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방법 논문

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

15K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55236

⸱

2017년 1월 26일

 ,  , 
1Department of Microbiology, The University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

초록

활성 단백질 - 단백질, 단백질 - 핵산 복합체의 정제 효소 활성 및 신규 서브 유닛 및 번역 후 변형의 드 노보 식별의 특성에 매우 중요하다. 박테리아 시스템들은 단일 폴리펩티드 및 단백질 복합체의 다양한 발현 및 정제를 허용한다. 그러나,이 시스템은 번역 후 변형 (예를 들어, 아세틸 화 및 포스 포 릴화)을 포함 소단위 단백질의 정제 및 진핵 시스템에서의 발현 만 존재하는 신규 규제 소단위 /의 식별을 가능하게하지 않는다. 여기서 우리는 진핵 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 표현 에피토프 - 태그 단백질과 단백질 복합체의 정제를 용이하게하는 소설, 강력한, 그리고 STREP-를 사용하여 효율적인 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방식과 FLAG-태그 단백질에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 PROT의 특성을 적용 할 수있다EIN 복잡한 기능 복잡한 서브 유닛의 번역 후 변형을 발견, 및 질량 분광법에 의해 신규 규제 복잡한 구성 요소를 식별하기. 특히,이 방법은 TAP 따라서 하류 실험 기회 광범위한 항복 진핵 또는 병원성 (바이러스 성 및 세균성) 구성 요소에 의해 형성되는 단백질 복합체를 연구에 적용될 수있다. 우리는 단백질 복합체와 협력 연구자들이 다양한 방법으로이 방법을 활용할 수 있다고 제안한다.

서론

단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 그 기능이에 대해 알릴 수 생물학적 과정 (1),이 프로톤 펌프 억제제에 대한 추가 연구의 정확한 조절을 위해 중요하다. 몇몇 접근법은 프로톤 펌프 억제제의 연구 및 특성뿐만 아니라 신규 조절 단백질 성분의 드 노보 식별을 위해 고안되었다. 1989 년 스탠리 필드와 동료들은 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석 (3) 보도했다. 이 방법은 사카로 마이 세스 세레 비지에 인터랙 관심 (미끼)의 정의 단백질 (할까요)의 공평하고 포괄적 인 식별 할 수 있습니다. 프로톤 펌프 억제제를 발견하기위한 현저한 유틸리티 또한 Y2H 분석은, 효모 세포에서 단백질을 특성화 쌍 최소 상호 작용 도메인을 정의하고, 이러한 상호 작용을 폐지 변이를 식별하는데 사용될 수있다. Y2H 분석을 수정하여, 프로톤 펌프 억제제는 포유 동물 세포에서 공부하실 수 있습니다클래스 = "외부 참조"> 4. Y2H 분석 (예, 효모 세 하이브리드 시스템)의 변형, 단백질 및 RNA 세포 단백질 작은 유기 리간드 상호 작용을 연구에 적용 할 수있다.

상동 시스템에서 프로톤 펌프 억제제를 연구하는 또 다른 일반적으로 사용되는 도구는 공동 면역 (공동 IP) 분석 5입니다. 관심의 단백질을 면역 침전에 대한 항체를 사용하여, 공동 IP 분석 연구자들은 다양한 환경 조건 및 실험 상황에서 셀의 프로톤 펌프 억제제를 모니터링 할 수있다. 에피토프 - 태그 단백질 (예를 들면, FLAG는, Myc와, STREP 및 HA는, 다른 사람의 사이에서) 친 화성 정화 (AP) 방법이 서양 얼룩 등 여러 다운 스트림 분석 복잡한 단백질 혼합물에서 단백질의 분리를 촉진했다,은 얼룩의 사용 및 효소 분석. 그러나 이러한 이전 방법 중 어느 것도 체외을 포함하여 더 특성화 단백질 복합체의 대량의 분리를 사용하지ssays, 질량 분석 및 번역 후 변형의 식별에 의한 규제 서브 유닛의 발견. AP 통신 방식의 향상된 버전은 두 개의 연속적인 AP들 (6, 7)를 통해 정제하여 두 에피토프와 융합 단백질을 생성하여 프로톤 펌프 억제제의 연구를위한 정제 기술이다 텐덤 AP (TAP)를 호출한다. 이 문서에서 우리는 두 개의 서브 유닛이 다른 에피토프 태그 다음 두 순차 액세스 포인트 (AP STREP FLAG IP 다음)를 통해 정제하는 정제 단백질 복합체의 TAP 방법의 변화를 제시한다. 연구자들이 관심을 자신의 단백질 복합체에 적용 할 수 있도록 우리가 먼저, TAP의 최소한의 개요 (그림 1)과 모든 실험 단계에 대한 자세한 설명 (그림 2)을 제공한다.

탭 방식의 적용 성을 입증하기 위해, 우리는 (복소 잘 특징 사이클린 CDK는 PT라고 선택한규제 소단위 사이클린 T1 (CycT1) 및 키나제 (경우, Cdk9)로 구성되며, RNA 중합 효소 II (POL II) 8, 9, 10에 의해 전사 조절에 관여 EFB 키나아제). P-TEFb는 폴 II 상기 프로모터에서 전사를 일시 완화 연관된 부정적인 신장 요소의 C 말단 도메인을 인산화시켜 전사 신도 11, 12, 13을 용이하게한다. 이를 염두에 알려진 상호 작용, CycT1을 STREP - 태그 및 FLAG-태그 경우, Cdk9는 HEK293T 세포에서 발현 이상이었다. 상호 TAP 실험은 더 단백질 상호 작용이 사용 된 에피토프에 독립적 인 것을 확인하는 STREP-태그 경우, Cdk9과 FLAG-태그 CycT1로 하였다. 세포를 수거하고, 48 시간 후 형질 감염을 용해시켰다. 가용성 해물이 TAP 그래피 (STREP AP는 FLAG 다음IP). 입력 및 정제 된 단백질은 서양 얼룩과 실버 얼룩 (그림 3)에 의해 분석 하였다.

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프로토콜

1. 도금 세포

  1. 전날 형질에 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 10 mL에 3.5 × 106 HEK293T 세포 플레이트 100mm 접시 당 (10,000 U / ㎖의 주). 플레이트 (3) - 실험 / 상태 당 5 100mm 요리는 충분한 단백질 복구를 보장합니다.
    주 : 판의 개수는 관심있는 단백질 복합체의 발현 수준과 용해도에 의존하는 각 실험 / 조건에 대해 결정되어야한다. 대규모의 정제가 필요한 경우에는 세포주 스피너 플라스크이 현탁액에서 성장하도록 적응 될 수 있지만,이 방법은 일시적 형질 감염을 위해 작동하지 않을 것이다.

2. 안정 세포주를 세포 형질 감염 또는 유도

  1. 다음 날, 현미경으로 세포를 확인합니다. proce을하기 전에 80 % 합류 - 세포는 70해야합니다대한 수정 사항.
  2. 100mm의 접시 당 형질 감염 시약 7 플라스미드 DNA의 μg의 21 μl의 총 혼합물로 세포를 형질 감염. 형질 감염 효율에 대한 제어는 벡터 표현 GFP (표 1)과 함께 형질 감염 세포.
    주 : 독시사이클린 14, 15에 대응하여 두 개 이상의 복잡한 소단위의 발현을 유도 HEK293-T-REX 또는 유사한 안정한 세포주를 사용하는 경우, 유도제는 세포에 첨가하고 48 시간 동안 배양되어야 할 것이다. 마찬가지로, 유도제의 첨가에 따라 GFP의 발현을 유도하는 안정한 세포 라인은 또한 검증을 위해 요구된다. 2.7 단계로 진행합니다.
  3. 100mm 접시 당 형질 전환 혼합물을 준비합니다. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (둘 이상의 플라스미드에 상당)의 총 플라스미드 DNA 7 μg의로 비추 DMEM 500 μL를 혼합한다. 별도의 microcentrifuge 관에서 비추 DMEM 위스콘신의 500 μl를 혼합트랜 시약의 제 21 μL. 각 형질 전환 반응에 대해 반복합니다.
  4. 플라스미드 DNA 용액으로 형질 감염 시약 용액을 피펫 (역순으로 용액을 혼합하지 않음). 적어도 4 회 피펫 팅하여 혼합한다.
  5. 10 시간 동안 실온에서 혼합물을 부화하지 - 15 분, 그러나 더 이상 15 분 이상.
  6. 미디어 저장소를 생성하고 조심스럽게 세포를 방해하지 않고 판의 내부면에 드롭 현명 형질 전환 혼합물을 피펫 할 수있는 판을 기울입니다. 원래 평평한 위치에 접시를 반환하고, 혼합물을 배포하는 부드럽게 소용돌이 친다.
  7. (이 조건은 이하 "조직 배양 인큐베이터"라 함), 5 % CO 2 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 미디어 5 시간 후 형질 전환 (옵션) 장착합니다.

3. 검사의 형질 또는 유도 효율

  1. 24 시간 후 형질에서, 독감에서 세포를 시각화orescent 현미경은 형질 전환 효율 (또는 GFP를 발현 제어 HEK293T 렉스 안정적인 세포주의 유도)를 확인합니다. 또 다른 24 시간 동안 품어.

4. STREP 선호도 정화 (STREP AP)

  1. 세포를 수집
    1. 48 시간 포스트 형질에서 미디어를 제거하고 차가운 1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 8 ml를 추가합니다. 접시에서 세포를 분리 아래로 피펫합니다.
    2. 수집하고, 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 4 ℃에서 4 분 동안 800 XG에서 세포를 스핀 다운.
    3. PBS를 상층 액을 제거합니다. 잔여 PBS를 제거하기 (4 ℃에서 1 분 동안 800 XG)를 스핀을 반복합니다. 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 세포 펠렛을 저장 또는 단백질 정제를 계속하려면 다음 절차를 따르십시오.
  2. 세포를 용균
    1. 패시브 용해 완충액을 세포 펠렛 부피 × 5를 사용하여 세포 펠릿 (~ 플레이트 당 250 μL)에 재현 탁(PLB : 20 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 DTT, 프로테아제 억제제 칵테일 정제, 5 % V / V 글리세롤, 1.0 % NP-40) 및에 세포 현탁액을 전송 1.5 ml의 microcentrifuge 관.
    2. 간단히 4 ° C에서 30 분 동안 정지 및 nutate을 소용돌이.
    3. 4 ° C에서 10 분 동안 10,000 XG에서 세포 현탁액을 스핀.
    4. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 용해 용 해물을 전송하고 세포 펠렛을 폐기합니다. 같은 수용성 해물의 최종 부피의 10 % 할인 "연쇄상 구균 AP 입력." 4 ℃에서 보관하십시오.
  3. 연쇄상 구균 구슬을 평형화
    참고 : 첫 번째 AP 단계에 대한 사용 STREP 구슬! 연쇄상 구균 구슬 FLAG 구슬 아래로 끌어 것보다 훨씬 더 많은 단백질을 복구와 단지 아래로 당겼다.
    1. 꺼내 (n은 40 μl를 ×) + n은 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 μL (N = 샘플 수), 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
      참고 : 넓은 m를 사용하여피펫 구슬에 outhed 팁.
    2. 상층 액을 제거하고 구슬에 PLB의 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 구슬 혼합물을 Nutate. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
      1. 3 세척 총 반복합니다. 40 μL × N의 최종 부피로 PLB의 비드를 재현 탁.
    3. 4 ° C에서 2 시간 동안 각각의 세포 용 해물 샘플 및 nutate 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 40 μl를 추가합니다.
  4. STREP AP
    1. 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 솔루션을 스핀 다운.
    2. 4 ° C에서 "STREP AP 플로우를 통해 (FT)"로 뜨는 및 저장소를 제거합니다.
    3. I (20 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 250 mM의 염화나트륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 DTT, 5 % 글리세롤 및 0.2 % NP-40) STREP AP 세척 버퍼 구슬에 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 5 4 ° C에서 분 원심 분리기의 구슬 혼합물을 Nutate. 상층 액을 버린다.
      1. 네 세척의 총 반복합니다.
        주 : 네번째 세척 전에 단백질 배경을 감소시키는 새로운 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 비드 용액 옮긴다. 이 단계는 필수적이다.
    4. 500 μL 세척 버퍼 II (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA)를 추가하고 튜브를 반전 구슬을 평형. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 버린다.
    5. STREP 용출 버퍼 (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 2.5 mM의 Desthiobiotin)의 50 μL과 관심의 단백질을 용출. 4 ℃에서 15 분 동안 800 rpm에서 소용돌이.
    6. 4 ° C에서 1 분 동안 1,500 XG에서 구슬을 스핀 다운. 상층 액을 수집합니다. 이 부분은 "STREP AP 용출"샘플에 해당합니다.
    7. 제 1 용출 얻어진 단백질의 양의 절반까지 얻을 수있는 초 용출, 4 ° C에서의 비드 부분을 저장한다. 실버 염색 및 / 또는 웨스턴 블로 팅에 대한 STREP AP 용출의 나누어지는 10 %16.
  5. 국기 구슬을 평형화
    1. (NX 16 μL) + n은 FLAG 비즈 솔루션의 μL (샘플 N = 번호)를 꺼내 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
      참고 : 피펫 구슬에 입이 큰 팁을 사용합니다.
    2. 상층 액을 제거하고 FLAG 세척 버퍼 500 μL를 추가 (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.1 % NP-40) 구슬에. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. 3 세척 총 반복합니다.
    3. NX 16 μL의 최종 부피 FLAG 세척 완충액으로 비드를 재현 탁.
    4. 4 ° C에서 나머지 STREP AP 용출 및 nutate 하룻밤에 FLAG 비드 슬러리의 16 μl를 추가합니다.

5. FLAG IP

  1. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 플래그 구슬 서스펜션을 스핀. 4 ° C에서 "FLAG IP 플로우를 통해"(FT)으로 뜨는 및 저장소를 저장합니다.
  2. 500 추가(81); 솔루션에 FLAG 세척 버퍼의 리터. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 5 4 ° C에서 분 원심 분리기에 대한 Nutate. 네 세척의 총 반복하고 각 세척 한 후 상층 액을 제거합니다.
    주 : 네번째 세척 전에 배경을 감소시키는 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 단백질로 비드 용액 옮긴다. 이 단계는 필수적이다.
  3. 마지막 스핀에서 뜨는을 제거하고 구슬로 FLAG 펩타이드의 200 NG / μl를 포함 FLAG 세척 버퍼의 30 μL를 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 800 rpm에서 소용돌이.
  4. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 정지를 스핀 다운. 으로 4 ° C에서 뜨는 및 저장소를 수확 "FLAG IP 용출."
    참고 : 용출 샘플 표준 프로토콜 16을 사용하여 실버 얼룩 및 / 또는 웨스턴 블롯으로 확인하고, 또한 단백질 분석을위한 준비가 될 수있다. (1) STREP AP 입력, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Eluti : 웨스턴 블롯을 설정할 때, 다음의 모든 샘플을 실행(4) FLAG IP FT, (5) FLAG IP 용출에. 로드 볼륨은 각 실험에 대해 결정되어야 할 것이다. 수집 된 모든 샘플과 비드 단기 기억과 장기 보존 -80 ° C에서 39 ° C에서 저장 될 수있다. TAP 샘플들은, 그 구성 요소의 신원을 확인하는 신규 번역 후 변형 (PTMS)를 식별 및 / 또는 정제 착체 2 (17)와 임의의 신규 단백질 상호 작용을 발견 질량 분석법에 의해 분석 될 수있다. 이러한 목적하는 쿠마 겔 또는은 염색을 실행 한 후, 밴드 깨끗한 메스를 사용하여 겔로부터 절제 될 수있다. 질량 분석 방법을 논의 몇 가지 우수한 리뷰 이전에, 19 (18)을 발표했다.

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결과

이 글에서, 우리는 (또한 P-TEFb 키나제라고도 함) 복잡한 잘 특징 CycT1-경우, Cdk9에 TAP 방법의 적용 가능성을 보여줍니다.

그리고 경우, Cdk9-FLAG (경우, Cdk9 : F), 또는 경우, Cdk9-STREP (경우, Cdk9 : S) 및 시클 T1-FLAG (CycT1 : F) : 시클 T1-STREP (S CycT1) 인코딩하는 플라스미드 (표 1), HEK293T 세포로 형질 감염시켰다 . F 또는 CycT1 : (각각도 3a 및 B) F 플라스미드 음성 대조군은 빈 벡터와 경우, Cdk9와 형질을 포함했다. 세포를 수거하기 전에 단백질은 48 시간 동안 발현되었다. 세포의 여러 접시는 단백질 생산 및 복구를 증가 (샘플에 5 판

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토론

발현 및 진핵 세포에서 단백질 복합체의 분리를 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 분자 어셈블리의 생화학 적 특성에 한정되지 않고, 그 기능을 조절할 수있는 신규 인터랙 번역 후 변형의 식별에 이용 될 수있다. 친 화성 태그의 활용은이 프로토콜에서 언급 한 내용에 제한되지 않는다; 그러나 우리의 경험은 제 AP 단계로 STREP을 사용하여 상당히 최종 단백질 - 단백질 복합체의 수율을 향상하는 것이 제안한다. 모두와 연쇄상 구균 구슬에서 바인딩 및 용출 단계 (예를 들면, FLAG) 다른 에피토프 태그에 비해 매우 효율적입니다. 또한, 이론적으로, TAP는 버퍼 조건 (모두 과도 안정적인 발현 시스템) 실험 당 접시 수 등뿐만 아니라 약간의 최적화와 다른 단백질 또는 도메인에 적용될 수는 TAP 방법도있을 수있다 응용 t다른 세포주 O를 특정 단백질 복합체는 그 기능 또는 고유 요인과의 상호 작용을위한 특별한 시스템이 필요합니다. 문제 해결을 용이하게하기 위해, 매우 입력 및 FT 샘플 모두

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 간행물에 보고된 연구는 NIH의 NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)의 지원을 받았으며 수상 번호 R01AI114362와 Welch Foundation이 Iván D'Orso에게 I-1782를 수여했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GE Healthcare Life Sciences/HycloneSH3002.2FS
소 태아 혈청GE Healthcare Life Sciences/HycloneSH30071
Penicillin/StreptomycinMP BiomedicalsMP091670049
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688
프로테아제 억제제 칵테일 로슈 
STREP-Tactin SuperflowIBA Lifesciences2-1208-010
STREP-tag 용출 버퍼IBA Lifesciences2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichF2426
Corning 100 mm × 20 mm 스타일 디쉬 세포 배양 처리된 비피로생성 폴리스티렌 20/슬리브Corning 
Protein Lo-Bind EppendorfEppendorf022431081
Digital Vortex MixerFisher Scientific 02-215-370
48홀 마이크로 튜브 폼 랙Fisher Scientific02-215-386
Labquake 쉐이커 로티세리 써모 제415110
11836153001430167호

참고문헌

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