방법 논문

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

DOI:

10.3791/55255

⸱

2017년 5월 24일

 ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 생체 내에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑을 가능하게하는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S - selected Hysbrids (SL)의 S equencing 방법을 자세히 설명합니다. SPLASH는 효모, 박테리아 및 인간을 포함한 유기체의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 적용 할 수 있습니다.

초록

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RNA가 어떻게 상호 작용 하는지를 아는 것은 세포에서 RNA 기반의 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. microRNA-mRNA 상호 작용과 같은 RNA-RNA 상호 작용의 예가 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타 났지만 RNA 상호 작용이 세포에서 일어나는 전체 범위는 아직 알려지지 않았습니다. RNA 상호 작용을 연구하기위한 이전의 방법은 주로 특정 단백질 또는 RNA 종과 상호 작용하는 RNA의 부분 집합에 초점을 맞추었다. 여기에서는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S elected H ybrids (SPLASH)라는 이름의 방법을 상세히 설명합니다.이 방법을 사용하면 생체 내 에서 RNA 상호 작용 을 편파적으로 캡처 할 수 있습니다. SPLASH는 생체 내 교차 결합, 근접 결합 및 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분자 내 및 분자간 RNA 염기쌍 파트너를 세계적으로 확인합니다. SPLASH는 박테리아, 효모 및 인간 세포를 포함한 다른 유기체에 적용 할 수 있습니다.다양한 세포 환경에서 RNA 조직의 역 동성을 이해하는 데 도움이되는 다양한 세포 조건을 제공합니다. 전체 실험 SPLASH 프로토콜은 완료하는 데 약 5 일이 걸리고 계산 워크 플로는 완료하는 데 약 7 일이 걸립니다.

서론

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거대 분자들이 서로 어떻게 접히고 상호 작용하는지 연구하는 것은 세포에서의 유전자 조절을 이해하는 열쇠입니다. 지난 수십 년간 DNA와 단백질이 유전자 조절에 어떻게 기여하는지에 대한 많은 노력이 집중되어 왔지만, 유전자 발현의 전사 후 조절에 관해서는 알려진 바가 상대적으로 적다. RNA는 선형 서열과 2 차 및 3 차 구조 모두에서 정보를 전달한다. 생체 내에서 자신과 다른 사람과 쌍을 이루는 능력이 중요합니다. 고 처리량 RNA 2 차 구조 탐색에서의 최근의 진보는 트랜스 크립 풋 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howe에서 이중 및 단일 가닥 영역의 위치에 대한 가치있는 통찰을 제공했다페어링 상호 작용 파트너에 대한 ver 정보가 아직 많이 누락되었습니다. transcriptome에서 어떤 RNA....

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프로토콜

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1. Biotinylated Psoralen과 RNA 추출을 이용한 HeLa 세포의 치료

  1. 10cm 플레이트에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 (PS)을 보충 한 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 배양 한 HeLa 세포.
  2. HeLa 세포를 1x PBS 5 mL로 두 번 씻으십시오. 1 분 동안 접시를 수직으로 배치하여 접시에서 과잉 PBS를 완전히 배출하십시오.
  3. Biotinylated psoralen과 0.01 % w / v digitonin을 200 μM 함유 한 PBS 1 mL를 세포에 균일하게 가하고 37 ° C에서 5 분간 품다. biotinylated 소 랄렌은 세포에 들어갈 수 있지만, 세포가 5 분 동안 낮은 수치의 digitonin (0.01 %)에 노출 될 때 그 투과성은 훨씬 더 높습니다
  4. 처리 HeLa 세포가 들어있는 10cm 플레이트의 뚜껑을 제거하고 얼음 접시를 놓습니다. 자외선 crosslinker를 사용하여 자외선 전구에서 3cm의 거리에 얼음에 20 분 동안 365nm의 자외선과 세포를 포함하는 요리를 조사.
  5. 격리제조 업체의 프로토콜에 따라 guanidinium thiocyanate - 페놀 - 클로로포름 추출하여 HeLa 세포에서 ....

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결과

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그림 1 은 SPLASH 워크 플로우의 개략도입니다. 0.01 % digitonin 존재 하에서 biotinylated psoralen을 첨가하고 UV 가교 결합시 total RNA를 세포에서 추출하고 dot blot을 수행하여 RNA에 대한 biotinylated crosslinking이 효율적으로 일어 났는지 확인합니다 ( 그림 2 ). 우리는 biotinylated 20 base oligos를 양성 대조군으로 사용하여 biotinylated psoralen의 양을 세포에 첨가하여 150 개의 염기가 약 1 개가 가교되도록합니다.

더 많은 PCR 복제 이벤트가 증가 된 PCR 증폭 사이클에서 발생하는 경향이 있으므로, 우리는 깊은 시퀀싱을위한 충분한 .......

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토론

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여기서 우리는 게놈 전체에서 pair-wise RNA 상호 작용을 확인하는 방법 인 SPLASH의 실험 및 계산 워크 플로우에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 박테리아, 효모 및 인간 문화에서 SPLASH를 성공적으로 활용했으며 전략이 다양한 세포 상태에서 다양한 유기체에 광범위하게 적용될 수있을 것으로 기대합니다. 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 하류 공정에 적합한 물질을 가지기 위해 적어도 20 μg의 가교 결합 된 RNA로 시작하는 것입니다. 그런 다음 RNA를 100 염기로 단편화하고 PAGE 크기로 선택합니다. 이러한 단계는 라이브러리 생성 과정에서 단량체가 아닌 결찰 된 키메라를 우선적으로 풍부하게하는 데 중요합니다. 우리는 일반적으로 조각과 첫 번째 크기 선택 후 RNA 약 1.5 μg을 복구하고 RNA는 SPLASH 워크 플로우에 따라 cDNA 라이브러리로 변환됩니다. 우리는 시작 RNA 의이 금액은 우리가 h에 대한 충분한 자료를 생성 할 수 있습니다PCR 증폭의 15주기 미만을 사용하여 처리량 시퀀싱. 증가.......

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wan 연구원과 Nagarajan 연구원에게 유익한 토론에 감사드립니다. N.Nagarajan은 A * STAR의 자금 지원을받습니다. Y.Wan은 A * STAR 및 Society in Science-Branco Weiss Fellowship의 지원을받습니다.

....

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재료

전에 항상 Superase-in을 신선하게 첨가 <td colspan = "4">3 'RNA 어댑터 서열 :
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 kb 플러스 DNA 사다리Life Technologies Holdings Pte Ltd10787026DNA 사다리
10 bp DNA 사다리Life Technologies Holdings Pte Ltd10821-015DNA 사다리
20% SDS 솔루션First BASEBUF-2052-1L   
20x SSC첫 번째 베이스BUF-3050-20X1L
3.0 M 나트륨 아세테이트 용액첫 번째 베이스BUF-1151-1L-pH5.2   핵산 침전에 필요
40% 아크릴아미드/비스 솔루션, 19:1Bio-Rad1610145TBE 요소 젤 구성
요소 Ambion Buffer KitLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
암모늄 퍼설페이트, 분자 등급   프로메가V3131 TBE 우레아 젤 성분
브로모페놀 블루시그마-알드리치B0126-25G
클로로포름Merck1.02445.1000RNA 추출
단일 가닥 DNA 리가제진앙CL9025KCircLigase II ssDNA 리가제
원심관 필터시그마-알드리치CLS8160-96EACostar Spin-X 원심분리기 튜브 필터
D5628-1G 디지토닌 결정질Sigma-AldrichD5628-1G세포 치료용
다크 리더 트랜스일루미네이터 Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X TransilluminatorBlue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611아가로스 젤 electroporation에 필요
Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500Hela 세포 배양
Streptavidin 마그네틱 비드Life Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne 스트렙타비딘 C1 
15 를 위한 자석 스탠드; mL 튜브Life Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
자석 스탠드 15  mL 튜브Life Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer  C
Biotinylated psoralenLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL 히타치F8T5/BL 365nm UV 전구
태아 소 혈청Life Technologies Holdings Pte Ltd10270106   Hela 매체의 구성 요소
포름아미드프로메가H5052   혼성화 버퍼의 구성 요소
G8T5Sankyo-DenkiG8T5254 nm UV 전구
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010핵산 침전에 필요
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000핵산 정량화를 위한 분광광도계
Nuclease 무료 물 첫 번째 베이스BUF-1180-500ml   
페니실린 스트렙토마이신   라이프 테크놀로지스 홀딩스 Pte Ltd15140122   Hela 매체의 구성 요소
고화질 DNA 중합효소 (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Phusion High-Fidelity PCR HF Buffer를 사용한 마스터 믹스(2x)
프라이머 세트 1New England BiolabsE7335L PCR 프라이머
DNA 겔 추출 키트QIAgen28106QIAquick 겔 추출 키트
, 형광 측정 정량화 키트Life Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit, dsDNA HS 분석 키트
RNA 클린업 키트, Qiagen74106RNeasy Mini Kit, 실리카멤브레인 컬럼
Rnase 억제제,Life Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
역전사 효소Life Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
핵산 겔 StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제New England BiolabsM0201LEnd repair enzyme
T4 RNA Ligase 1New England BiolabsM0204LEnzyme for 근접 결찰
T4 RNA Ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373L어댑터 결찰용 효소
TemedBio-Rad1610801TBE 우레아 겔 성분
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® RNA 추출 시약
Urea First BASEBIO-2070-5kg   
UV crosslinkerStratagene400072UV Stratalinker 1800
UV TransilluminatorUVP95-0417-01밴드 시각화용
Xylene Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
DNA 정리 ZymoResearch D4004Zymo DNA 집중기-5 
필요한 소프트웨어 목록
FastQC 소프트웨어0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep 소프트웨어1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA 소프트웨어0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS 소프트웨어1.2.1http://www.htslib.org/
PULLSEQ 소프트웨어1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR 소프트웨어2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON 스크립트PYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON 스크립트PYTHON 2.7.11
pickJunctionReads.awk AWK 스크립트AWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
strongElution buffer
0.3 M sodium acetate
< strong>Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
항상 Superase-in을 사용 전에 신선하게 추가하십시오. 단, 세척할 때를 제외하고<
strong>Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15 % 포름 아미드 (4 °C에서 암흑 보관; C)
사용
하십시오2x SSC 세척 버퍼
2x NaCl 및 구연산나트륨(SSC)(20x SSC Invitrogen stock에서 희석)
0.5% SDS
2x RNA 단편화 완충액
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA 로딩 염료
95% 포름아미드
0.02% SDS
0.02% 브로모페놀 블루
0.01 % 크실렌 시아 놀
1 mM EDTA
RT 프라이머 시퀀스:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG
, , , , , , , , https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010)....

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SPLASHUVRNA

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