 판이 위쪽이되도록 챔버를 뒤집어서 먼지가 메쉬를 통과하여 파리를 덮을 수있는 가능성을 갖도록하십시오.
  4. 나사를 조여 상단 및 하단 플레이트를 단단히 고정하고 챔버를 와동시켜 파리를 4 초 동안 먼지를 제거하십시오.
  5. 염료가 반대쪽으로 떨어지도록 두 번 테이블 (상판)을 두 번 문지르십시오. 그런 다음 챔버를 뒤집어 (상단 판을 위로 향하게) 챔버를 두 번 두드려 염료가 맨 위 챔버에있는 파리에서 바닥 챔버의 바닥에 떨어지도록하십시오.
  6. 손질이 허용되지 않는 컨트롤 파리의 경우 즉시 프로토콜의 3 단계로 진행합니다. 분석을 완료 할 파리의 경우 2.7 단계로 진행합니다.
  7. 플랩을 신을 수 있도록 30 분 동안 상판을 위로 향하게하여 탁자 또는 수조에 챔버를 평평하게 놓습니다. 샹 브를 놓으십시오.소음 및 진동이없는 공간에서 모든 손질 실험 (조명 수준, 습도 및 온도)에 대해 환경을 일정하게 유지하십시오. 상온 또는 25 ° C에서 습도 조절이 가능한 탁상용 배양기가 이상적입니다.

3. 시료 준비 및 흡광도 분석

  1. 상판을 위로하여 챔버 레벨을 유지하면서 염료를 잃지 않도록 조심스럽게 바닥 판을 풀어서 챔버에서 꺼냅니다.
  2. 파리가 마취 될 때까지 기류가 적은 플라이 CO 2 패드 위에 챔버를 놓습니다.
  3. 챔버에서 상단 플레이트를 풉니 다. 조심스럽게 다리를 잡고 각각의 챔버에서 한 방울 파리를 이동하고 EtOH가 포함 된 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 입금 포 셉를 사용합니다. 하나의 플라이를 담고있는 15 개의 챔버에 대한 이송 시간은 약 3-5 분입니다. 실험실은 효율적인 실험 준비를 위해 여러 개의 챔버로 실험을하는 경우 전송 시간을 고려해야합니다.
  4. 일단 각 미세 원심 분리 관에 1 개의 날이 있으면 캡을 닫고 3 번 튜브를 뒤집어 염료와 에탄올의 용액을 혼합하고 혼합하십시오.
  5. 에탄올과 파리가 들어있는 튜브를 RT에서 5 시간 동안 배양하여 파리에서 용액으로 염료가 완전히 제거되도록하십시오. 5 시간 후 각 튜브 (2 초)를 짧게 와동시켜 파리에서 염료가 제거되도록하십시오.
  6. 가능한 경우 플레이트에 각 샘플의 위치를 ​​적어 96 - 웰 접시의 우물에 실험 1.5 ML 튜브 50 μL 나누어지는. 샘플 5x를 희석하기 위해 EtOH 200 μL를 첨가한다. 이 희석은 먼지가 많은 파리 또는 큰 손질에 의한 결함의 천장 효과를 방지합니다.
  7. 플레이트 리더를 사용하여 397 nm에서 각 샘플을 분석하십시오. 또는 플레이트 판독기를 사용할 수없는 경우 가시 광선으로 표준 분광 광도계에서 개별 샘플 및 블랭크의 흡광도를 측정하십시오.
  8. 플레이트 판독기를 통해 샘플을 읽고 기록하고 recorde와 함께 스프레드 시트를 저장하십시오.접시에 샘플 d 개.

4. 결과의 정량화

  1. 모든 샘플에 대한 결과를 컴파일하고 각 유전자형 또는 조건에 대한 분산을 측정합니다.
    참고 : 시간 0 분 및 시간 30 분 염색 축적은 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 및 본 페로 니 보정 (Bonferroni correction)에 의한 통계 분석 또는 다중 병렬 비교에 대한 다른 보정을 사용하는 별개의 조건으로 간주됩니다.
  2. (시간 0 '에서의 염료 축적 평균값 - 시간 30'에서의 염료 축적 평균 값) / 시간 0에서의 염료 축적 평균 값] × 100.을 사용하여 각 유전자형 / 조건에 대한 그루밍 백분율 차이를 계산한다.
  3. 막대 그래프에서 각 유전자형 및 조건의 백분율을 나타내고 유전자형 및 조건을 비교합니다.

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결과

그루밍 분석은 정리를위한 정해진 측정 시간 (30 분) 후에 파리의 몸에 남은 염료의 상대적 잔여량을 바탕으로 행동 수행 능력을 평가하기위한 정량적 데이터를 산출합니다. 슬라이딩 그루밍 챔버 디자인의 샘플 이미지와 분석의 주요 단계가 그림 1에 강조 표시되어 있습니다. 파리는 염료 존재 하에서 vortexing에 의해 즉각적으로 분진으로부터 많은 양의 염료를 응집시킨다 ( 그림 2d, 2e ). Dusted flies는 염료 축적 후 분석 범위를 유지할 수 있습니다 ( 그림 2f, 2g ). 따라서 EtOH에 염료 축적을 가용화하고 개별 시료의 흡광도를 측정하면 재현성과 고도의 정량 평가가 가능합니다.

뒷걸음질 규정의 DopR 에 대한이 ...

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토론

미용 분석은 비교적 간단하지만 다음과 같은 문제에 특별한주의를 기울여야합니다. 플라이와 염료를 넣은 후 위쪽과 아래쪽 판에 나사를 조여 단단히 밀폐 된 상태로 유지하는 것은 재현성있는 결과를 위해 필수적입니다. 브릴리언트 옐로우 염료는 매우 미세하며 느슨한 관절은 챔버의 가장자리에서 염료가 손실되는 것을 허용합니다. 각 우물에 대한 염료 함량의 불규칙성으로 인해 불균일 한 분진이 미용 이벤트에 대한 편차와 위양성 비율을 증가 시키므로 손질 양을 쉽게 벗어날 수 있습니다. 또한 우리는 실험자가 30 분의 미용 기간 동안 미용실을 유지하기로 선택한 환경을 알도록 권장합니다. Drosophila behavior assays의 일관된 성능을 위해서는 온도, 조명, 시간 및 습도에 대한 환경 적 지속성이 필수적입니다. 산만 한 인력을 최소화하기 위해 작은 인큐베이터 내에서 그루밍 챔버를 유지가변 실험실 환경은 결과의 최대한의 재현성에 이상적이지만 다른 공간 배열도 성공할 수 있습니다.

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공개 사항

저자는 아무런 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

우리는 Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon, Rose Hedreen에게이 방법론과 챔버 디자인을 테스트하고 확립하는 초기 작업에 감사드립니다. 우리는 원고를 읽고 편집 한 Kelly Tellez와 Graham Buchan에게 감사드립니다. 브릴리언트 옐로우 염료 (Sigma)의 사용을 제안함에있어 Andrew Seeds와 Julie Simpson에게 선구자적인 노력과 조언 및 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Mary E. Groff 외과 및 의학 연구 및 교육 자선 신탁, Bronfman 과학 센터 및 Hellman 휄로우 프로그램에 의해 부분적으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
High-Flex Tygon PVC Clear TubingMcMaster-Carr5229K54ID 1/8", OD 1/4", 마이크로 피펫 팁 및 메쉬와 함께 사용하여 입 흡입기 구성
마이크로 피펫 팁 (1 mL 및 200 μ L)Genesee Scientific24-165, 24-150R
나일론 메쉬 스크린, 2 x 2.6"McMaster-Carr9318T44그루밍 챔버 및 구강 흡입기를 구성하는 데 사용
Dumont #5 집게Roboz 수술 기구RS-5050
Brilliant Yellow DyeSigma-Aldrich201375-25G이 제품을
취급하는 동안 니트릴 장갑 사용을 권장합니다.VortexerFisher Scientific12-812"터치"로 설정
탄올Carolina Biological Supply86-1282
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브VWR International10025-726
0.65 mL 마이크로 원심분리기 튜브VWR International20170-293튜브는 연속 분석과 함께 재사용 가능
UV 96-well 플레이트Corning
BioTek Synergy HTX PlatereaderBioTek제품 번호에 액세스하려면 카탈로그를 다운로드해야
http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview Gen5 Microplate Reader 및 Imager SoftwareBioTek
Microsoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
초파리 인큐베이터TritechDT2-CIRC-TK
1/4" 아크릴 플라스틱McMaster-Carr8473K341
8 - 32 너트McMaster-Carr90257A009
8 - 32 x 1" 육각 캡 나사McMaster-Carr92185A199이 크기의 나사에 대해 바닥 플레이트를 탭해야
8 - 32 x 1/2" 육각 캡 나사McMaster-Carr92185A194상단에서 두 번째 플레이트는 2
- 56 3/8" 플랫 헤드 필립스 기계 나사McMaster-Carr91500A088두 개의 중간 플레이트를 함께 고정
0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" 알루미늄 파이프McMaster-Carr92510A044사내에서 제조됩니다. 나열된 제품은 대략 동일한 치수이며 사이즈 8 나사에 대해 작동해야 합니다.  이것들은 1" 나사의 덮개 역할을 하며 육각 캡을 상판 표면에서 약간 위로 설정합니다
에26014017 합니다 합니다. 합니다.

참고문헌

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  14. Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
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  16. Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
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