병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

요약

여기, 우리는 돌고래 정 충, cryopreservation, 수집과 소 oocytes를 사용 하 여 분리 IVF 성능을 위해 성공적으로 사용 된 프로토콜을 제시.

초록

Cryopreserved 돌핀 정 충의 사용 수 중 공원 사이 유전 물질의 교환을 용이 하 게 하 고 정 충은 해양 포유 동물 복제에 대 한 우리의 이해를 심화 하기 위해 연구 실험실에 액세스할 수 있습니다. 분리 IVF, 동종 IVF에 대 한 대체 잠재적인; 정자 비 옥을 테스트 하는 수단을 제공할 수 있습니다. 연구 생식 체 생리학 및 초기 배아 발달; 그리고 얻기 어려운 귀중 한 돌고래 oocytes의 사용을 피하기 위해. 여기, 우리는 성공적으로 수집 하 고 돌고래 정 충 cryopreserve 사용 된 프로토콜을 제시. 정액의 컬렉션은 훈련 된 돌고래에 수동 자극에 의해 수행 됩니다. Cryopreservation은 글리세롤과 트리 스 달걀 노른자위 기반 extender를 사용 하 여 수행 됩니다. 또한, 우리는 분리 IVF 돌고래 정 충와 소 oocytes를 사용 하 여 설명 하 고는 PCR를 사용 하 여 결과 배아의 하이브리드 성격을 확인 하는 프로토콜을 제시. 분리 수정 수정에 대 한 질문을 제기 하 고 생식 체 생리학과 초기 배아 발달을 공부 하는 도구로 사용 될 수 있습니다. 또한, 분리 IVF의 성공 테스트 돌고래 정자 비 옥 하 게 용량을 추가 검사의 가치가이 기술의 잠재력을 보여 줍니다.

서론

보조 생식 기술 해양 포유류를 포함 하 여 야생 동물에 가난 하 게 개발 된다. 정자 기름 성공 평가에 중요 한 방법의 부족 느린 돌고래 종에서 생식 기술 개발에 기여 한다. 그것은 아니었다 최근까지 bottlenose 돌고래 (Tursiops truncatus)의 기본 정액 매개 변수 보고^1,2했다. 그러나, 운동 성 및 형태학, 같은 변수 널리 사용 되 고 있지만 생식 효율성에 제한 된 정보 제공. 정자 품질 최고의 지표는 기름 잠재력의 평가.

최근, 우리의 그룹 돌고래 정자 남성 pronuclear 형성 및 zona 그대로 소 oocytes³를 사용 하 여 분리 IVF 후 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 잠재적인 비 옥 평가 메서드를 사용 합니다. 돌고래 소 분리 IVF 사용 하 여 중요 한 이점이 동종 IVF, 돌고래 oocytes를 얻기의 어려움 극복으로 있으며 소 oocyte 성숙 시스템 잘 테스트 체 외에서 사용을 용이 하 게. 종 특이성을 피하려면 분리 수정 ZP의 부재에서 일반적으로 수행 됩니다. Vitelline 막으로 융합 acrosome 반응....

프로토콜

윤리 성명: 실험 절차를 모두 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 Instituto Nacional de Investigación y 기술과 Agraria y 섬유 (INIA)의 위원회에 의해 승인 했다. 복제의 연구, 그리고 해양 포유 동물의 배려를 위한 동물 복지 행위는 사회에 의해 채택 모든 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 되었습니다.

1. 돌고래 정자 수집과 Cryopreservation

1. 준비
   1. 게 페르 매체 (헤 파 린 및 hypotaurine-무료). 페르 TALP 매체와 25mm 중 탄산염, 22 m m 나트륨 젖 산 염, 1 mM 나트륨 pyruvate, 6-mg/mL 지방산 무료 BSA, 10 mg/mL 헤 파 린 (pH 7.4) 보완 준비.
      참고: 사용 당일이 매체를 준비 하 고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에 5% CO ₂ 분위기 아래 38.5 ° C에서 보관.
   2. 준비 TRIS 계란 노 른 자 기반 버퍼입니다. 30.28 g/L 트리 스, 16.75 g/L 구 연산과 당 12.5 g/L, 그리고 초순에 0.5 g/L 스 분해 (pH 7.3, osmola....

결과

모든 결과, 표 및 그림 (1 및 2) 여기에 제시 된 권한³으로 재현 했다.

돌핀 정 충 중지 및 재개 후 높은 운동 성을

냉동-해 동 돌고래 ejaculates 84.5 ± 5.3 총 운동 및 69.1 ± 5.1 진보적인 운동 정 충의 백분율 (% ± SD) 보여주었다. 운동 성 측면에서이 숫자는 높은-품질 cryopreserved 정 충의 대표.

돌핀 정 충 관통 zona 그대로 소 oocytes 그리고 생산 하이브리드 배아의 할 수 있다

토론

많은 다른 포유류 종에 대 한 동결-해 동 정자를 사용 하 여 다양 한 장점이 있다. 이 귀중 한 유전 물질, 전세계 유통에 대 한 가능성, 오염, 낮은 위험 그리고 수십 년 동안 남성 gametes를 보존 하는 기능을 전송 하는 기능을 포함 합니다. Cryopreserved의 사용이이 종 부록 II의 인용, 전송 및 다른 수 중 공원 사이 동물의 교류를 제한 하는 보호 때문에 bottlenose 돌고래에 대 한 필수적입니다. 돌고래 수송 물류 문제 및 위험 위험을 생성 하는 활동 이다. 그러나, 그들을 수송에서 자제 족 동물의 포로 인구를 도입의 위험 같은 결과 또한 있다. 하나의 솔루션은 정자의 cryopreservation입니다. 일부 저자 매우 돌고래 정자^5,7,,89와 cryopreserved.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FERT-TALP 매체	Merck
TCM-199	Sigma	M-4530
Hoechst 33342	Sigma	B-2261
4-well dish	Nunc	176740
밀도 구배 BoviPure	Nidacon International	BP-100
세척 용액 Boviwash	Nidacon International	BW-100
염화마그네슘	Promega	A35.1H
멸균수	Mili Q sintesis A10 Millipore	A35 1H
버퍼 트리스 붕산염 EDTA	시그마	T4415
MB 아가로 스	Biotools	20.012
5X GoTaq 플렉시 버퍼	Mili Q sintesis A10 Millipore	M 890 A
MB 아가로 스	Biotools	20.012
Taq 중합효소	Promega
SafeView	NBS Biologicals Ltd.	M 890 A
Makler 계수 챔버	Sefi Medical
Thoma 챔버	Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000	Crison Instruments
삼투압 온도계 고급 마이크로 삼투압 계 3300	Norwood
컴퓨터 보조 정자 분석 시스템	Projectes y Serveis R + D
실체현미경 MZ 95	Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300	Nikon
Confocal assistant 4.02 software	Bio-Rad	3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy	Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)	Gilson
마이크로 원심분리기 튜브	VWR
UV 조명기	Bio-Rad
PCR 열 순환기 Primus 96 Plus	MWG AG Biotech