측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

Summary

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

Abstract

세포 이동은 면역 반응, 성장 및 상처 치유의 중요한 부분이다. 세포 이동은 세포, 세포 외 매트릭스와 수용성 및 비 수용성 화학 인자 (예, 화학 유인 물질) 사이의 상호 작용을 포함하는 복잡한 과정이다. 예 보이든 챔버 분석, 칸막이의 양측에 세포를 카운트함으로써 작업 등의 세포의 이동을 측정하기위한 표준 방법. 이 기술은 사용하기 쉽고; 그러나, 서로 다른 애플리케이션 작은 기하학적 변형을 제공한다. 대조적으로, 마이크로 유체 장치는 가용성 요소들 ^{(1, 2)의} 맞춤형 농도 기울기를 가진 세포의 이동을 관찰 할 수있다. 그러나, 미세 유체 기반의 분석을 만들기위한 방법을 배우기 어려울 수 있습니다.

여기서는 화학적 농도 기울기에 응답하여 세포 이동을 측정하기 위해 세포 배양 챔버를 생성하는 편리한 방법을 설명한다. 우리의 세포 마일연계 가능성 챔버 방법은 다양한 애플리케이션에 대해 세포 이동을 연구하기 위해 다양한 선형 농도 구배를 생성 할 수있다. 이 방법을 사용하는 것이 상대적으로 용이하고 일반적으로 학부 학생들에 의해 수행된다.

마이크로 챔버는 잘 페트리 접시에 최종 마이크로 챔버의 모양 아크릴 삽입을 배치하여 만들어졌습니다. 그 후, 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)의 삽입 위에 부었다. PDMS의가 경화시킨 후 삽입물을 제거 하였다. 이것은 어떤 원하는 모양이나 크기 우물의 생성을 허용했다. 이어서, 세포 마이크로 챔버에 첨가 될 수 있고, 가용 화제는 요구 에이전트에 아가 블록 담가 웰 중 하나에 첨가 될 수있다. 아가 블록 웰 중 하나에 첨가하고, 저속 이미지는 세포 이동을 정량화하기 위해 마이크로 챔버로 촬영 될 수있다. 이 방법의 변형이 방법 HIG을, 특정 응용 프로그램에 대해 할 수있다hly 사용자 정의 할 수 있습니다.

Introduction

상처 치유, 면역 반응 및 배아 발달과 같은 중요한 과정이 일어나기 위해서는 세포 이동이 일어나야 합니다. 세포 이동에는 세포와 인접 세포 간의 상호 작용, 세포 외 기질 및 용해성 화학 신호(유인제 또는 기피제)가 포함됩니다. 예를 들어, 상처 치유 과정에서 섬유아세포는 섬유형성과 상처 수축에 필수적인 역할을 하며, 세포는 세포외 기질^{3을 형성하기 위해 콜라겐을 합성하기 위해 손상 부위로 모집됩니다}. 섬유아세포가 상처 부위로 이동하는 수많은 메커니즘이 연구되었으며, 여기에는 다양한 기계적, 물리적, 전기적, 화학주성 요인이 포함됩니다⁴. 섬유아세포는 성장 인자의 다양한 농도 구배에 특히 잘 반응합니다. 이러한 다양한 성장 인자는 함께 작용하여 조직 재생을 최적화합니다⁵. 성장 인자 농도에 대한 섬유아세포의 화학주성 반응을 관찰하는 동안, 섬유아세포의 방향성 이동 패턴과 섬유아세포가 목적지에 도달하기 위해 물리적 장애물을 우회하는 방법을 연구할 수 있습니다. 따라서 이 연구의 목표는 먼저 물리적 장벽의 안내에 따라 섬유아세포의 성장을 추적할 수 있는 시스템을 개발하고, 두 번째로 섬유아세포가 시스템을 탐색할 때 섬유아세포의 성장을 모델링하는 것이었습니다.

현재 Boyden 챔버 분석은 세포의 이동을 측정하는 데 가장 널리 사용되는 시스템입니다⁶. Boyden 챔버는 2개의 챔버 다중 웰 플레이트로 구성되며, 각 웰에는 화학유인제가 있거나 없는 매체가 포함될 수 있습니다⁷. 필터 멤브레인은 각 웰의 두 챔버 사이에 다공성 인터페이스를 제공합니다. 이것은 세포가 적극적인 이동에 의하지 않는 한 통과할 수 없도록 장벽을 만듭니다. 일반적으로 Boyden 챔버의 경우 화학 유인제가 하부 챔버에 추가되고 시스템이 평형을 이루어 상부 웰과 하부 웰 사이에 구배를 형성할 수 있습니다⁴. Boyden 챔버 분석의 한 가지 문제점은 가파른 구배가 멤브레인 표면과 수직인 단일 축을 따라 형성된다는 것입니다. 이로 인해 상부 웰과 하부 웰 사이의 화학유인 물질 농도 차이가 원래 예상했던 것보다 낮아집니다. 이러한 제약으로 인해 Boyden 챔버 분석은 특정 세포 반응을 기울기 및 농도 차이와 같은 특정 구배 특성과 연관시키기 어렵게 만듭니다. 이러한 측정 없이는 다중 기울기 신호 적분을 연구하기 어렵습니다.

전통적인 Boyden 챔버 분석의 제약 조건 중 일부를 해결하기 위해 미세유체 분석은 사용자 정의 가능한 농도 구배를 형성하도록 개발되었습니다¹. 미세유체 시스템을 만들기 위한 표준 방법은 리소그래피 기술을 위한 클린룸을 필요로 합니다. 이러한 기술은 특히 표준 교실 환경에서 배우기 어려울 수 있습니다. 따라서 우리는 클린룸을 사용하지 않고 만들 수 있는 세포 이동을 측정하기 위한 챔버 시스템을 설계했습니다. 당사 시스템을 사용하여 분석의 웰을 원하는 크기로 조정할 수 있으며 맞춤형 기울기의 선형 농도 구배를 생성할 수 있습니다. 이를 통해 무작위 이동에서 화학주성을 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 설계는 다양한 화학적 자극에 대한 반응으로 세포 성장을 모델링할 수 있는 저렴하고 사용하기 쉬운 시스템입니다.

Protocol

1. 농도 구배를 만드는 마이크로 챔버를 생산

1. 아크릴 몰드 피스를 절단
   1. 원하는 폭의 아크릴의 조각을 얻습니다. 일반적으로 16분의 1 인치 두께의 아크릴 시트를 사용합니다. 두꺼운 시트는 그들을 과정에서 깨지거나 왜곡하는 원인이 필요한 기계적 강도를하지 않아도 잘 매우 얇은 시트를 절단하기가 어렵다.
   2. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 내에 공동을 생성하기 위해 아크릴 조각의 소망하는 형상의 CAD 파일을 만든다. 개별 실험 프로토콜에 관련된 원하는 경사를 달성하기 위해 채널 폭과 길이를 조정한다.
      1. 두 개의 사각형 (0.254 cm X 0.254 cm)를 0.127 cm 폭 채널에 의해 (0.254 cm 길이)에 연결한다 (그림 1) : 여기에, 다음과 같은 크기의 아크릴 조각을 사용합니다.
   3. 마뉘에 따라 레이저 커터에 아크릴 조각을 레이저 절단 장치로 CAD 파일 가져 오기 및 배치의 facturer의 프로토콜입니다.
      참고 : 또는, CAD 디자인에서 조각을 3D는-인쇄 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 다른 재료를 주형에 사용될 수 있다는 것이다; 그러나, 해상도 및 재현성은 레이저 가공에 비해 3D 인쇄로 감소 될 수있다.

그림 1 : 마이크로 채널 상공 회의소의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 대표. 이 이미지는 마이크로 챔버를 작성하는 데 필요한 아크릴 인서트의 CAD 도면을 도시한다. 1 A) CAD 도면, 1B) 인치 치수 도면 CAD의 측면보기, 1C) 인치 치수 도면 CAD의 상위 뷰의 상위 뷰 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

난>은 폴리 디메틸 실록산 쏟아져 (PDMS)
1. 무게 보트에서, 상업 엘라스토머 경화제 (예를 들어, 실 가드 194)의 1 중량 부와 상업 엘라스토머 자료의 무게 (예를 들어, 실 가드 184)에 의해 10 부 섞는다. 전형적으로, 엘라스토머 경화제 1g에 엘라스토머 기지 10g을 혼합한다.
2. 5 분 동안 마이크로 피펫으로 기재와 경화제를 결합 교반한다.
3. 진공 벨을 설정하고 갇혀있는 공기 방울을 제거하는 30 분 동안 진공에 PDMS와 무게 보트를 배치합니다.
4. 진공을 끄고 무게 보트를 제거합니다. 작은 페트리 접시에 아크릴 컷 아웃의 상단에있는 PDMS를 따르십시오. PDMS의 완전히 삽입을 다루고 있는지 확인합니다.
5. PDMS의 실내 온도 (최소 18 시간) 밤새 치료 할 수 있습니다.
2. PDMS에서 삽입물을 제거
   1. PDMS의 경화 후, 조심스럽게 메스와 아크릴 조각 주위에 PDMS를 절단하여 삽입물을 제거합니다.

2. 마이크로 챔버 내의 도금 세포

1. 세포를 도금 챔버를 살균.
   주 : PDMS가 에틸렌 옥사이드 또는 다른 기술을 사용하여 소독 될 수 있지만, 짧은 UV 처리는 세포 배양 연구에 대한 빠르고 저렴하고 충분하다. 짧은 UV 처리 기간은 PDMS 부재의 구조 또는 기계적 완전성을 손상하지 않았다.
   1. 표준 세포 배양 캐비닛 완전히 70 % 에탄올로 챔버 커버.
   2. 뚜껑 오프와 층류 후드에 페트리 접시를 넣어.
   3. 후드를 종료하고 자외선을 켭니다. 1 ~ 2 시간 동안 자외선에 노출.
   4. 층류 후드를 열고 흐름을 다시 15 분을 기다립니다.
   5. 70 % 에탄올을 제거합니다.
   6. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 챔버를 씻으십시오. 각각의 세척을 위해 PBS 1 ㎖를 사용합니다. PBS를 제거하고 챔버 뚜껑 떨어져 밤새 건조 할 수 있습니다.
      참고 : 또는 대신가능한 경우 층류 후드를 사용하는 살균하는 UV 챔버 박스를 사용한다. 알루미늄 호일 늘어선 골판지 상자의 배면에 UV 광원을 배치하여 UV 상자를 만든다. 알루미늄 포일은 샘플 심지어 조명을 허용하도록 광을 반사한다.
2. 상공 회의소에 세포를 도금
   1. 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
      1. 0.4 % 트리 판 블루의 400 μL의 세포 현탁액 100 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 부드럽게 유리 커버 슬립 아래에 모두 실을 작성하여 혈구이 용액 100 μL를 적용합니다.
      2. 혈구의 그리드에 초점을 10 배 목표로 현미경을 사용합니다. 혈구 16 사각형의 한 세트에서 라이브 흠없는 세포를 계산하는 손 집계 카운터를 사용합니다.
      3. 16 사각형의 4 세트에서 세포를 계산합니다. 16 사각형의 4 세트에서 평균 세포 수를 가지고 5 × ⁴ 곱합니다. 마지막 숫자는 한 접점 인세포 현탁액을 세포 / ㎖ (R).
   2. 각 챔버에 잘 하나에 2,500 셀을 추가합니다. 이것은 ~ 30,000 / cm ^(2)의 거의 융합 세포 밀도로 변환한다.
   3. 세포가 미디어를 추가하기 전에 60 분 동안 챔버에 앉아 허용 (둘 베코의 수정 이글의 중간, 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신).

3. 덱스 트란 젖 아가로 오스 블록

1. 아가로 오스 블록 만들기
   1. 3 차원 인쇄 금형 (2mm X 2mm X 2mm)로 아가로 오스 3 %를 붓는다.
   2. 30 분 모든 거품을 제거하기 위해 아가로 오스는 진공 챔버 내에서 응고 할 수 있습니다.
   3. 금형에서 아가로 오스 블록을 제거합니다.
      주 : 또는 2mm의 두께의 작은 페트리 접시에 3 % 아가로 오스를 붓는다. 메스 또는 다른 절삭 공구를 사용하여 2mm X 2mm X 2mm 블록을 잘라. 이것은 금형 시스템과 같은 정밀한 아니지만 할 좀 더 쉽게 할 수있다.
2. 완전히 submerg주 화성 인자의 원하는 농도의 용액 E 아가 블록. 농도 구배의 형성을 평가하기 위해, 형광 덱스 트란과 함께 첫번째 챔버를 세척. 덱스 트란의 농도 및 분자량 수용성 인자 또는 관심의 약물의 일치해야합니다.
3. 아가로 오스 블록 하룻밤을 만끽 해보세요.

가용성의 인자 농도 구배를 평가하는 덱스 트란 확산의 4 시간 경과

1. 마이크로 챔버의 작은 사각형 웰 덱스 트란 젖은 아가로 오스 블록을 배치합니다.
2. 세포 이미징 시스템의 마이크로 챔버를 놓거나 저속 기능과 다른 형광 현미경을 사용한다. 제조업체의 지침에 따라 시간 경과를 시작합니다.
   참고 : 표시된 결과는 GFP 필터, 50 %의 빛, 4/10의 pH 및 4 배 배율로 촬영하고 있습니다.

세포 성장의 5 시간 경과

1. 의 일단 마이크로 챔버 플레이트 세포방. 여기 3T3 섬유 아세포를 사용합니다. 마이크로 챔버에 잘 하나에 2,500 셀을 추가합니다. 2.2.1에 설명 된대로 세포를 계산합니다.
   1. 세포가 미디어를 추가하기 전에 60 분 동안 챔버에 앉아 허용 (둘 베코의 수정 이글의 중간, 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신). 5 % CO _2에서 37 ℃에서 도금 셀과 마이크로 챔버를 유지한다. 채널을 통해 세포 이동은 현미경으로 볼 수 있습니다.
   2. 마커를 추가하거나 거리를 셀 전방 이동을 정량화하기위한 출발점 역할을하기 위해 마커로 챔버 내에서 미세한 결함을 사용합니다.
2. 아가로 오스 겔 (8mm ³ 블록)를 포함하는 배치하여 구배를 마련 농축 성장 인자, 화학 - 유인 제는 약물 또는 다른 인자 테스트되는 마이크로 채널의 한쪽 끝 (여기에서는, 40 % FBS가 예로서 사용되는) 방.
3. 이동 셀 앞의 시간 경과 이미지를 가져 가라. 여기서, 결과는 이리저리 셀의 이미지 표시NT 즉, 촬상 시스템을 이용하여 12 시간마다 촬영 하였다.
4. 세포 성장을 정량화 셀 앞에 사진을 사용한다. 첫번째 셀 전면 채널 벽 및 기준 마커에 의해 정의되는 다각형 마스크를 만드는 (roipoly)에 MATLAB polyfit의 기능을 이용하여 성장 속도를 계산한다. 이 마스크의 크기는 평균 셀 전면의 속도를 산출하는 전방의 이동 거리를 얻었다. 다른 연구는 유사한 방법 ^8을 이용했다.
   참고 : 동일한 거리 가용성 인자의 농도로 각 프레임에 대한 세포 성장 전면의 가장자리를 비교한다. 가용성 인자의 농도 구배가 1 차원 확산 모델 근사치를 이용하여 계산된다.
5. Phalloidin의 및 DAPI 염색을 이용하여 세포의 형광 이미지를 가져 가라.
   1. Phalloidin의 염색하기 전에 세포를 수정.
      1. 37 ° C에서 따뜻한 4 % 파라 포름 알데히드.
      2. 세포를 커버하기에 충분한 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다. 세포 보관10 분 동안 파라 포름 알데히드.
      3. 15 분마다 두 번 PBS로 씻어. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다.
   2. 세포에서 PBS를 제거하고 세포를 커버하기에 충분한 permeabilizing 솔루션 (PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100)를 추가합니다. 10 분 동안 솔루션을 둡니다.
   3. 각 5 분 동안 PBS로 두 번 세척 하였다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다.
   4. 세포에서 PBS를 제거하고 20 분 동안 솔루션 (PBS에 1 % 소 혈청 알부민)를 차단 추가합니다.
   5. 차단 솔루션을 제거하고 5 분마다 PBS로 2 회 세척한다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다.
   6. 사용하지 않을 때이 점에서, 알루미늄 호일로 광으로부터 세포를 보호한다. 세포에서 PBS를 제거하고 1 시간 동안 PBS에 희석 Phalloidin의 488 1:50 추가합니다.
   7. 각 세척에 대한 5 분 PBS에 2 회 반복한다. 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 사용합니다. 그런 다음 셀에서 PBS를 제거합니다.
   8. 15 분 동안 세포를 PBS로 1,000 : DAPI (4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌)를 추가 한 희석.
   9. 제거 DAPI와각 세척에 대한 5 분 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
   10. 마지막 세척을 제거하고 세포를 충당하기 위해 충분한 PBS를 추가합니다. 세포는 이제 형광 현미경으로 이미지화 될 수있다.

Results

도 2는 세포가 도금되는 위치에서 상기 채널의 대향 단부에 배치 된 소 태아 혈청의 구배에 응답하여 상기 채널을 통해 상기 셀 전면의 이동을 나타낸다. 셀 앞에 48 시간 (그림 2A), 72 시간 (그림 2B), 96 시간 (그림 2C), 120 시간 (그림 2D) 후 도금에 표시됩니다. 셀 전면의 이동이 경과 이미지를 추적하고, 이동 거리 및 성장 속도는 MATLAB polyfit의 함수로 계산 하였다. 이것으로부터, 평균 셀 전면 속도는 13.4 μm의 / H (도 3) 인 것으로 밝혀졌다. 도 4는 채널의 일단에 흠뻑 덱스 트란, 아가 로스 블록을 배치하고, 덱스 트란 12 시간 동안 채널을 통해 확산 할 수 있도록함으로써 설정된 형광 기울기를 나타낸다...

Discussion

우리 마이크로 챔버는 성장 인자 및 화학 유인 물질에 반응하여 세포의 이동 속도를 결정하고, 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 측정을 포함 목적의 다수를 위해 사용될 수있다. 이 세포를 성장 챔버의 일단에 화학 유인 물질을 배치하기 위해 마이크로 챔버를 이용할 수있다. 세포는 화학 주성 인자에 반응하여 증가하고, 세포 이동은 세포의 이동 속도를 결정하기 위해 분석 될 수있다 경과 화상 촬영에 의해 정량화 될 수있다. 이 방법의 대표적인 결과 성장 속도가 MATLAB polyfit의 함수를 사용하여 13.4 μm의 / H를 측정되었다도 3에 도시되어있다.

우리 마이크로 챔버의 또 다른 사용은 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 측정하는 것이다. 관심 약물 유사한 분자량의 덱스 트란 형광 태그는 DRU의 확산을 모델링하는데 사용될 수있다관심 g. 이는 샘플 기울기를 중단한다 대류 다량주의 깊게 취급해야하는 것이 중요하다. 이 방법의 대표...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Sigma-Aldrich	761036	폴리(dimethylsiloxane) 실리콘 엘라스토머 베이스와 실리콘 엘라스토머 경화제 포함
아크릴 시트	US 플라스틱	44200
일회용 페트리 접시	팔콘	25373-041
플루오레세인 이소티오시아네이트; 덱스트란	시그마-알드리치	FD20s-100MG
아가로스, 유형 I, 낮은 EEO	시그마-알드리치	A6013-100G
둘베코의 변형 독수리 매체 피	셔 사이언	11965092	세포 배지 구성 요소
소 태아 혈청	피셔 사이언티픽 16000036		세포 배지 구성
페니실린-스트렙토마이신	피셔 사이언티픽	15140148	세포 매체 구성 요소
인산염 완충 식염수(PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL 세포 이미징 시스템	Thermo Fisher Scientific	AME3300	시간 경과 이미지 촬영에 사용되는 기기
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	모델 번호 VLS2.30	플라스틱 절단에 사용되는 레이저 절단기