침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.
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방법 논문
Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정
이 논문에서
요약
초록
대 식세포는 면역 체계의 본능적 인 팔에서 유래 한 전문적인 식균입니다. 정상 상태에서, 정착 성 대 식세포는 성인 조직에서 발견되며, 감염 및 조직 손상의 전조선 파수꾼으로 작용합니다. 다른 면역 세포가 골수에 위치한 조혈 모 및 전구 세포 (HSPC)로부터 지속적으로 재생되는 동안, 상주 대 식세포로 알려진 대 식세포의 혈통은 골수 HSPC로부터의 입력없이 조직 내에서 자체 유지되는 것으로 나타났다. 이 혈통은 뇌에있는 미 글로리아 (microglia), 간에서의 쿠퍼 (Kupffer) 세포 및 표피에서의 랑게르한스 (Hangerhans) 세포에 의해 예시된다. 장 및 결장 고유 층은 HSPC- 독립적 인 상주 대 식세포가없는 유일한 성인 조직이다. 최근의 연구에 따르면 상주 대 식세포는 태아 조혈 모세포 (HSC)와는 별개로 존재하는 전구 세포로부터의 난황낭 조혈 (extra-embryonic yolk sac hematopoiesis)에 기원한다. 난황낭 중 명확한 조혈, eRYthromyeloid progenitors (EMP)는 적혈구 및 골수 양 세포, 특히 상주 대 식세포를 일으킨다. EMP는 난황낭 내에서만 E8.5와 E10.5 일 사이에 발생하며 순환이 연결되면 일찍 태아 간으로 이동하여 적어도 E16.5까지 팽창하고 분화한다. 이들의 자손에는 적혈구, 대 식세포, 호중구 및 비만 세포가 포함되지만 EMP에서 유도 된 대 식세포 만 조직에서 성충까지 지속됩니다. EMP 출현의 일시적인 성격과 HSC 세대와의 일시적인 중첩은 이러한 선조의 분석을 어렵게 만든다. 우리는 유세포 분석기 로 생체 내에서 EMP 및 EMP 유래 세포를 특성화하기 위해 대 식세포 사이토 카인 수용체 Csf1r 프로모터의 발현에 기초한 타목시펜 유도 성 운명 매핑 프로토콜을 확립했다.
서론
개발 중에는 골수 계통의 자손이 성인으로 남아있는 여러 가지 연속적인 조혈 전구 세포가 있습니다. 첫째, 단 독성 "원시"전구 세포는 E7.5-E8.25 사이의 마우스 난황낭 1 , 2 에서 출현하고 단핵구 중간체가없는 배아 대 식세포를 일으킨다. 원시 전구 세포로부터 유래 된 대 식세포가 성숙한 뇌에서 미 글로글 리아 (microglia)로 지속되는지는 적극적인 조사 대상으로 남아 있는지 여부. 둘째로, Erythro-myeloid Precursors (EMPs)는 E8.5에서 난황낭에서 발생하고, 혈류에 들어가서 배아를 식민시킨다. EMPs는 Runx1 의존 내피 - 조혈 전이 3 , 4 에서 난황낭 hemogenic endothelium에서 나온다. EMP는 난황낭 내에서 대 식세포로 분화 할 수 있지만 태아 간세포 (E) 9 5 에서 태아 간을 식민지화하고 differen적혈구, 거핵구, 대 식세포, 단구 과립구 및 비만 세포 6 . EMP로부터 유도 된 대 식세포는 발달 및 성인 조직에서 ....
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프로토콜
동물 시험은 파스퇴르 연구소 (Institut Pasteur)의 승인 된 기관 동물 보호 및 사용위원회 (CETEA)에 따라 수행되었습니다.
1. Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP 태아의 Utero Pulse Labeling
- 4- 하이드 록시 타목시펜 (OH-TAM, 50 mg / mL)의 원액을 준비하십시오.
- 기화기 아래에서 25 mg 바이알의 OH-TAM을 열고 250 μL 에탄올 (100 %)을 첨가하십시오.
- OH - TAM 솔루션을 10 분 최대 속도로 잘린 팁과 소용돌이와 2 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송하십시오.
- sonication 욕조에서 30 분 Sonicate.
- fumehood에서 PEG-35 피마자 기름 250 μL를 첨가하여 50 mg / mL 저장 용액을 얻는다.
주 : PEG-35 피마 자유는 소수성 분자를 결합하고 수용성 용매에 용해시키는 양친 매성 성질을 가진 용매이다. - 약 5 분 동안 와동최대 속도로 초음파 ....
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결과
유전 적 운명 매핑은 Rosa26-LSL-eYFP 리포터를 수컷과 교배 한 Csf1r-Mer-iCre-Mer 암컷으로 OH-TAM의 E8.5 투여에 의해 달성되었다. OH-TAM의 존재 하에서, 정지 카세트의 절제는 Csf1r을 발현하는 세포에서 YFP의 영구 발현을 유도한다 . 우리는 두 개의 조혈 조직, 즉 난황낭과 태아 간, 그리고 E10.5의 태아에서 조혈 모세포 이외의 조혈 조직, 즉 신경 외배엽을 채취했다. 단일 세포 현탁액은 효소 적 및 기계적 해리에 의해 얻어졌으며 샘플은 형광 결합 항체로 염색 한 후 유세포 분석에 의해 분석되었다. 죽은 세포와 이중 덩어리를 배제한 후, 단일 세포 현탁액을 분석했다 ( 그림 1 ). 모든 게이트는 Fluorescence Minus One (FMO) 컨트롤을 사용하여 정의되었습니다. 분석의 명확성을 향상시키기 위해 적혈구 배제 (Ter119 +
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토론
조혈 전구 세포의 다른 파동은 짧은 시간 내에 부분적으로 겹쳐서 발달 조혈의 각 파가 면역 세포에 기여하는 것을 기술적으로 매우 도전적으로 분석합니다.
Tamoxifen-inducible Cre 시스템은 ex vivo 또는 in vitro 배양이나 이식을하지 않아도 일시적으로 유도 가능한 방식으로 특정 세포에 태그를 지정하고 배아 또는 성인에서 계통 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다. 타목시펜 - 유도 성 Cre 균주에서 박테리아 Cre 재조합 효소와 인간 에스트로겐 수용체 (CRE-ER)의 리간드 결합 도메인의 돌연변이 형태 사이에 또는 개선 된 단일 점 돌연변이 Cre와 2 개의 마우스 에스트로겐 수용체 사이에 융합 유전자가 생성된다 (Mer-iCre-Mer). Cre의 에스트로겐 수용체와의 융합은 Hsp90에 의한 Cre의 세포질 분리를 유도하여 핵 Cre- 매개 재조합을 방지한다. 타목시펜 (TAM)은 the- 간을 4- 하이드 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 Frederic Geissmann 교수와 Christian Schulz 교수에게 통찰력있는 토론에 감사드립니다. Hannah Garner 박사는 Xavier Montagutelli 박사와 Jean Jaubert 박사와 파스퇴르 인스 트루먼 트의 동물 병원 직원을 대상으로 비료를 읽었습니다. Amgen Scholar의 Pascal Dardenne과 Vytaute Boreikaite는 기술 지원을 담당했습니다. EGP 연구소의 연구는 파스 티르 인스티튜트 (Institut Pasteur), CNRS, Cercle FSER (FRM, Institut Pasteur 및 REVIVE 컨소시엄의 시작 패키지)에서 지원됩니다 .LI는 REVIVE 컨소시엄의 PhD 펠로우쉽에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #5 직선 펜치 | 파인 사이언스 도구 | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff 스프링 가위 | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5cm 스트레이트 가위 | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE(클론 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | FACs Buffer에서 1/200 희석 |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7(클론 104) | Sony | 1149120 | FACs Buffer에서 1/100 희석 |
| Anti-Mouse AA4.1-APC(CD93, 클론 AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | FACs Buffer의 1/100 희석 |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 희석 |
| Pharmingen | 123137 | FACs Buffer의 1/100 희석 | |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | FACs Buffer |
| 의 1/200 희석안티-마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록, 클론 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6웰 조직 배양 플레이트 | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12웰 조직 배양 플레이트 | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24웰 조직 배양 플레이트 | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96웰 U자형 바닥 조직 배양 플레이트 플레이트 | Dutscher Dominique | 353227 | |
| 주사기 Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| 나일론 그리드 100 &마이크로; m 세포 여과기 | Dutscher Dominique | 352360 | |
| 나일론 그리드 70 &마이크로; m 세포 여과기 | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml 팔콘 튜브 | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore 여과 키트, 0.2 μ m | Dutscher Dominique | 51246 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | 시그마 | H7904-25MG | 타목시펜 및 그 유도체를 준비하고 작업할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오 |
| 프로게스테론 | Sigma | P3972 | 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오 |
| PEG-35 캐스터 오일 (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| 해바라기 오일 | Sigma | S5007-250ML | |
| 에탄올 | Sigma | 24103-1L-R-D | 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 연기 아래에서 사용하십시오. |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (물 속 1 MG/ML) | 피셔 사이언티픽 | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 플로우 사이토미터 | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX 일일 QC 형광구 | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp 항체 캡처 비드 키트 (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | 잭슨 연구소 | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | 잭슨 연구소 | 6148 |
참고문헌
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embr....
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