측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

요약

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

초록

세포 이동은 면역 반응, 성장 및 상처 치유의 중요한 부분이다. 세포 이동은 세포, 세포 외 매트릭스와 수용성 및 비 수용성 화학 인자 (예, 화학 유인 물질) 사이의 상호 작용을 포함하는 복잡한 과정이다. 예 보이든 챔버 분석, 칸막이의 양측에 세포를 카운트함으로써 작업 등의 세포의 이동을 측정하기위한 표준 방법. 이 기술은 사용하기 쉽고; 그러나, 서로 다른 애플리케이션 작은 기하학적 변형을 제공한다. 대조적으로, 마이크로 유체 장치는 가용성 요소들 ^{(1, 2)의} 맞춤형 농도 기울기를 가진 세포의 이동을 관찰 할 수있다. 그러나, 미세 유체 기반의 분석을 만들기위한 방법을 배우기 어려울 수 있습니다.

여기서는 화학적 농도 기울기에 응답하여 세포 이동을 측정하기 위해 세포 배양 챔버를 생성하는 편리한 방법을 설명한다. 우리의 세포 마일연계 가능성 챔버 방법은 다양한 애플리케이션에 대해 세포 이동을 연구하기 위해 다양한 선형 농도 구배를 생성 할 수있다. 이 방법을 사용하는 것이 상대적으로 용이하고 일반적으로 학부 학생들에 의해 수행된다.

마이크로 챔버는 잘 페트리 접시에 최종 마이크로 챔버의 모양 아크릴 삽입을 배치하여 만들어졌습니다. 그 후, 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)의 삽입 위에 부었다. PDMS의가 경화시킨 후 삽입물을 제거 하였다. 이것은 어떤 원하는 모양이나 크기 우물의 생성을 허용했다. 이어서, 세포 마이크로 챔버에 첨가 될 수 있고, 가용 화제는 요구 에이전트에 아가 블록 담가 웰 중 하나에 첨가 될 수있다. 아가 블록 웰 중 하나에 첨가하고, 저속 이미지는 세포 이동을 정량화하기 위해 마이크로 챔버로 촬영 될 수있다. 이 방법의 변형이 방법 HIG을, 특정 응용 프로그램에 대해 할 수있다hly 사용자 정의 할 수 있습니다.

서론

상처 치유, 면역 반응 및 배아 발달과 같은 중요한 과정이 일어나기 위해서는 세포 이동이 일어나야 합니다. 세포 이동에는 세포와 인접 세포 간의 상호 작용, 세포 외 기질 및 용해성 화학 신호(유인제 또는 기피제)가 포함됩니다. 예를 들어, 상처 치유 과정에서 섬유아세포는 섬유형성과 상처 수축에 필수적인 역할을 하며, 세포는 세포외 기질^{3을 형성하기 위해 콜라겐을 합성하기 위해 손상 부위로 모집됩니다}. 섬유아세포가 상처 부위로 이동하는 수많은 메커니즘이 연구되었으며, 여기에는 다양한 기계적, 물리적, 전기적, 화학주성 요인이 포함됩니다⁴. 섬유아세포는 성장 인자의 다양한 농도 구배에 특히 잘 반응합니다. 이러한 다양한 성장 인자는 함께 작용하여 조직 재생을 최적화합니다⁵. 성장 인자 농도에 대한 섬유아세포의 화학주성 반응을 관찰하는 동안, 섬유아세포의 방향성 이동 패턴과 섬유아세포가 목적지에 도달하기 위해 물리적 장애물을 우회하는 방법을 연구할 수 있습니다. 따라서 이 연구의 목표는 먼저 물리적 장벽의 안내에 따라 섬유아세포의 성장을 추적할 수 있는 시스템을 개발하고, 두 번째로 섬유아세포가 시스템을 탐색할 때 섬유아세포의 성장을 모델링하는 것이었습니다.

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프로토콜

1. 농도 구배를 만드는 마이크로 챔버를 생산

1. 아크릴 몰드 피스를 절단
   1. 원하는 폭의 아크릴의 조각을 얻습니다. 일반적으로 16분의 1 인치 두께의 아크릴 시트를 사용합니다. 두꺼운 시트는 그들을 과정에서 깨지거나 왜곡하는 원인이 필요한 기계적 강도를하지 않아도 잘 매우 얇은 시트를 절단하기가 어렵다.
   2. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 내에 공동을 생성하기 위해 아크릴 조각의 소망하는 형상의 CAD 파일을 만든다. 개별 실험 프로토콜에 관련된 원하는 경사를 달성하기 위해 채널 폭과 길이를 조정한다.
      1. 두 개의 사각형 (0.254 cm X 0.254 cm)를 0.127 cm 폭 채널에 의해 (0.254 cm 길이)에 연결한다 (그림 1) : 여기에, 다음과 같은 크기의 아크릴 조각을 사용합니다.
   3. 마뉘에 따라 레이저 커터에 아크릴 조각을 레이저 절단 장치로 CAD 파일 가져 오기 및 배치의 facturer의 프로토콜입니다.
      참고 : 또는, CAD 디자인에서 조각을 3D는-인쇄 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 다른 재료를 주형에 사용될 수 있다는 것이다; 그러나, 해상도 및 재현성은 레이저 가공에 비해 3D 인쇄로 감소 ....

결과

도 2는 세포가 도금되는 위치에서 상기 채널의 대향 단부에 배치 된 소 태아 혈청의 구배에 응답하여 상기 채널을 통해 상기 셀 전면의 이동을 나타낸다. 셀 앞에 48 시간 (그림 2A), 72 시간 (그림 2B), 96 시간 (그림 2C), 120 시간 (그림 2D) 후 도금에 표시됩니다. 셀 전면의 이동이 경과 이미지를 추적하고, 이동 거리 및 성장 속도는 MATLAB polyfit의 함수로 계산 하였다. 이것으로부터, 평균 셀 전면 속도는 13.4 μm의 / H (도 3) 인 것으로 밝혀졌다. 도 4는 채널의 일단에 흠뻑 덱스 트란, 아가 로스 블록을 배치하고, 덱스 트란 12 시간 동안 채널을 통해 확산 할 수 있도록함으로써 설정된 형광 기울기를 나타낸다.......

토론

우리 마이크로 챔버는 성장 인자 및 화학 유인 물질에 반응하여 세포의 이동 속도를 결정하고, 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 측정을 포함 목적의 다수를 위해 사용될 수있다. 이 세포를 성장 챔버의 일단에 화학 유인 물질을 배치하기 위해 마이크로 챔버를 이용할 수있다. 세포는 화학 주성 인자에 반응하여 증가하고, 세포 이동은 세포의 이동 속도를 결정하기 위해 분석 될 수있다 경과 화상 촬영에 의해 정량화 될 수있다. 이 방법의 대표적인 결과 성장 속도가 MATLAB polyfit의 함수를 사용하여 13.4 μm의 / H를 측정되었다도 3에 도시되어있다.

우리 마이크로 챔버의 또 다른 사용은 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 측정하는 것이다. 관심 약물 유사한 분자량의 덱스 트란 형광 태그는 DRU의 확산을 모델링하는데 사용될 수있다관심 g. 이는 샘플 기울기를 중단한다 대류 다량주의 깊게 취급해야하는 것이 중요하다. 이 방법의 대표.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Sigma-Aldrich	761036	폴리(dimethylsiloxane) 실리콘 엘라스토머 베이스와 실리콘 엘라스토머 경화제 포함
아크릴 시트	US 플라스틱	44200
일회용 페트리 접시	팔콘	25373-041
플루오레세인 이소티오시아네이트; 덱스트란	시그마-알드리치	FD20s-100MG
아가로스, 유형 I, 낮은 EEO	시그마-알드리치	A6013-100G
둘베코의 변형 독수리 매체 피	셔 사이언	11965092	세포 배지 구성 요소
소 태아 혈청	피셔 사이언티픽 16000036		세포 배지 구성
페니실린-스트렙토마이신	피셔 사이언티픽	15140148	세포 매체 구성 요소
인산염 완충 식염수(PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL 세포 이미징 시스템	Thermo Fisher Scientific	AME3300	시간 경과 이미지 촬영에 사용되는 기기
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	모델 번호 VLS2.30	플라스틱 절단에 사용되는 레이저 절단기

티픽 요소