방법 논문

건조 공기-LC 인터페이스에 Megamolecular 생체 고분자의 자체 통합을위한 방법

DOI:

10.3791/55274

⸱

2017년 4월 7일

 ,  ,  , 
1Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2Department of Bioengineering, School of Engineering, The University of Tokyo

이 논문에서

요약

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공기 액정 성 인터페이스 megamolecular 생체 고분자의 건조 - 유도 된자가 통합을위한 방법이 여기에 제공된다. 이 방법은 생체 고분자의 거시적 인 잠재력을 이해뿐만 아니라, 생물 의학, 환경 분야의 부드러운 소재에 대한 평가 방법으로뿐만 아니라 도움이 될 것입니다.

초록

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물을 사용 살아있는 유기체는 항상 환경에서 건조하는 경향이 있습니다. 관다발 물을 이동 및 피부 층에 물 보습의 경우에서 볼 수 있듯이 이들의 활동은 생체 고분자 기반의 마이크로 및 매크로 구조에 의해 구동된다. 본 연구에서는 건조 생체 고분자로 이루어지는 수계 결정 (LC) 용액의 효과를 평가하기위한 방법을 개발 하였다. LC의 바이오 폴리머가 megamolecular 무게를 가지고, 우리는 다당류, 세포 골격 단백질과 DNA를 연구하기로 결정했습니다. 편광하에 건조시 생체 고분자 용액의 관찰 불안정한 공기 LC 인터페이스부터 milliscale자가 통합을 보여준다. 수성 LC 생체 고분자 용액의 역학은 일측 개방 셀로부터 물을 증발에 의해 모니터링 될 수있다. 교차 편광을 이용하여 촬영 된 영상을 분석함으로써, 배 양성 위해 파라미터의 시공간적 변화를 인식 할 수있다. 이방법은 인공 다양한 분야에서 물질뿐만 아니라 자연의 살아있는 조직뿐만 아니라의 특성 유용 할 수 있습니다. 우리는 생물 의학 및 환경 분야에서의 부드러운 소재에 대한 평가 방법을 제공 할 것입니다 믿습니다.

서론

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생체 고분자의 강성, 막대 형상의 구조체에 초점을 동적 부드러운 물질은 다당류 생물막 행렬 1, 세포 골격 단백질이 이루어지는 "활성 겔"을 원하는 형상 (3)의 "DNA 접기」등, 다양한 용도로 사용되고있다. 구조적 특성을 명확히하기 위해, 많은 전략들이 이러한 투과형 전자 현미경, 주사 전자 현미경, 원자력 현미경, 및 공 초점 형광 현미경으로, 탐구되었다. 이러한 방법은 대부분 건조 또는 정적 상태에서 수행되기 때문에 그러나, 실제 생활 시스템에서 볼 수 있듯이, 거시적 규모의 동적 행동을 설명하기 어렵다. 최근에는 성공적으로 편광 된 광 (4)를 통해 수성 공기 LC 인터페이스 생체 고분자의 동적 거동을 관찰 하였다. 배향 구조의 시각화 동안 고분자 물질을 건조하는 동안용액의 시간적 변화는 불안정한 공기 LC 인터페이스 생체 고분자의자가 통합을 나타냈다.

여기서는 편광 수단을 이용하여, 공기 계면에서 LC LC 생체 고분자 용액의 건조를위한 프로토콜을 기술한다. 5,6 건조 고려하지 않는다는 LC상의 다른 분석 달리, 건조 공정 동안 LC 역학은 일측 개방 셀 내의 유체의 상 측면도의 배 양성 위해 파라미터를 평가하여 현재 조사했다 . 셀 증착의 조합 제어 증발 방향 육안 모니터링 허용 편광 수단의 사용. 또한,이 방법의 효과를 입증하기 위해, 분자량, 농도 등의 영향을받은 흡착 마이크로 도메인의 결정 구조에 집중하여 건조 기록을 확인할 수 있었다 건조 프로다당류, 미세 소관 (MTS), 및 DNA 등의 딱딱한 막대 모양 기본 생체 고분자의 세 스는 조사 하였다. 그들이 megamolecular 무게와 계층 거대 분자의 전형적인 예이며, 자신의 분자간 상호 작용 LC 상태를 형성 할 수 있도록하기 때문에 우리는이 생체 고분자를 선택했다.

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프로토콜

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1. 악기

  1. 편광 장치
    1. 편광 소자를 구성하는, 할로겐 램프, 도광판, 편광판, 시료 스테이지, 광학 레일로드 스탠드, 디지털 일안 리플렉스 카메라 (갖는 광원을 제공하는 편광에 대한도 1C와 자재 목록 참조 장치 부).

생체 고분자의 용액의 제조 (2)

  1. 다당류 솔루션
    1. 이상 ~ 12 시간 동안 80 ℃에서 교반하여 순수한 물 (100 mL) 중 sacran 7 (0.5 g)을 녹인다. 용해 중에, 증발을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 용기 커버. 동일하게 크 산탄 검의 수용액을 준비한다.
    2. 0.5 중량 % 수용액을 얻었다 ~ 25 ℃에서 용액을 냉각.
    3. 불순물 (48,400 XG, 4 ℃, 1 시간, 3 팀을 제거하는 용액을 원심 sacranES).
  2. MT 솔루션
    1. 브리튼 - 로빈슨 완충액에서 0.5 중량 %의 튜 불린 용액 (1 ml)에 준비 (80 mm의 N, N '비스은 피페 라진 (2- 에탄 설 폰산) (PIPES), 1 mM의 에틸렌 글리콜 비스 (β 아미노 에틸 에테르) - N, N, N ', N'-tetraacetic 아세트산 (EGTA); 얼음 8 5 밀리미터의 MgCl 2, pH를 6.8).
    2. 0.5 중량 % 튜 불린 용액 (50 μL) 및 사용 구아노 신 - 5 '- [(α, β) -methyleno] 포스페이트 (GpCpp) (5 μL)는 GpCpp 함유 튜 불린 용액 (50 μL)을 제조 하였다. 안정한 MT 핵을 얻기 위해 3 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
      참고 : GpCpp의 역할은 MT 형성을 지원하기 위해 완전히 튜 불린에 MT의 해중합을 억제하는 것입니다.
    3. 안정한 0.5 중량 % MT 용액을 수득 1 일 ~ 25 ° C에서 0.5 중량 % 튜 불린 용액 (950 μL) 및 GpCpp 튜 불린 - 함유 용액 (50 μL)를 섞는다.
  3. DNA 솔루션
    1. (1mM의 EDTA 10 개 mM 트리스, pH를 8.0) 트리스 EDTA 완충액에서 0.5 중량 %의 DNA 용액 (1 ml)로 준비한다.
  4. 건조 실험을 25 ℃에서 0.5 중량 %의 시료 생체 고분자 용액을 유지한다.

교차 편광 3. 건조 실험 및 관찰

  1. 한 측면에서 개방 셀 솔루션 (도 1a)
    1. 실리콘 낱장 1mm의 두께를 적절한 형상으로 (자재 목록 참조) (5-15 mm의 1mm의 내부 크기 및 ~ 20mm;도 1a).
      1. ~ 20mm 두 비 개질 된 유리 슬라이드 (76mm × 1 mm × 26 mm)을 5-15 mm 1 mm의 내 치수를 갖는 실리콘으로 이루어지는 스페이서의 한쪽 개방 셀을 조립하고. 누출에서 시료 용액을 유지하기 위해 사전에 더블 클립 셀의 양면을 수정합니다.
    2. 천천히 ~ 1 mm의 기공 크기를 피펫을 사용하여 0.5 중량 %의 생체 고분자 용액 (100-300 μL)을 각각 추가~ 25 ℃에서 각 셀에 TE 팁. 주사기 바늘을 사용하여 세포로부터 기포를 제거한다.
    3. 증발 대기압하에 60 ℃에서 공기 순환 오븐에서 함께 세포로; 증착 방향이 중력의 반대이다.
  2. 교차 편광하에 관찰 (도 1B-1C)
    1. 광역 (80mm X 80mm) 위에 평평한면 광원으로는 100 W 할로겐 램프를 통해 직선 가시 광선을 제공한다. 홀더 (도 1C)를 사용하여 45 ° 및 135 °에 편광판을 조정한다.
    2. 광학 레일로드 스탠드 (도 1C)를 사용하여, 광원, 편광기, 샘플 스테이지, 카메라의 위치를 고정한다. 두 편광판 사이에 시료 스테이지를 배치 (편광판 사이의 거리는 5cm ~이어야한다). 집중 할 수 있도록 샘플 단계부터 ~ 20cm를 카메라를 놓습니다.
    3. 주어진 시간에, 폴라 사이의 단계 3.1.3에서 샘플을 배치XZ 평면에 평행 한 단에 rizers 검은 커튼 장치를 커버; 실제 장치가도 1c에 도시되어있다.
    4. 표준 줌 렌즈와 디지털 일안 리플렉스 카메라를 사용하여 선형 교차 편광판을 통해 샘플을 촬영 (재료 목록 참조). 컴퓨터 소프트웨어 (자료 목록을 참조)을 사용하여, 같은 초점 거리와 같은 카메라 설정을 제어 할 수 있습니다.
  3. 투과광 강도의 시공간적 분석 (도 1C)
    1. 건조 공정의 순서 배 양성 파라미터의 변화를 평가하기 위해 24 시간 동안 시간당 사진을 수집한다.
    2. (예 ImageJ에) 화상 처리 프로그램을 사용하여 그레이 값과 Z 방향의 중심선을 따라 투과광의 강도를 측정한다.
    3. 상부 개방 측으로부터의 거리의 함수로서 그레이 값의 그래프를 그린다.
  4. 교차 편광 조명 관리에서 현미경 관찰t (도 1D)
    1. , 방법을 확인 CCD 카메라 (9)가 장착 된 편광 현미경 현미경 관찰을합니다. 빛의 경로에 일차 위상차 판을 보관하십시오. PC에 소프트웨어를 사용하여 사진에 대한 조건을 제어합니다.

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결과

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도 1에 도시 된 바와 같은 장치를 사용하여 미소 영역에서 자기 통합 에어 LC 인터페이스 평가 건조 (도 2A)에 macrodomain한다. 건조 실험의 처음 입증 된 바와 같이, megamolecular 다당류 sacran (M w = 1.9 × 10 7g 몰 -1) 및 크 산탄 검 (4.7 × 106 그램 몰 -1) 두 종류, 비교 하였다. 도 2b는 교차 편광하에 셀 내의 용액의 사진을 보여준다. 건조 전에 두 솔루션의 산란 상태에서의 투과광 여러 밝은 영역을 관찰 할 수 있었다. 6 시간 동안 60 ℃에서 건조시킨 후, 용액 sacran 공기 LC 인터페이스 아래의 영역은 상당히 높은되었다. 이것은 도메인 겔 수축 과정에서 스킨 층의 형성과 동일한 인터페이스...

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토론

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이 때문에 투과광 강도가 너무 낮있는 카메라 샘플에 초점을 때로는 어려웠다. 이러한 경우, 무대에서 확장 된 투명 플라스틱 필름을 배치하는 것은 초점을 준비하는 데 도움이. 관측 가능한 해상도의 한계는 ~,이 경우에는 10 μm의 카메라 렌즈에 의존했다. 샘플의 두께, ΔY, 상기 관찰 ~ 제한이 경우 10mm 램프의 최대 광 강도에 의존했다.

도 1b에 도시 된 장치의 장점은 샘플의 사이드 뷰 사진 건조 공정 중에 수행 할 수 있다는 것이다. 관찰은 일반적인 현미경에 사용되는 수평면에 의존하지 않고 행할 수있다. 건조 실험 중 한쪽 개방 셀 서서, 증착 방향 조절 및 중력의 반대 방향이다. 측면도 모니터링 또한 건조 쥐의 계산을 가능하게전자 4.

미래에, 상기 장치의 시료 대에 온도 및 습도 조절기를 배치함으로써, 자동으로 배 양성 위해 파라미터 시간...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작품은 보조금의 원조 교육부, 문화, 스포츠, 일본의 과학 기술, 교토 Technoscience 센터 및 연구 개발에 대한 미타니 재단 젊은 과학자 (16K17956)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
sacranGreen Science Materials Inc., 일본Aphanothece sacrum.
Mw = 1.9 × 107 g mol-1
xanthan gumTaiyo Kagaku Co., JapanNeosoft XCFrom Xanthomonas campestris.
Mw = 4.7 × 106 g mol-1
tubulinCytoskeleton, Inc., USAT240돼지 뇌에서.
GpCppJena Bioscience, 독일NU405L
piperazine-N,N′ -bis (2-ethanesulfonic 산)Sigma-Aldrichi, Co. LLC.P6757-500G파이프
에틸렌 글리콜 - 비스 (&베타, - 아미노 에틸 에테르) -< >N, N, N', < / >- 테트라 아세트산Dojindo Molecular Technologies, Inc.342-01314EGTA
MgCl2-6H2OWako Pure Chemical Industries, Ltd.135-15055
KOHWako 순수 화학 공업, 주식 회사162-21813펠릿
DNA시그마 - Aldrich, Co. LLC.D1626연어 고환에서 .
Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp)
Tris-EDTA 완충 용액Sigma-Aldrich, Co. LLC.T9285-100ML10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA
슬라이드 유리Matsunami Glass Ind., Ltd., 일본S1111
실리콘 고무 시트Asone Co.6-611-32두께: 1 mm
원심분리기Beckman-Coulter, Inc., 미국Avanti J-25JA-20 로터 광원이 장착되어
Sumita Optical Glass, Inc., 일본LS-LHA
빛 가이드Sumita Optical Glass, Inc., 일본GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)80 mm × 80 mm
할로겐 램프Ushio Inc., 일본JCR 15V150WBN
홀더Sigmakoki, Co., Ltd.KMH-80
샘플 스테이지Sigmakoki, Co.,Ltd.TARW-25503L
시료 홀더Sigmakoki, Co.,Ltd.SHA-25RO
로드시그마코키 주식회사ROU-12-40
포스트 홀더Sigmakoki, Co., Ltd.RS-6-40
포스트 홀더Sigmakoki, Co., Ltd.RS-12-60
포스트 홀더Sigmakoki, Co., Ltd.RS-12-80
포스트 홀더Sigmakoki, Co., Ltd.RS-12-130
캐리어Sigmakoki, Co., Ltd.CAA-25 LS
카메라 홀더주식회사 시그마코키CMH-2
중형 광학 레일Sigmakoki, Co.,Ltd.OBA-500SH
렌즈튜브Tomytech, BORG렌즈튜브 BK80φ, L25mm 
lenstubeTomytech, BORGlenstube BK80φ, L50 mm 
다대역Tomytech, BORG80φ  
V 플레이트Tomytech, BORGV 플레이트 60S
플레이트 홀더Viexen, Co., Ltd.플레이트 홀더 SX
EOS Kiss X7i Canon Inc., Japan8594B001표준 줌 렌즈 포함,  EFP 18-55 mm
사진 소프트웨어Canon Inc., 일본EOS 유틸리티
PCMicrosoft표면
편광 현미경OlympusBX51
1차 지연 플레이트OlympusU-TP530λ = 530 nm
CCD 카메라OlympusDP80
사진 소프트웨어미국
Java 기반 이미지 처리 프로그램
는 있습니다. 국립보건원(National Institutes of Health) ImageJ 의 Olympus cellSens 표준

참고문헌

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  2. Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
  3. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  4. Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
  5. De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
  6. De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
  7. Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
  8. Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
  9. Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
  10. Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
  11. Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
  12. Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).

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