방법 논문

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

DOI:

10.3791/55268

⸱

2017년 3월 16일

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

초록

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태반은 배아 발생 동안 처음 개발 기관이며, 배아의 생존을 위해 필요하다. 태반이 착상 전 배반포의 여분의 배아 trophectoderm 세포로부터 분화 다양한 융모 세포로 구성되어 있습니다. 이와 같이, 인간 태반의 초기 분화 이벤트에 대한 우리의 이해 때문에 인간 배아의 분리 및 조작에 대한 윤리적, 법적 제한으로 제한됩니다. 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)은 인간 발달을 조사하기위한 견고한 모델 시스템이며 또한 다양한 영양막 세포 유형의 마커를 발현 융모 세포로 생체 외에서 분화 될 수있다. 여기서, 우리는 뼈 형태 형성 단백질 (4) 및 티빈 / 노달 신호 전달 경로의 저해제를 사용하여 세포 내로 융모 hPSCs를 구별하기위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜 된 siRNA로 형질 감염 될 수있는 다양한 영양막 세포 유형을 생성손실의 기능 표현형을 조사 또는 병원균에 감염 될 수있다합니다. 또한, hPSCs는 유전자 변형 될 수 있고, 당시의 기능 이득 분석을 위해 영양막 세포의 전구 세포로 분화. hPSCs부터 인간 trophoblasts를 발생이 체외 분화 방법은 초기 인간 배아 작업의 윤리적 법적 제한을 극복하고,이 시스템은 약물 발견 및 줄기 세포 연구를 포함한 다양한 용도에 사용될 수있다.

서론

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태반은 임신 중 태아의 성장과 생존에 필요한 산모와 태아 순환 사이의 가스, 영양소, 노폐물, 호르몬의 교환을 용이하게한다. 포유류 배아 발생 동안 형성된 제 기관 6-7 일을 인간 임신 후 생쥐 1, 2, 3, 4 일 3.5-4.5 개발 시작 태반이다. 융모 세포는 태반의 가장 중요한 세포이며, 이러한 세포는 포유 동물 배아의 초기 계통 분화 이벤트 중 하나를 나타낸다. 그들은 착상 전 배반포의 외부 여분의 배아 trophectoderm 세포에서 발생한다. 태반 개발 초기 단계의 우리의 지식은 초기 인간 발달을 모델링에 대한 윤리적, 물류 제한에 의해 제한된다.

배아 이식, trophoblasts 중임산부 상피 세포를 침공하고 전문 전구 세포 (5)로 분화. Cytotrophoblasts (CTBS)의 융합 및 syncytiotrophoblasts (않은 SYN) 및 extravillous 침입 trophoblasts (EVTs)로 분화, 미분화 전구 세포를 단핵하는 앵커 자궁 태반을. 않은 SYN은 임신 유지에 필요한 호르몬을 합성 말기 분화 세포를 다핵 있습니다. 융모 세포에 손상이 유산, 전자 간증, 자궁 내 성장 제한 한 결과로 EVTs 및 않은 SYN을 생성 초기 분화 이벤트는, 태반 형성에 필수적이다. 개발 된 인간 영양막 세포주의 종류 CTBS 태반 호르몬 및 디스플레이 속성 침습 6 생산 융모 상피암를 불멸화 포함한다. 인간의 첫 번째 임신의 태반에서 차 융모 세포는 고립하지만, 세포 빨리 DIF 할 수 있습니다ferentiate 및 체외에서 증식 중지합니다. 중요한 변형 일차 세포주는 종양 및 영양막 불멸화 세포주 정확하게 차 trophoblasts 7 표현되지 않을 수 있음을 나타내는 다른 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 또한,이 라인은이 세 번째 학기를 통해 첫 번째 이후의 단계에서 파생되기 때문에 태반의 영양막 세포 줄기 세포 전구 세포를 닮은 않을 것이다.

태반의 형성 및 기능의 초기 사건을 연구하기 위해 초기 단계 인간 trophoblasts의 체외 배양 시스템에서 강력한 필요성이있다. 착상 전 배아의 내부 세포괴와 속성을 공유하는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)은, 종종 조기 태반의 형성을 포함한 초기 인간 현상을 모델링하기 위해 사용된다. 두 사람의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 및 hESCs는 뼈 모르를 사용하여 체외에서 trophoblasts로 분화 될 수있다phogenic 단백질 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4을 이용한 융모 세포로 다 능성 세포의 이러한 변환은 인간 세포에 특이하고 초기 인간 배아 구 (16)에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 널리 초기 인간 태반의 개발을 연구하는데 사용된다. 최근에는 발견되었다는 억제제의 첨가 A83-01 (A) 및 된 Smad2 / 3, MEK1 / 2의 신호 전달 경로를 차단 PD173074 (P)는, trophectoderm 같은 조상 주로 않은 SYN으로 hPSC 분화의 효율을 증대 및 중배엽, 내배엽, 또는 외배엽 세포 9, 17의 광범위한 세대가없는 EVTs, . 십이일 인간 포배 단계의 배아로부터 단리 trophectoderm 세포와 유사한 유전자 발현 프로필을 가지며 각종 태반 특정한 성장 호르몬 분비에 대한 이러한 매질 조건을 이용하여, hESCs는이 시험 관내 모델 시스템 (9), (11)의 유효성을지지 차별화. 여기서는 BMP4 / A / P 배지를 이용하여 인간 전구 세포 영양막에 hPSCs의 생체 외 분화에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이러한 조건은 리포 펙션 - 매개 형질 전환을 사용하여 RNA 서열, 유전자 파괴 된 siRNA를 이용하여, 병원체 감염, 유전 적 변형을 포함한 다양한 애플리케이션에 세포 과잉수 생산.

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프로토콜

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참고 : 영양막 세포의 전구 세포에 하나 hESCs는 또는 hiPSCs의 분화를 들어, 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 성장 hPSCs는 BMP4 / A / P와 분화를 시작하기 전에이 구절에 대한 조건없는 공급기로 전환된다. 이 과정은 분화 된 세포의 MEF 오염을 제거한다. 여기서는 hESC의 분화를위한 프로토콜을 제공하고, 동일한 프로토콜 hiPSCs에 적용될 수있다.

1. 문화 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포에 hESCs는의 복구 (MEFs에) (준비)

  1. MEFs에의 감마 조사
    1. 10 % FBS, 2 mM L- 글루타민, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)를 DMEM, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA) 다음 MEFs에 배양 용 배지 500 mL로.
    2. 기본 MEFs에 하나 바이알을 해동하고, 세포를 배양 MEF 매체를 사용한다. MEF 문화 매체를 이용하여 30 판에 기본 MEFs에를 확장합니다.
      주 : 산소 농도가이 단계에 대한 중요하지, 그래서어느 인큐베이터 내에서 4 % 생리 또는 주위 (20 %)의 조건을 사용할 수있다.
    3. MEFs에 수확. 플레이트로부터 제거하고 MEFs에 원추형 튜브에 세포를 전송하기 위해 0.25 % 트립신을 사용한다. 조사 악기로 MEFs에 배치하고 3,500 회색에 세포를 노출합니다.
      주 : 시간의 양이 조사부 부 내부 소스의 활성에 의존 할 것이다.
    4. MEF 배양액을 조사 MEFs에 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산.
    5. 원심 분리기를 이용하여 펠렛 MEFs에 50 % MEF 배지 및 배지 (80 % FBS와 20 % MEF 배지)를 50 % 동결 세포를 추가한다. 나누어지는 유리 병 당 1 × 10 6 세포.
    6. 하룻밤 -80 ° C 냉장고에 조사 MEF 튜브를 배치하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 전송.
  2. 문화 냉동 MEFs에와 hESCs는 해동
    1. hESC의 매체의 500 ml의 확인 : DMEM을 / F-12와 20 % 혈청 REPLAC장담, 0.1 mM의 NEAA, 2 mM의 L 글루타민, 10 NG / ㎖의 bFGF, 0.1 MM의 β-머 캅토 에탄올 및 1X 펜 / 패 혈성.
    2. hESCs는 해동 전에 MEFs에 1 일 한 병을 녹여. 코트 각 웰에 1 ml의를 사용하여 0.1 % 젤라틴과 6 웰 플레이트. 실온에서 적어도 20 분 동안 배양 한 다음, 젤라틴을 제거한다.
    3. 액체 질소 저장에서 MEFs에의 병을 제거하고 37 ° C의 물을 욕조에 유리 병을 담그지. 단지 작은 얼음 결정이 남아 간헐적 때까지 병을보세요. 신속 15ml의 원뿔형 튜브 내부 MEF 배지 9 ml의 바이알의 내용물을 옮긴다.
    4. 5 분 동안 200 × g으로 원심 분리하여 세포 펠렛. 뜨는을 기음과 MEF 매체에서 세포 펠렛을 resuspend. 6 웰 플레이트에 균등하게 MEFs에 나누어지는. 하룻밤 37 ℃로 낮은 산소 (4 %) 배양기에 플레이트를 넣습니다.
  3. MEFs에에 hESCs는의 일상 문화
    1. 액체 질소에서 hESC의 유리 병을 제거하고 신속하게 3를 사용하여 병을 해동7 ° C의 물을 욕조. 조심스럽게 hESC의 매체의 9 ml의를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브로 hESCs는 피펫 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운. 배지를 제거하고 hESC의 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁.
    2. 단계 1.2.4에서 제조 된 판에서 MEF 매체를 기음과 hESC의 배지 1 ㎖를 추가합니다. hESC의 매체에 바위 억제제 Y-27632 (10 μM)를 추가합니다. MEFs에 상 hESCs는을 전송합니다.
    3. 하룻밤 37 ° C 낮은 산소 (4 %) 인큐베이터로 세포를 놓습니다. 매일 hESC의 매체를 교체합니다. 4 배에서 직립 현미경으로 시각화 파스퇴르 피펫으로 차별화 된 세포를 긁어.
    4. 통로 hESCs는 모든 4-6일, 세포 생장 및 hESC의 콜로니의 크기에 따라. 계대 전날 MEFs에 접시를 준비합니다. 세포가 통과 할 준비가되면, hESC의 매체를 제거하고 PBS 1 ㎖로 잘 씻는다.
    5. 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제를 추가 (37 ° C로 미리 예열), 5 분 동안 37 ℃에서 배양하고, 콜라게나 제를 제거합니다. WPBS로 세포를 웰 당 화산재 hESC의 배지 1 mL를 넣고 5 ㎖ 수동 피펫의 끝을 사용하여 작은 덩어리로 세포를 긁어. 새로운 MEF 코팅 잘 (들)에 일시 중단 된 세포 덩어리를 전송합니다.

MEFs에에서 hESCs는 2. 전환은 공급없이하는 세포 외 매트릭스 코팅 된 플레이트에 조건을

  1. 준비 MEF 중간 (CM)를 금연실
    1. 90~100%의 포화 상태에서 T75 플라스크에 조사 MEFs에 플레이트; 치밀 MEFs에 도금하는 것이 중요하다. 들이 플라스크의 바닥에 부착 여부를 결정하기 위해 현미경을 사용하여 세포를 관찰 (MEFs에 도금 또는 다음날 약 6 시간 후에 부착).
      참고 : 현미경을 사용하여 관찰 할 때 붙어 있지 않은 세포가 중간에 떠. 다음 날, MEF 매체를 제거하고 B-FGF가없는 hESC의 매체의 25ml를 추가합니다.
    2. 배양 24 시간 후 조정 배지를 수집합니다. 십이일의 최대 매일 새로운 배지로 교체하십시오.
    3. 0.22 μM 필터를 사용하여 수집 된 CM 필터. 앞서, 사용하는 CM에 신선한 B-FGF를 추가합니다.
      참고 : CM은 -80 ° C에서 냉동 1 년까지 저장할 수 있습니다. 또한, 2 주 4 ° C에서 CM을 저장합니다.
  2. 전환 MEFs에에 문화에서 hESCs는이 피더 무료로하는 세포 외 기질 코팅 플레이트.
    1. 코팅 조직 배양 플레이트에 대한 세포 외 매트릭스의 제조
      1. 얼음에 세포 외 기질의 분취 량 (약 3 ~ 4 시간)을 해동. 얼음처럼 차가운 팁, 일, 차가운 50 ML 원뿔 튜브 및 DMEM / F12 매체, 전송 얼음처럼 차가운 DMEM 24 ml의에 세포 외 기질의 2 mg의 사용 / F-12 (희석는 공급 업체에서 세포 외 기질 농도에 따라 달라집니다 ).
      2. 즉시 얼음에 50 ㎖에게 원뿔 튜브를 전송하고 4 ℃에서 보관합니다. 코팅 조직 배양 플레이트의 웰에 희석 된 세포 외 기질의 적당량을 추가 (예컨대, 6 웰 플레이트에 웰 당 1 mL) 중. 코팅 플레이트 소용돌이 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다.
    2. B-FGF (10 NG / ㎖)를 함유하는 CM을 사용 MEFs에 발 (단계 1.3)을 통과 hESCs는.
      1. 대기음은 새로운 판에서 세포 외 기질을 제거하고 B-FGF를 포함하는 CM을 추가 할 수 있습니다. 피펫을 사용하여 MEF 플레이트에서 긁어 세포 덩어리를 전송하고 세포 외 기질 코팅 된 플레이트로 나누어지는. 밤새 37 ℃로 저산소 배양기에서 품어.
      2. 매일 B-FGF 매체와 CM 교체; 매체의 크기는 배양 플라스크의 크기에 의존 할 것이다. 한 6 잘 잘위한 매체 2 ㎖를 사용합니다. 파스퇴르 피펫으로 차별화 된 세포를 긁어.
      3. 통로 hESCs는 현미경으로 볼 때 식민지가 밝은 모든 6~7일.
        참고 : 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 성장 hESC의 식민지가 MEF-배양 된 세포보다 큰 성장한다.
      4. 공급 장치가없는 세포가 통과 할 준비가되면, 광고에 의해 세척, 매체를 제거PBS를 제거하기 위해 피펫, 기음을 사용하여 PBS의 땡 1 ㎖를 추가, 0.5 ㎎ / ㎖ 디스 파제 피펫으로 (37 ° C로 미리 예열), 5 분 동안 37 ° C에서 품어.
      5. 잘 당 PBS 2 ㎖를 추가하고 나중에 흡입에 의해 PBS로 세포를 씻으십시오. 물론 당 CM의 1 ML을 추가하고 수동 5 ml를 피펫의 팁을 사용하여 작은 덩어리로 세포를 긁어.
      6. 새로운 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 일시 중단 된 세포 덩어리 플레이트; 세포는 24 시간 후 준수해야합니다.

BMP4 / A / P를 사용하여 hESCs는 3. 차별화

  1. 분화 매체를 준비합니다. 사용 CM은 (B-FGF 결여)와 추가 (신선한) BMP4 (50 NG / ㎖) A83-01 (1 μM), 및 PD173074 (0.1 μM). 사용하기 전에 CM 이러한 억제제를 추가합니다.
  2. 4 % 산소로 설정 인큐베이터 내 배양 한 통과를 위해 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 성장 공급 장치가없는 hESCs는을 사용합니다. 세포 외 기질 코팅 된 플레이트 상에 제 1 통로 후,세포는 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다. 다음 날, 분화를 시작합니다. (B-FGF를 포함) 형상을 제거하고 BMP4 / A / P (6 웰 플레이트에 웰 당 2 ml)에 포함 된 CM로 교체합니다. 4 %의 산소 농도를 이용하여 세포를 배양 계속.
  3. BMP4 / A / P를 포함하는 CM (2 ㎖ / 잘위한 6 웰 플레이트) 2 일마다 교체합니다. 대기음은 기존의 매체를 제거하고 피펫을 사용하여 새 CM을 추가 할 수 있습니다. B-FGF (고려 차별화 하루 2) BMP4을 추가 및 제거에 이어 두 번째 날에, 세포 형태는 현미경을 이용하여 관찰 할 때 더 큰 나타나는 변경됩니다.
    참고 : 밝은 둥근 모서리를 보이는 미분화 세포는 존재하지 않습니다.
  4. 원하는 시간 지점에서 세포를 수집합니다. 차별화 된 세포는 약 2 주 후에 분할 중단됩니다. 이 기간 동안 형질 세포 (다음 섹션 참조).

siRNA를 또는 플라스미드 DNA와 융모 세포의 4. 형질

  1. 형질 전환을위한 융모 세포를 준비
    1. MEFs에 그들을 전송 후 세포 외 기질에 두 구절에 대한 문화 hESCs는 (단계 2.2 참조). B-FGF를 포함 hESC의 매체를 사용합니다.
    2. 차별화 전에 새로운 세포 외 기질 플레이트 일일 위에 hESCs는 분할합니다. 다음날 적어도 50 % 컨 플루을 보장하는, 잘 / 새로운 판에 1 : 높은 휴대 포화 상태가 중요하므로 세포 1을 분할합니다. 저산소 배양기에서 세포를 밤새 인큐베이션.
      참고 : hESCs는이 단계에서 계산 할 필요가 없습니다.
    3. 다음날, 분화 배지로 배지 교환 (CM 6 웰 플레이트 ㎖ / 웰 BMP4 / A / P를 함유하고 B-FGF 결여, 2를 이용). 흡인에 의해 기존의 매체를 제거하고 피펫을 사용하여 새로운 매체 (2 ml)에 전송합니다. 밤새 낮은 산소 인큐베이터 (4 % 산소)에 세포를 놓습니다.
  2. 형질 유전자 파쇄 된 siRNA를 이용하여 또는 플라스미드 DNA를 사용하여
    1. 원하는 시간 -까지 세포 분화(일 1과 14 사이)을 가리 킵니다. 트랜 스펙 션 하루 전에 5 분 동안 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 Trypsinize. 젤라틴 코팅 플레이트 상에 원하는 컨 플루 (형질 감염 시약 프로토콜에 따라 다름)에 플레이트 (제거하는 20 분 및 흡인을위한 조직 배양 접시에 0.1 % 젤라틴 추가). (B-FGF가없는) BMP4 / A / P를 포함하는 CM을 추가하고 밤새 품어.
    2. 다음날, 세포에 신선한 차별화 매체를 추가 할 수 있습니다. siRNA와 형질 감염 시약을 사용하여 siRNA를 형질 감염. 플라스미드 DNA를 들어, 적절한 리포 펙 타민 시약을 사용한다.
    3. 각 형질 전환 시약에 기재 한 바와 같이 제품 프로토콜을 따르십시오. 저산소 배양기에서 밤새 셀, 셀의 각 웰 / 플레이트로 siRNA에 리포 펙 타민 단지 이동을 부드럽게 혼합하고 배양.
      참고 : 일부 형질 전환 시약이 CM은 펜 / 연쇄상 구균이 부족 필요 항생제에 의해 억제된다.
    4. 다음날, 신선한 분화 용지로 교체합니다.
    5. 욕망에서 세포를 수확(D) 타임 포인트 (예를 들면, 24 시간, 48 시간 및 72 시간)을 정량적 RT-PCR을 사용하여 유전자 파쇄 효율을 확인한다. 수확 셀, 웰 당 1 ml에 첨가하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양하고, 0.05 % 트립신을 사용한다. 트립신을 중화 잘 당 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운하고 RNA의 분리를위한 세포 펠렛을 사용한다.

융모 세포의 5 병원체 감염 : 센다이 바이러스 성 감염

  1. 차별화 hESCs는 준비
    1. MEFs에의 전송 후 세포 외 기질에 두 구절에 대한 문화 hESCs는 (단계 2.2 참조). B-FGF를 포함 hESC의 매체를 사용합니다.
    2. 차별화 전에 새로운 세포 외 기질 플레이트 일일 위에 hESCs는 분할합니다. 다음날 적어도 50 %의 포화 상태를 확인하는 새로운 판 / 웰,에 1 : 높은 휴대 포화 상태가 중요하므로 분할 세포 1입니다. 저산소 배양기 (4 %의 산소)에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션.
      참고 : hESCs는이 단계에서 계산 할 필요가 없습니다.
    3. 다음 날, 낮은 산소 인큐베이터 (4 % 산소)의 분화 배지 (CM 포함 BMP4 / A / P 및 부족 B-FGF)과 하룻밤 문화 매체를 교체합니다.
  2. 융모 세포의 센다이 바이러스 감염
    1. 어느 날 원하는 차별화 하루 전에 5 분 동안 0.05 % 트립신을 사용하여 (단일 세포) 분화 세포를 Trypsinize 및 젤라틴 코팅 플레이트로 전송. 차별화 매체를 추가하고 저산소 배양기에서 하룻밤 품어.
    2. 다음날, (이 바이러스에 따라 달라집니다) 감염 매체를 추가합니다. 6 웰 플레이트 잘 하나 0.5 ml에 사용 BMP4 / A / P를 포함하는 펜 / 연쇄상 구균이 결여 사용 CM. MOI는 저산소 배양기에서 8 시간 동안 1 품어을 = 센다이 바이러스를 추가합니다.
    3. 추가 시간 포인트가 필요한 경우, 4 시간 후 바이러스 함유 배지를 제거하고 BMP4 / A / P의 CM으로 대체. 세포를 수집RNA 분리하는 셀 스크레이퍼를 사용.
    4. 바이러스 반응 (18)에 관여하는 유전자에 대한 QRT-PCR을 수행하여 바이러스 감염의 효율성을 확인합니다.

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결과

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hPSCs의 체외 분화의 개요

이 체외 분화 프로토콜은 하나의 통로 (그림 1A)에 대한 조건없는 공급기로 전환하는 MEFs에 성장 미분화 hESCs는 시작됩니다. 우리는이 프로토콜에 hESCs는의 분화를 설명하는 동안, 우리는 성공적으로 융모 세포로 hiPSCs를 구별하기 위해이 프로토콜을 사용했다. 세포 외 매트릭스로의 전환은 인간 융모 성 세포의 순수 인구 요구 분석을위한 바람직하지 않다 조사 된 MEFs의 대부분을 제거한다. 미분화 hPSCs는 세포 외 기질에 성장 식민지가 계대 (약 1 주일)에 대한 준비가 될 때까지 CM은 B-FGF를 포함하는 배양한다. 이것은 BMP4 / A / P - 매개 분화를 유도하기 전에 능성 상태를 유지한다. 식민지는 ~의 덩어리로 50 ~ 100 세포를 파괴하는디...

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토론

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우리는 영양막 세포의 전구 세포로 hESCs는 차별화를위한 기본 단계를 제시했다. 이 프로토콜은 최근 융모 세포의 분화를 증가시키고 통상적 BMP4 단독 치료로 관찰 중배엽 전구 세포의 생성을 방지 빠르게 티빈 / 노달 시그널링 억제제의 추가 hESCs는 차별화하기 위해 최적화되었다. BMP4 모델 시스템은 인간의 영양막 세포 계보 사양 및 확장의 초기 단계의 시험을 허용한다. 또한,이 BMP4 모델 시스템은 융모막 암종 세포주 및 extravillous 영양막 세포주를 사용 불가능 특정 하위 계통에 융모 세포의 분화를 조사하는데 유용하다. 생체 유래 융모 상피 세포에서 siRNA를도 19을 사용하여 기능 상실 실험에 사용될 수있다. 또한, hESCs는 또는 hiPSCs 유전자 transgen의 유도 발현을 수정할 수 있습니다 ES 19 내인성 유전자좌 20...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 펜실베니아 건강 연구 포뮬러 펀드의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM/F12Invitrogen11330-057
Knock Out Serum ReplacementInvitrogen10828-028이 프로토콜에서는 이를 "혈청 대체"라고 합니다.
NEAAInvitrogen11140-050
FBSInvitrogen16000-044
L-글루타민Invitrogen10828-028
페니실린/스트렙토마이신Invitrogen15140-155
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
B-FGFMilliporeGF-003
DMEMInvitrogen11965-118
DispaseInvitrogen17105-041
콜라겐분해효소 IV형Invitrogen17104-019
Rock inhibitor Y27632Calbiochem688000
방사선 조사 CF1 MEFGlobalStem6001GMEF는 배아 13.5일 배아부터 생성되어 방사선 조사될 수 있습니다.
0.22 & 마이크로; m 주사기 필터MilliporeSLGS033SS
Heracell 150i 저산소 인큐베이터Heracell/VWR89187-192산소 농도를 조절할 수 있는 용량이 있는 모든 조직 배양 인큐베이터로 충분합니다.
BMP4R& D 시스템314-BP-01M
83-01R& D 시스템2939/10
PD173074R & D Systems3044/10
RNAiMaxInvitrogen13778150
TrizolThermoFisher15596026Trizol은 총 RNA를 분리하는 데 사용됩니다.
X-tremeGENE 9Roche6365779001
MatrigelCorning356231이 프로토콜에서는 이를 "세포외 기질"이라고 합니다.

참고문헌

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