일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

요약

유도만능줄기세포(iPSC)의 유지를 확인하기 위한 정기적인 특성화는 이러한 세포가 다른 응용 분야에 사용되기 전에 중요한 단계입니다. 여기에서는 면역세포화학을 통해 쉽고 일상적인 특성 분석을 가능하게 하도록 특별히 설계된 인간 iPSC의 소규모 증식 방법에 대해 설명합니다.

초록

인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)는 환자 특이성과 특징적인 줄기세포성으로 인해 질병 모델링 및 세포 치료에 활용하는 데 큰 관심이 있습니다. 그러나 iPSC의 기능에 필수적인 다능성은 이러한 세포를 이러한 응용 분야에 사용하기 전에 확인해야 합니다. 다능성을 확립하기 위해서는 다양한 세포 및 기능적 분석을 통한 iPSC의 엄격한 특성 분석이 필요하지만, 면역세포화학 기술을 통해 다능성 유지에 대한 일상적인 평가를 보다 간단하고 효과적으로 달성할 수 있습니다. 여기에서는 특히 면역세포화학을 사용하여 만능 상태의 검증을 용이하게 하기 위해 축소된 방식으로 hiPSC를 배양하기 위한 체계적인 프로토콜을 제시합니다. 보다 구체적으로 말하자면, 이 방법론은 무혈청 조건에서 iPSC를 성장시키고 면역세포화학에 이상적인 작은 챔버 슬라이드 또는 유리 커버슬립에 도금하는 효율적이고 비용 효율적인 방법을 포함합니다.

서론

유도 된 다 능성 줄기 세포로 인간 성인 체세포 재 프로그래밍 (iPSCs)는 병 ^{(1, 2)를} 연구하기 위해 환자의 특정 셀의 잠재적으로 무제한의 전원을 얻을 수있는 방법을 제공한다. 시험 관내에서 질병 표현형을 Recapitulating 것은 그럴듯한 질환과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수 있도록하고, 신약 개발을 강화하고 약 ³ 개인 것입니다. 또한, 인간 iPSCs (hiPSCs)는 죽은 세포 또는 장애를 바꾼 여러 질환 ^{(4)의 컨텍스트 (5)에} 기능을 회복하기위한 고유 자원으로 이용 될 수있는 특정 유형의 세포를 유도 할 가능성을 제공한다.

위의 응용 프로그램에서 iPSCs를 사용하는 중요한 전제 조건은 다 능성 및 미분화 상태가 문화의 확장 동안 유지되는 것을 보장한다. 일반적으로, techniq세포 및 특수 장비를 대량으로 필요로 이러한 유세포, 웨스턴 블롯, 중합 효소 연쇄 반응 분석 및 기능 등의 단말은, IPSC의 능성

프로토콜

hiPSCs는 4mm 피부 펀치 생검에서 분리 센다이 바이러스 매개 재 프로그래밍 ^(11)를 통해 집에서 재 프로그래밍 인간 피부 섬유 아세포에서 유래되었다. 애리조나 임상 시험 심사위원회의 대학은 대상 모집 및 생검 수집을위한 모든 절차를 승인했다.

IPSC 문화에 대한 세포 외 매트릭스 코팅 표면의 1. 준비

1. 어느 날 이전 iMEFs에 성장 hiPSC 문화의 합류로, 세포 외 기질 (마트 리겔) 코팅 된 플레이트를 준비합니다.
2. 천천히 해동는 세포 외 기질의 나누어지는 2 시간 동안 4 ° C에서 얼음 (종속 많이는 사양서에 지시 사항을 따르십시오).
3. 바이오 안전성 후드에서 차가운 피펫 팁을 사용하여 (DMEM / F12 / HEPES)이 많은 특정 희석 요인에 따라 감기 둘 베코의 변형 이글 중간 / 영양 혼합물 F-12 세포 외 기질의 1 분취 량을 추가 (-20 ° C에서 보관) .
4. 분배 ~ 600(81) 각각의 새로운 세포 배양을 잘 당 세포 외 기질의 L은 12 웰 플레이트가 필요로 처리 하였다.
5. 실온에서 수 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. 여기서, 3 시간의 배양 시간을 사용합....

결과

이 프로토콜은 특별히 능성 유지를 확인하기위한 비용 효율적인 면역 세포를 활성화하는 제한된 방식 피더 확보 조건 세포층으로부터 전송하고,이어서 전달되는 방법 인간 iPSCs의 단계적인 설명을 제공한다. 도 1은이 프로토콜의 개략도를 도시한다. 도 2a는 6 웰 플레이트에 iMEFs에 성장 hiPSC 식민지를 보여줍니다. 이러한 식민지 정의 테두리와 조밀 한 단계 밝은 센터와 전형적인 형태를 나타낸다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 12- 웰 플레이트에서 iPSCs의 전송이 끝날 공급기없는 조건, 콜로니 형태는 덜 뚜렷한 가장자리 다소 혼란 나타난다. 또한, 일부 iMEFs이 단계에서 문화에 남아있을 수 있습니다. 도 2c는 공급 장치가없는 시스템의 추가 통과 한 후, IPSC 식민지가 CY에 높은 핵을 가진 고전적인 단층 형태를 표시하는 것을 보여.......

토론

여기에 제시된 프로토콜 체계 특히 면역 세포를 통해 효과적인 능성 분석을 지원하기위한 축소 된 배양 기술의 형태로 시간을 절약하고 비용 효율적인 방법을 제공한다.

다음과 같이 설명 된 방법의 주요 장점이다. 전통적 이상의 3~4 통로 ^{12, 13을} 표시 대량 분리 기술의 사용 후에 잔존 iMEFs을 제거하기 위해 전형적인 단층 형태를위한 배양 조건 부담을 피더 세포층으로부터 iPSCs를 전환 할 필요가있다. 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 IPSC 콜로니의 수동 따기 통해 무 혈청 조건 iPSCs 비교적 빠른 전송을 가능하게 단축 타임 라인을 포함한다. iPSCs 작은 챔버 슬라이드 나 면역 세포에 대한 도움이 된 커버에 제한된 양으로 성장하고 있습니다. 사실, volu웰 당 필요한 배지 내 단지 0.5 mL로하고이 프로토콜을 사용할 때 하나의 커버 슬.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM-F12/HEPES	Life Technologies	11330032
녹아웃 혈청 교체	Life Technologies	10828028
L-글루타민	Life Technologies	25030081
MEM-NEAA	생명 기술	11140050
2-메르캅토에탄올	생명 기술	21985023
재조합 인간 FGF-염기성	세포 과학	CRF001B
Y-27632 ROCK 억제제	R& D	1254
콜라겐분해효소 IV형	생명 기술	17104019
Matrigel hESC 인증 매트릭스	코닝	354277
mTeSR1 기초 매체	StemCell Technologies	05850
mTeSR1 5x 보충제	StemCell Technologies	05850
Gentle Cell Dissociation Buffer	StemCell Technologies	07174
0.1 M PO4 Buffer	In-House	N/a
파라포름알데히드, 프릴	Electron Microscopy Sciences	19202
1x 인산염 완충 식염수	n/a	/a
Normal Goat Serum	Life Technologies
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich	A2153
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	X100
Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) 마우스 mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) 마우스 mAb	세포 신호 세포 신호 세포 신호 세포 신호	2840 3579 4755 4746	또는 카탈로그 #9656
Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21042
Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21151
Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11037
멀티웰 세포 배양 플레이트	에서 6가지 다능성 1차 항체 조합을 키트로 함께 구입할 수 있습니다.피셔 사이언티픽	0720080/0720081	6, 12, 24, 48, 96 웰 크기로 사용 가능한
챔버 슬라이드	Fisher Scientific	12 565 21	유리 또는 퍼마녹스 플라스틱에서 사용 가능 1, 2, 4, 8, 16 웰 크기
커버글라스 성장을 위한 Fisher	Scientific	12 545 82	12, 15, 18, 22 및 25mm 크기로 제공

n 16210072