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방법 논문

보온재 가닥 DNA 합성의 속도론

7.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55312

⸱

2017년 2월 25일

 , 
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School

이 논문에서

요약

박테리오파지 T7의 복제 단백질을 사용하여 지연 가닥 시작의 동역학을 조사하기 위해 민감한 겔 기반 불연속 분석법을 설명합니다.

초록

여기에서는 박테리오파지 T7의 복제 단백질에 의한 in vitro 지연 가닥 DNA 합성의 동역학 검사를 위한 프로토콜을 제공합니다. T7 리플리솜은 알려진 가장 간단한 복제 시스템 중 하나이며, 단 4개의 단백질로 구성되어 있어 생화학 실험에 매력적인 기능입니다. DNA 폴리메라이제에 의해 DNA 종합을 시작하기 위하여 이용되는 T7 primase-helicase에 의한 ribonucleotide 뇌관의 종합에 특별한 강조는 둡니다. DNA 복제 메커니즘은 진화 전반에 걸쳐 보존되기 때문에 이러한 프로토콜은 다른 모델 시스템을 사용하는 연구자에게 적용 가능하거나 개념적 발판으로 유용해야 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 매우 민감하며 숙련된 연구자는 이러한 실험을 수행하고 약 하루 만에 분석을 위한 데이터를 얻을 수 있습니다. 필요한 유일한 특수 장비는 급랭 급랭 기기이지만 이 장비는 비교적 일반적이며 다양한 상용 소스에서 구할 수 있습니다. 그러나 이러한 분석의 주요 단점은 방사능의 사용과 상대적으로 낮은 처리량입니다.

서론

DNA의 복제는 모든 세포 삶의 보존 기능입니다. 복제 구성 요소의 ID와 수가 매우 다양하지만, 일반적인 메커니즘이 진화 1에서 공유됩니다. 여기에서는 T7 replisome의 구성 요소에 의해 시험관 내에서 지체 가닥 DNA 합성의 속도론을 이해 목표 방사성 기질을 사용하여, 겔 기반 불연속 동역학 실험을 설명한다. 박테리오파지 T7의 복제 장치는 네 단백질합니다 (DNA 중합 효소, GP5, 그 processivity 인자 대장균 오레 독신, 관능 프리 메이스-헬리 케이즈 GP4 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질, GP2 이루어진 매우 간단하다. 5) 2. 이 기능은 DNA 복제에 관여하는 보존 생화학 적 메커니즘을 연구하는 매력적인 모델 시스템을 만든다.

특별한 강조가 T7 DNA에 의해 리보 뉴클레오티드 프라이머의 형성에 배치는 비판적를 프리 메이스DNA 합성의 개시를 L 단계. 또 하나는, 반응 혼합물을 포함하여 T7 DNA 중합 효소 또는 다른 복제 단백질에 의한 이들 프라이머의 사용을 검토 할 수있다. 프리 메이스 T7-헬리 케이즈는 GP4는 프리 메이스 인식 부위 또는 PRS 불리는 특정 DNA 서열의 DNA 합성을위한 프라이머의 형성 (5'-GTC-3 ')를 촉매한다. PRS에서 시토신은 위치의 인식을 위해 필수적이다 애매한 있지만 제품 (3)에 복사되지 않는다. GP4에 의해 프라이머 합성의 첫 번째 단계는 삼량로 확장하고, 결국 기능 tetranucleotide 프라이머로 pppACCC, pppACCA 또는 pppACAC 템플릿 4의 순서에 따라 상기 뉴클레오티드 pppAC의 형성을 포함한다. 이 프라이머는 또한 GP4 보조 공정 (5, 6) 인 DNA 합성을 개시하는 T7 DNA 중합 효소가 사용될 수있다. 이와 관련하여, 프리 메이스도메인은 자신의 해리를 방지 템플릿과 매우 짧은 tetraribonucleotides 안정화 중합 효소 활성 부위 (7)에 프라이머 / 주형 확보에 도움이되는 방식으로 DNA 중합 효소를 결합한다. 이 단계 (RNA 프라이머 합성, 중합 효소에 프라이머 핸드 오프 및 확장)은 지체 가닥을 복제하기 위해 여러 사이클을 반복하고 선도 가닥의 복제를 조정해야합니다.

여기에 설명 된 분석은 매우 민감하고 적당한 시간 내에 수행 될 수있다. 그러나, 그들이 상대적으로 낮은 처리량과 큰 관심은 방사성 물질의 사용 및 폐기에 행사해야합니다. 반응 진행은, 하나의 정상 또는 미리 정상 상태 중 하나의 반응 시간 과정의 의미 분석 의무 시간 스케일에서 샘플을 얻기 위해 신속한 급랭기구를 채용 할 수있는 속도에 따라. 최근에, 우리는 분석은 evidenc를 제공하기 위해 여기에 설명 된 사용오카자키 조각의 시작에 GP4의 프리 메이스 도메인의 프라이머 출시의 중요성 전자. 또한, 우리는 효율적인 프라이머 형성 및 활용 (8)을 촉진, 단백질, gp2.5 바인딩 T7 단일 가닥 DNA에 대한 규제 역할의 증거를 발견했다.

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프로토콜

참고 : 포함되지만, 장갑, 보호 안경, 실험실 코트, 적절한 아크릴 방패로, 제한 개인 보호 장비의 사용하지 않는 방사성 물질의 안전한 사용 및 폐기에 관한 모든 기관의 규정을 따릅니다.

참고 : 표준 버퍼가 40 mM의 HEPES-KOH, pH를 7.5, 50 MM의 칼륨 글루타메이트, 5 mM의 DTT, 0.1 mM의 EDTA (현재의 버퍼가 5 배 농도에서 미리 제조) 각각의 dNTP 0.3 밀리미터로 구성되어 있습니다. T7 복제 단백질 10, 9, 8 바와 같이 정제된다. 단일 T7 프리 메이스 인식 부위 (5'-GGGTC-3 ', 5'- GTGTC-3', 5'- TGGTC-3 ')를 함유하는 단일 가닥 DNA는 DNA 합성 다양한 회사 (길이에서 살 수 ssDNA를가 T7의 프리 메이스 위해 선택한 효소에 의존하는 량체는 전체 길이의 프라이머를 합성 최소 템플릿 길이 1애매한 C가 필수적으로, 프라이머는 폴리머 라제에 의해 확장 될 경우 (1)는, 그러나, 부가적인 뉴클레오티드는 템플릿의 3 '말단에 존재한다. 반응은 10 밀리미터의 MgCl 2의 최종 농도로 첨가하여 개시하고, 25 ℃에서 배양된다. 수동 샘플링은 5 초 이상의 시간이 점을 잘 작동합니다. 보다 짧은 시간 포인트가 필요한 경우, 정확하게 데이터를 획득하기 위해 급속 급랭 흐름 수단을 사용할 것을 권장한다.

수동 샘플링 1. 다중 매출 프라이머 합성 반응

  1. 실험을 시작하기 전에, 포름 아미드 염료 버퍼의 나누어지는 2 μL (93 % (v / v)의 포름 아미드, 50 mM의 EDTA, 0.01 %의 크실렌 cyanol과 파란색 0.01 % 브로 모 페놀) 8 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에. 일반적으로, 튜브의 수는 분석 시간 점의 수와 동일하다.
  2. , 1X 버퍼, 0.1 mM의 ATP 및 CTP 0.25 mCi의 / ㎖ [α- 32 P] CTP 이루어진 20 μL 혼합물을 제조 0.1 μM SSD(헥사 농도로 표현 - 0.6 μM 모노머) NA 템플릿, 0.1 μM GP4.
  3. 5 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션.
  4. 피펫을 사용하여 혼합물의 2 μL를 제거하고 아무 반응 제어 (시간 제로)에 대한 단계 1.1 준비 1.5 ML의 튜브에 2 μL 포름 아미드 염료 버퍼와 혼합.
  5. (10 mM의 최종 농도), 반응 혼합물을 0.1 M의 MgCl 2 2 μL를 추가한다.
  6. 수동으로 10 초 간격으로 피펫을 이용하여 상기 반응 혼합물을 2 μL 샘플을 인출하고, 단계 1.1의 제조 1.5 ㎖의 튜브에 미리 분배 포름 염료와 혼합한다.
  7. 열 블록에서 5 분 동안 95 ℃에서 가열 된 샘플.
  8. 변성 겔에 샘플의 분취 량을로드합니다. 비스 아크릴 아미드 다음 T7의 프리 메이스 합성 작은 tetraribonucleotide 프라이머 제품은 0.4 mm에서 잘 두께의 25 % 아크릴 아미드 해결 (19 : 1), 3 M 우레아, 1X TBE (100 mM 트리스 - 보레이트, 1 mM의 EDTA).
  9. chromatogra에 전체 젤 배치플라스틱 랩과 PHY 종이 커버. 겔 건조기를 사용하여 건조 겔.
  10. 반응 혼합물의 나머지의 희석 계열을 조제하고 크로마토 그래피 용지에 겔에 로딩 동일한 볼륨 자리, 즉 시료 4 μL 넣고, 경우 희석 4 μL 자리.
    주 :이 반응 동안 형성된 생성물의 농도를 결정하는 표준 곡선이 될 것이다. 예를 들면, TE 완충액 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA)의 범위에 걸쳐 잘 작동하여 5 배 희석하여 1:25으로 : 15,625 (5 2 -5 6)하지만 희석해야 활동 레벨에 따라 조절 될 수있다.
  11. 은 phosphorimager 화면을 사용하여 건조 겔 및 표준을 노출. 12 희석 시리즈의 방사능을 정량화 8 바와 같이 표준 곡선을 만들
    주 : 상기 반응 혼합물을 T7 DNA 폴리머 라제 포함될 하나 EXA 받을수내이 효소에 의해 tetraribonucleotide 프라이머의 사용. 최적의 폴리머 농도는, 상기 데이터의 해석을 단순화하도록 포화되어야한다. 0.4 μM 이상의 폴리머 농도는 양호한 결과를 준다. 또한, 이러한 프라이머를 합성 또는 후행 가닥 개시하거나 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 같은 다른 단백질의 효과가이 방식으로 측정 될 수있다.

신속한-급랭 악기를 사용하여 2. 다중 매출 프라이머 합성 반응

  1. 반응 혼합물의 제조
    1. 1X 버퍼, 0.2 mM의 ATP와 CTP가 (CTP [32 P α- 0.5 mCi의 / mL를 포함하여 0.2 μM GP4의 헥사, 0.2 μM ssDNA를 템플릿, 0.6 밀리미터의 dNTPs를 포함하는 용액 A의 400 μL를 준비합니다.
    2. 1X 버퍼와 20 밀리미터의 MgCl 2를 포함하는 용액 B의 400 μL를 준비합니다.
  2. 급속 급냉 흐름 장비 운영
    1. 랩을 켭니다ID-급냉 흐름 계측기; 메인 메뉴가 나타납니다 후, 악기 키보드 타입 7은 홈 위치로 주사기 드라이버를 이동합니다.
    2. "LOAD"열기 버퍼 주사기 위치.
  3. 로드 버퍼 주사기
    1. 드라이브 주사기 포트에 10 ML의 주사기 포함하는 버퍼를 연결합니다. "LOAD"에 주사기 손잡이 위치를 변경합니다.
    2. 10 ㎖ 주사기를 사용하여, 10 mM 트리스, pH가 7.5, 1 mM의 EDTA로 구 버퍼 탱크 A와 B를 입력하고 종결 용액 (250 mM의 EDTA, 0.2 % SDS)와 주사기 C 채운다. 과에서 플런저를 눌러 기포를 제거합니다.
    3. "FIRE"로 변경 노브의 위치. 유형 2는 주사기 드라이버 막대의 위치를 ​​조정합니다. 를 눌러 버퍼가 종료 루프 나올 때까지 주사기를 낮추는 버튼을 "DOWN 조정"(계속 아래로 7-간다 8-큰 스텝 다운 9 - 작은 단계 아래로). 주 메뉴로 돌아갑니다 "ESC"를 입력합니다.
  4. 세척 튜브
    1. AT & T는진공에 ACH 출구 라인. 샘플 노브를 "FLUSH"로 변경. 수평 위치 노브를 설정 닫기 버퍼 주사기입니다. 진공의 전원을 켜고 10 초 동안 H 2 O의 2 플러시 루프를 찍어, 다음 10 초 동안 메탄올에 찍어. ~ 15 초 동안 공기를 흡입하여 건조 루프, 또는 건조까지.
  5. 로드 샘플
    1. "LOAD"로 변경 샘플 손잡이 위치. 1 ML의 주사기에 용액 A를 놓습니다. 샘플로드 포트 중 하나에 연결 주사기. 용액 B 반복, 반대 샘플로드 포트에 넣습니다.
  6. 시간 점의 컬렉션
    1. 메인 메뉴에서 급냉 흐름 실행에 대해 1을 입력합니다. 반응 시간 (들)를 입력하고 Enter 키를 누릅니다 "ENTER". 반응 루프 번호가 표시됩니다 사용할 수 있습니다. 필요한 반응 루프로 전환합니다. 단계 2.2.4에서 반복 세척 절차.
    2. 샘플 노브에 "LOAD"를 켭니다. 로드 반응은 중앙 혼합 구획 외부까지 샘플 루프에 혼합합니다. 모든 노브를 돌려을 "FIRE는 ". 모든 노브가 올바른 위치에 있는지 확인합니다.
    3. 출구 루프의 끝 부분에 1.5 mL의 튜브를 놓습니다. 눌러 반응을 실행하는 "GO". 단계 2.2.4에서 반복 세척 절차. 그들이 드라이버를 칠 때까지 버퍼 주사기 A와 B를 다시로드합니다.
    4. 원하는 각 시점에 대한 단계를 반복 2.2.6.2-2.2.6.3. 예외 : 시작 시약 제로 시간 포인트 컨트롤을 담금질 (즉,이 경우의 MgCl 2) 함유 용액을 넣지 마십시오.
    5. 샘플을 수집이 완료되면 주 메뉴로 돌아갑니다 "ESC"를 입력합니다. 보도는 "7"홈 위치로 버퍼 주사기 드라이버를 돌아갑니다.
  7. 악기 청소
    1. 반응 혼합물을 주사기를 제거합니다. 샘플 로딩 노브에 "LOAD"위치로 돌립니다. 진공에서 10 mL의 0.3 NH 3 PO 4, 10 mL의 메탄올 다음 10 mL의 0.2 N NaOH로 각 샘플 루프를 씻는다.
    2. 에 "LOAD"위치 주사기의 손잡이를 돌립니다. 3 SYR 아래로 눌러인게 플런저는 반응 급랭 버퍼를 검색 할 수 있습니다. 워시는 두 배 이상 5 ㎖ H 2 O와 주사기.
    3. 5 ㎖ H 2 O 다시 주사기를 입력하고이 "FIRE"위치 노브를 돌립니다. 손잡이 위치를 변경하고 단계 2.2.4에서와 같이 세척 H 2 O를 제거하기 위해 진공을 켭니다. 기기의 전원을 끄십시오.
      참고 : 단계 1.7-1.12에 설명 된대로 제품을 분석하고 있습니다. 또한, T7 DNA 폴리머 라제 및 다른 복제 단백질 프라이머 합성 또는 신장에 미치는 영향을 분석하기 위해 반응 혼합물에 첨가 할 수있다.

3. 단일 매출 프라이머 합성 반응

참고 : 단일 매출 프라이머 합성 / 확장 분석은 몇 가지 중요한 차이, 다중 회전율 반응과 동일한 방법으로 실시됩니다 이러한 분석은 기판 그러나 농도, 프라이머 또는 확장 제품에 방사성 표지 된 ATP의 전환을 따라 단백질 considera 있습니다BLY 높은. 또한, 프라이머의 합성 반응의 분석을 허용 밀리 초 분해능을 달성하기 위하여, 하나는 급속 급랭 유동 시스템을 활용한다.

  1. 반응 혼합물의 제조.
    1. 1X 버퍼, 3 μM GP4 헥사, 6 μM ssDNA를 템플릿, 0.6 밀리미터의 dNTPs, 1 mM의 CTP, 2 nM의 [P (32) γ-] ATP를 포함하는 용액 A의 400 μL를 준비합니다. 1X 버퍼와 20 밀리미터의 MgCl 2를 포함하는 용액 B의 400 μL를 준비합니다.
  2. 빠른-급냉 흐름 작업
    1. 단계 2.2에 설명 된대로 반응을 실시한다. 원하는 경우, 각각 15 μM 및 20 μM의 농도에서 T7 DNA 폴리머 라제 T7 또는 단일 가닥 DNA 결합 단백질을 추가한다. 이 경우, 신장 산물은 반응 수동 샘플링을 허용하는 시간 체계에 축적된다.

4. 데이터 분석

  1. 비선형 이내로 할에 맞춤 제품 진행 곡선최소 제곱 할 수있는 맞는 및 / 또는 수치 적분을 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 사각형 모델. 동작의 상세는 사용 된 소프트웨어에 따라 변화하지만, 이하의 데이터를 피팅에 사용되는 식의 일반화 된 형태이다 것이다.
  2. 선형 방정식 곡선을 진행 맞는 여러 매출 프라이머 합성 반응의 생성물 형성의 속도를 결정합니다. 중요한 곡률이있는 경우, 단일 지수 함수에 데이터를 피팅하여 초기 속도에있어서 13, 14을 사용, Y는 (예 - 케이 t) = Y는 제품의 농도이고, A는 반응의 진폭은 K가된다 관찰 된 속도 상수, t는 시간 (초)입니다. 시각 = 0에서의 접선의 기울기의 초기 속도이다.
    참고 : 선형 방정식 또는 이전 정상 상태 버스트 방정식에 맞추기 미리 정상 상태 프라이머 합성 반응은 Y는 (예를 들어 = - 케이 BU를A는 반응 진폭 첫 t) + 속도 SS (t)가, K 버스트는 전 정상 상태 버스트에 대한 관찰 된 속도 상수이며, 속도 SS가 정상 상태 속도 SS = K 고양이 [효소])이며, t는 시간이다 (초)입니다. (- 케이 t 전자) 단일 매출 프라이머 합성 반응은 단일 지수 함수 y를 = A에 곡선을 진행 장착한다. GP4의 경우, 시판되는 소프트웨어를 이용하여, 각 중간 효소와 평형을 이루는 세 NTP 축합 단계와 모델, 수치 적분 (15)에 의해 데이터를 장착한다.

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결과

수동 다중 정점 조건 GP4에 의해 촉진 프라이머 합성 반응을 샘플링, 즉, 프로토콜의 단계 1에 기재된 바와 같이도 1a에 도시 된 결과를 얻었다. 여기서, 전기 영동 후의 제품의 범위 프라이머 합성 반응 (도 1a)의 α 위치에서 32 P로 표지 CTP를 이용하여 관찰 할 수있다. 표지 된 전구체 CTP는 높은 이동도를 나타내고, GP4 합성 느린 이주 디 -, 트리에 대응하는 종과 tetraribonucleotides 이어 겔의 바닥을 향해 이동한다. 배양 기간 및 주형 서열 문맥에 따라, 고급 올리고머 (pentaribonucleotides 등)에 대응하는 추가적인 제품은 라벨을 관찰 할 수있다. 반응 진행 곡선은 제 즉, 테트라있다 (전체 길이의 프라이머 농도를 측정하여 플롯및 pentaribonucleotides) 각...

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토론

이 실험을 수행하는 가장 중요한 요소는 고도로 정제 된 효소 활성의 이용이다. GP4과의 작업 중에, 예를 들어, -20 ℃에서 50 % 글리세롤을 함유하는 완충액에 정제 된 효소의 스토리지 (20 mM의 인산 칼륨, pH가 7.4, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 DTT)을 찾았의 감소를 초래 몇 개월 동안 준비의 특정 활동. 따라서 우리는 이제 정제 된 25 mM 트리스 - 염산, pH를 7.5, 50 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA, 1 mM의 TCEP에 GP4, 10 % 글리세롤의 플래시 동결 작은 분취 액체 질소를 사용하여 -80 ° C에 저장합니다. 특히 처음 몇 개의 샘플을 수집하는 동안, 급속 급랭 유동 장비를 사용하는 동안, 상기 반응물 전에 반응을 시작하여 반응 온도 (상온)에 도달 할 수 있도록하는 것이 중요하다. 또한, 많은주의가 남아 급랭 반응물과 철저히마다 포인트 후의 튜브 (프로토콜의 단계 2.2.4) 청소주의해야라인은 크게 잘못된 결과를 초래 효소 활성을 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

의견을 제시해 주신 C.C.R. 연구실 구성원들께 감사드리며, 그림 준비에 대해 S. Moskowitz에게 감사드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health Grants F32GM101761, A.J.H.) 및 GM54397(C.C.R.)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Tris 사전 설정 결정
pH 7.5		SIGMAT4128
Tris 베이스SIGMA93362
L-글루탐산 칼륨 염 일수화물SIGMAG1501 
염화마그네슘 육수화물Mallinckrodt Chemicals5958-04
1,4-DithiothreitolJ.T. BakerF780-02
나트륨 도데 실 설페이MP Biomedicals811030
(Ethylenedinitrilo) 테트라 아세트산, 디 소듐 염, 이수화물Mallinckrodt Chemicals4931-04
[α - 32 < / sup>P] CTPPerkinElmerBLU508H방사성, 보호 조치 취하기
[γ-32P] ATPPerkinElmerBLU502A방사성, 보호 조치 취함
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP Affymetrix771004개의 dNTP 세트
100 mM ATP 및 CTP진원지RN02825NTP 세트의 일부
ssDNA통합 DNA 기술N/A사용자 정의 시퀀스를 구성합니다 
메탄올 Macron Fine Chemicals3017-08
포름아미드Thermo Scientific17899
브로모페놀 블루SIGMAB8026 
실렌 Xyanol 시그마X4126 
아크릴아미드SIGMAA9099독성
N,N′ -MethylenebisacrylamideSIGMAM7279 유독
UreaBoston BioproductsP-940
Boric acidMallinckrodt Chemicals2549
Rapid Quench-Flow Instrument 킨텍 주식회사RQF-3 
Kintek 익스플로러Kintek Corp.N/A
칼레이다그래프 Synergy 소프트웨어해당 없음
트 는

참고문헌

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  14. Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
  15. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
  16. Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
  17. Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).
  18. Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).

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