방법 논문

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

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DOI:

10.3791/55297

⸱

2017년 6월 26일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구

할 수 있도록 합니다.

초록

여기에 설명된 프로토콜은 연구자가 세포가 위치한 환경의 무결성을 변경하지 않고 세포 통신을 연구할 수 있도록 설계되었습니다. 특히, 척추 뉴런과 같은 흥분성 세포의 전기적 활동을 분석하기 위해 개발되었습니다. 이러한 시나리오에서는 척추 세포의 무결성을 보존하는 것이 중요하지만 관련 시스템의 해부학적 구조와 생리학적 모양을 보존하는 것도 중요합니다. 실제로, 신경계와 다른 복잡한 체계가 작동하는 방식에 대한 이해는 체계적인 접근에 기초해야 한다. 이러한 이유로 살아있는 제브라피시 배아를 모델 시스템으로 선정하고, 배아의 생리적 조건을 방해하지 않으면서 척추 뉴런 막의 전압 변화를 평가하였다.

여기에서는 제브라피시 배아를 FRET 기반 바이오센서와 결합하는 접근 방식에 대해 설명합니다. 제브라피시 배아는 매우 단순화된 신경계가 특징이며, 투명성 덕분에 이미징 응용 분야에 특히 적합하여 제브라피시 발달 중 원형질막에서 형광 기반 전압 표시기를 사용할 수 있습니다. 이 두 구성 요소 간의 시너지 효과로 인해 생리학적 상태를 교란하지 않고 손상되지 않은 살아있는 유기체에서 세포의 전기 활동을 분석할 수 있습니다. 마지막으로, 이 비침습적 접근 방식은 다른 분석(예: 여기에 표시된 바와 같이 자발적인 움직임 기록)과 공존할 수 있습니다.

서론

생체 내 전신 성분 분석을 통해 과학자들은 세포 행동을 가장 신뢰할 수있는 방법으로 조사 할 수 있습니다. 막 전압 변화가 흥분성 세포 간의 의사 소통을 유도하는 신경계에서와 같이 정밀 조사 활동이 세포 - 세포 상호 작용 (접촉 및 비접촉 의존 모두)에 크게 영향을받는 경우 특히 그렇습니다. 이러한 전기적 신호에 의해 암호화 된 정보의 이해는 신경계가 생리 및 질병 상태 모두에서 작동하는 방식을 이해하는 데 중요합니다.

대부분의 비 침습적 인 생리 조건에서 세포의 전기적 특성을 연구하기 위해 최근 유전자 조작 된 전압 지시기가 개발되었습니다 1 . 이전 세대의 광학 전압 센서 (주로 전압 감응 염료) 2 와 달리 GEVI는 손상되지 않은 신경계의 생체 내 분석을 허용하고,그들의 표현은 특정 세포 유형이나 개체군으로 제한 될 수 있습니다.

제브라 피쉬 태아 (zebrafish embryo)는 GEVI에 기인 한 큰 잠재력을 이용하는 생체 내 "기질"입니다. 사실, 광학적 인 명확성과 단순하지만 진화 적으로 보존 된 신경 시스템 덕분에 zebrafish 모델은 네트워크의 모든 세포 구성 요소를 간단히 식별하고 조작 할 수 있습니다. 실제로, FRET 기반 GEVI Mermaid 3 의 고용은 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 4 의 제브라 피쉬 모델에서 척추 운동 신경 행동의 사전 증상 변화를 확인하게했다.

다음 의 생체 내 프로토콜은 인과 관계를 표현하는 그대로의 제브라 피쉬 배아에서 척수 운동 뉴런의 전기적 특성을 모니터하는 방법을 설명합니다. 또한, 그것은 약리학 적으로 유도 된 chan이러한 전기적 특성의 변화는 초기 발달 단계에서 제브라 피쉬의 움직임을 특징 짓는 고정 관념 운동 활동 인 배아 자발적 감기의 빈도의 변화와 관련 될 수있다.

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프로토콜

1. pHuC_Mermaid Plasmid Generation

참고 : 인어 (Mermaid)는 Ciona intestinalis 의 전압 감지 도메인 (VSD)을 페어링하여 개발 된 바이오 센서입니다 FRET 파트너 형광체 Umi-Kinoko Green (mUKG : donor)과 오렌지색 발광 형광 단백질 Kusabira Orange (mKOk : acceptor)의 단량체 버전으로 인산 가수 분해 효소 (Ci-VSP)를 함유 한 Ciona robusta 5 전압 센서. 이 바이오 센서의 경우 멤브레인 탈분극에 의해 유도 된 VSD 도메인의 구조 변화는 공여체와 수용체 형광 단백질의 근접성을 증가 시켜서 이들 사이의 에너지 전달을 증가시킵니다 (FRET 비율 증가) 3 . VSD는 세포막에서 바이오 센서의 효율적인 위치를 보장합니다. 바이오 센서의 뉴런 발현 (척수에서 신호는 신경 세포와 운동 신경 모두에서 검출 가능)은 인어 op를 복제하여 얻을 수 있습니다zebrafish 팬 - 신경 발기인 HuC 6 에서 프레임을 읽는 (ORF).

  1. 업스트림의 Sma I 제한 효소 부위를 삽입하기 위해 T3 Universal primer와 Mermaid Sma I primer (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA)를 사용하여 Pfu (proofreading) DNA 중합 효소를 사용하여 pmer4 + Mermaid plasmid 3 의 Mermaid ORF를 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 인어 공주 ORF의
    1. 다음 PCR 혼합물을 사용하십시오 : Pfu DNA 중합 효소 0.5 μL, 특정 10 배 완충액 7.5 μL, 10 mM dNTP 1 μL, DMSO (dimethyl sulfoxide) 2.5 μL, 플라스미드 준비 0.5 μL (50 ng) 50 μL의 총 부피에서 각 프라이머의 20 μM 스톡 용액 μL.
    2. 95 ° C에서 15 초 동안 PCR 혼합물을 가열하고 50 ° C에서 15 초 동안 프라이밍 한 후 72 ° C에서 4 분 동안 길게 늘인 다음 35 사이클의 시간 동안 전체를 길게하십시오.
  2. 특정 뭉치를 젤 - 정화하십시오PCR 산물을 제조사의 프로토콜에 따라 시판되는 겔 정제 키트를 사용하여 정제 하였다.
  3. DNA 단편을 제조사의 프로토콜에 따라 pCMV-SC 무딘 벡터에 클로닝한다.
  4. HuC 프로모터의 다음 삽입을 위해 Sma I 제한 효소로 인어 양성 플라스미드 (pCMV-SC_Mermaid로 명명 됨)를 선형화한다.
    1. 다음과 같이 제한 반응을 설정하십시오 : Sma I 제한 효소 0.5 μL (10 U), 키트 10x 완충액 2 μL 및 20 μL 총 볼륨의 플라스미드 DNA 5 μg. 반응물을 25 ° C에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
  5. 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 겔 정화 키트를 사용하여 소화 플라스미드를 젤 - 정화.
  6. Pfu DNA 중합 효소와 zebrafish 게놈 DNA를 주형으로하여 HuC 특이 적 프라이머 쌍을 사용하여 HuC 프로모터 (pHuC)를 PCR 증폭한다 (HuCprom-forw1_SalI : 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA 및 HuCprom-rev1 : 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) 및 ATG의 상류 3,150-bp 영역에 걸쳐있다.
    1. 다음과 같은 구성표를 사용하여 PCR 혼합물을 설정 : Pfu DNA 중합 효소 0.5 μL, 특정 10x 버퍼 7.5 μL, 10 MM dNTP 1 μL, DMSO 2.5 μL, 게놈 DNA의 200 NG 및 20 μM의 1 μL 50μL의 총 부피에서 각각의 프라이머의 시약.
    2. 95 ° C에서 2 분간의 초기 단계 후 95 ° C에서 15 초 동안 PCR 혼합물을 가열하고 50 ° C에서 15 초 동안 프라이밍 한 다음 72 ° C에서 4 분간 길게 늘어서 35 사이클 .
  7. 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 겔 정화 키트를 사용하여 특정 무딘 PCR 제품을 젤 - 정화.
  8. T4 DNA ligase 1 μL와 특정 10X 버퍼 1 μL를 사용하여 등량의 정제 pCMV-SC_Mermaid (1.5 단계)와 pHuC DNA (1.7 단계)를 10 μL의 총 부피로 채 웁니다. 16 시간 동안 반응을 항온 처리한다.4 ° C.
  9. competative 세포의 나누어지는을 제조 업체의 지침에 따라 연결 반응 (1.8 단계) 5 μL로 변환합니다.
  10. 염 I - Eco RV 이중 소화에 의해 적절한 방향으로 삽입 된 프로모터와 함께 pHuC 양성 클론 (pHuC_Mermaid)을 선택하십시오 ( SalI 제한 사이트는 단계 1.6에서 프로모터 단편의 상류에 삽입되었으며, Eco RV 제한 사이트 pCMV-SC 플라스미드의 폴리 아데 닐화 영역, 폴리 A의 하류에 위치한다).
    1. 다음과 같이 제한 반응을 설정하십시오 : Sal I 및 Eco RV 제한 효소 0.5 μL (10 U), kit10X 완충액 2 μL 및 20 μL의 총 부피의 pHuC_Mermaid DNA 1 μg. 반응을 37 ° C에서 1 시간 동안 항온 처리한다. Agarose 젤에 반응을 실행합니다.

2. 배아 마이크로 인젝션

  1. 수정 된 예야생형 (AB strain) 또는 Sod1-G93R 성인 zebrafish 4 에서 얻은 gs를 플라스틱 피펫을 사용하여 10mm 배양 접시에 옮긴다.
  2. 차가운 (4 ° C) 생선 물에서 배아를 헹구고 microinjector (microinjection 절차에 대한 전반적인 설명과 자세한 설명은 참고 문헌 7과 8 참조)를 사용하여 pHuC_Mermaid plasmid 200 pg으로 즉시 노른자에 마이크로 인젝션하십시오.
  3. 플라스틱 피펫을 사용하여 배아를 페트리 접시에 옮기고 다음 분석을 위해 원하는 발달 단계 (20-24 시간의 수정 후, hpf)에 도달 할 때까지 28 일 생선 물에서 배양하십시오.

3. 자연 테일 코일 링 분석

참고 : 20-24 hpf 배아에서 약물 릴 루졸 (riluzole)의 유무에 관계없이 자발적 꼬리 감기 거동을 평가하십시오.

  1. 0.2 % DMSO (riluzole 차량)가 들어있는 생선 물로 채워진 90mm 둥근 배양 접시에 배아를 옮기고 수동으로 tw를 사용하여 탈피하십시오날카로운 팁을 가진 보석상의 집게. 5 분 동안 배아를 품어.
  2. 실체 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용하여 1 분간 비디오 녹화를하는 동안 RT에서 테일 코일 링을 감지합니다. 30 프레임 / s의 시간 해상도로 시간 시리즈를 획득하십시오.
  3. 시간 단위 당 구부리기 횟수 (대 측성 및 동측 모두)를 계산하여 자발 꼬리 감기 횟수를 계산합니다.
  4. 약물 riluzole의 효과를 평가하기 위해 부드럽게 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 5 μm의 riluzole을 포함하는 생선 물로 채워진 새로운 90 mm 페트리 접시에 배아를 전송합니다.
    1. 1 분 비디오를 녹음하고 위와 같은 행동 분석을 수행하기 전에 5 분 동안 배아를 품어.

4. 살아있는 태아의 머메이드 바이오 센서 시각화를위한 이미징 설정 : 기증자와 억 셉터 신호의 동시 검출

  1. 생선 물에서 1 % 저 융점 아가로 오스에 20-24 hpf 태아를 장착하십시오.35mm 유리 바닥 이미징 접시 안에 37 ° C. 그들의 측면에 배아를 동양. 아가로 오스가 실온에서 응고 될 때까지 기다리십시오.
  2. 거꾸로 된 현미경에 거꾸로 공 촛점의 무대로 이미징 접시를 전송합니다. 488 nm 아르곤 레이저 라인으로 mUKG를 자극하고 495와 525 nm 사이에서 방출을 기록함으로써 20X 대물 렌즈 (0.7 개구 수, NA)로 바이오 센서를 표현하는 모터 뉴런을 확인하십시오.
  3. FRET 측정을 위해 FRET 쌍의 기증자 인 mUKG에 488 nm 레이저 라인을 자극하십시오. 양방향 모드에서 8,000 Hz에서 작동하는 공진 스캐너를 사용하여 도너 (495와 525 nm 사이)에서 방출 된 형광과 mKOk 수용기 (550과 650 nm 사이, FRET 채널)가 방출 한 형광을 동시에 감지합니다. 가능한 경우 473 nm 레이저를 사용하십시오.
    참고 : 도너의 여기 효율은 약간 감소 할 것이지만 (488 nm에서 93 % 대신 85 %), 억 셉터의 교차 여기는(473 nm 레이저 라인에서 488 nm에서 17 %에서 9 %로) 줄일 수 있습니다.
  4. 광 독성과 형광체 표백을 줄이려면 (수집 소프트웨어의 빔 경로 창 에서) 레이저 라인의 전력을 줄여 샘플 조명을 최소화하십시오.
  5. 실험 초기에 설정되고 세션 전체에서 일정하게 유지되는 게인 및 오프셋 매개 변수와 일치하도록 여기를 최적화합니다. 오프셋을 설정하려면 이미지의 색상을 (Q 검색 테이블을 사용하여) 강도 값으로 변경하고 레이저가 꺼진 상태에서 스캔하는 동안 배경 픽셀이 약간의 강도를 갖도록 오프셋 손잡이 (스마트 오프셋)를 돌립니다. 0보다 높습니다. 동일한 룩업 테이블에서 스캐닝 중에 레이저를 켜서 게인 노브 (스마트 게인)를 돌리면 신호 대 잡음비가 최대가되도록하고 포화 된 픽셀은 피하십시오.
  6. 개방 된 핀홀 (2 개의 통풍 장치)을 사용하여 16 비트 이미지를 수집하여 quantitativ에 충분한 동적 범위를 제공합니다.전자 분석. 획득 속도를 높이고 photobleaching을 최소화하기 위해 평균을 피하십시오.
  7. 소프트웨어 수집 창에서 드롭 다운 메뉴에서 512 x 64 픽셀 (픽셀 크기 : 605 nm)의 이미지 필드 크기를 선택하십시오.
  8. 획득 모드 창에서 드롭 다운 메뉴에서 xyt (단일 xy 평면의 시간 경과)를 선택하고 단일 xy 평면을 획득하고 매 30 초마다 하나의 이미지를 기록하도록 획득 매개 변수를 설정하여 배아 척수 신경 전압의 변화를 기록하십시오 1 분.
  9. 동일한 뉴런에서 막 탈분극에 riluzole 투여의 효과를 평가하기 위해, 5 μm의 riluzole을 포함하는 생선 물의 추가 5 분 후에 새로운 데이터 세트를 습득.
  10. FRET 분석을 위해서는 ImageJ 매크로 Biosensor_FRET (단일 사슬 FRET 바이오 센서를 표현)을 사용하십시오.
  11. ((FRET 평균 - FRET 배경) / (공여자 평균 - 공여자 배경)과 같은 t 1 에서 각 뉴런의 기초 막 FRET 비율을 평가하고, 여기서 FRET 및 Don또는 평균 강도는 획득 된 각 채널에 대해 세포 주위에 그려진 동일한 관심 영역 (ROI)에서 계산 된 평균 형광 강도이고, 도너 배경은 형광 샘플없이 시야의 ROI에서 계산 된 평균 형광 강도이다.
    참고 : 플러그인 사용에 대한 자세한 단계별 설명은 www.medc.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다.
  12. 그래프 화 소프트웨어를 사용하여 다른 실험 패러다임 간의 주파수, 진폭 및 탈분극 지속 시간을 비교하십시오. unpaired Student 's t -test를 사용하여 두 그룹을 비교하고 P <0.05 일 때 평균값을 통계적으로 다른 것으로 간주하십시오.

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결과

배타적으로 단백질의 합성을 촉진하는 pHuC pan-neuronal promoter의 제어하에 FRET 기반의 Mermaid 바이오 센서 코딩 서열을 지닌 발현 벡터를 마이크로 인젝션에 의해 단일 세포 수정란에 전달 하였다. 일과성 트랜스 제닉 배아를 얻기 위해서 ( 그림 1 , 왼쪽 패널). microinjection 기법을 마스터 링 후, 인어 양성 배아의 백분율은 100 %에 가깝습니다. 이 중에서도 원형 막에 적절한 양의 인어 바이오 센서를 표현하는 배아 만 FRET 분석 / 이미지 획득을 고려했습니다.

자발적인 코일 감기, 꼬리의 끝을 머리 9 , 10에 가져 오는 전신 수축만으로 이...

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토론

이 프로토콜은 제브라 피쉬 배아 척수 운동 신경 세포의 전기적 특성과 자발적인 감기 행동, 초기 배아 발달의 17 hpf 주위에 나타나며 24 hpf까지 지속되는 초기 스테로이드 운동 활성 사이의 연관성을 탐색 할 수있었습니다.

우리의 접근 방식은 개발 기능 네트워크에서 세포 간의 상호 작용의 복잡성을 완전히 보존하면서 손상되지 않은 태아의 신경계를 연구하는 도구를 연구원들에게 제공합니다. 제브라 피쉬 배아의 생체 내 이미징은 저 융점 아가로 오스에 담그기 만하면 움직일 수 있습니다. 바이오 센서의 사용을 통한 세포막 전위의 변화에 ​​대한 연구는이 방법의 주요 이점 중 하나입니다. 신경 조직이 외피 조직을 제거함으로써 물리적으로 접근되어야하는 정규 전기 생리 학적 접근법은 절차 적이다검사중인 세포의 전기적 특성을 변화시킬 수 있습니다. 또한, FRET 기반 바이오 센서 접근법은 마취제 ( 즉, 나트륨 채널 차단제 Tricaine)를 사용하지 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 FRET 이미징 분석에 대한 귀중한 지원에 대해 Simona Rodighiero에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
낮은 융점 아가로스 시그마-알드리치A9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzoleSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ DNA 중합효소 Agilent Technologies - Stratagene 제품 부문600389
T3 Universal 프라이머 Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up 시스템PromegaA9280
Universal SmaI primer Eurofins
StrataClone 포유류 발현 벡터 시스템 / pCMV-SC 무딘 벡터 Agilent Technologies - Stratagene 제품 사업부 
스마이 New England BiolabsR0141S
T4 DNA ligasePromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 mm, 유리 바닥 이미징 접시 Ibidi81151
펜치Sigma-AldrichF6521
실체현미경Leica MicrosystemsM10 F
디지털 카메라Leica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 소프트웨어 Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4Apple
Confocal microscope (inverted)Leica MicrosystemsTCS SP5
Microinjector 에펜도르프 Femtojet
ImageJ 매크로 Biosensor_FRET 
그래프패드 프리즘 6.0c GraphPad 소프트웨어, Inc
240228

참고문헌

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
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  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
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  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).

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