여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.
방법 논문
* These authors contributed equally
여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.
간은 전신적인 염증 반응의 조절에 결정적인 역할을한다. 특히 만성 신장 질환, 간은 요독, 산화 스트레스, 내 독소 혈증 및 급성기 반응물의 대량 생산으로 염증성 사이토 카인 순환 감소 간격에 응답하여 반응한다. 염증 및 간세포의 기본 역할 실험 도구 연구는 만성 신장 질환으로 특히 복잡한 설정에서 규제와 간 사이토 카인의 기여 전신 급성 위상 응답 및 연장 염증성 시나리오를 이해하기 중요하다. 생체 내에서 염증의 복잡한 메커니즘을 연구하는 것은 도전 남아 있기 때문에, 리소스를 많이 사용하는 보통 및 형질 전환 동물의 사용을 필요로 차 격리 된 간세포는 간 급성 위상 응답으로 기계적인 통찰력을 얻을 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 이 체외 기술은 적당한 비용을 갖추고 있기 때문에, 높은 재생산성 및 일반적인 기술 지식은 주 절연 간세포 쉽게 스크리닝 방법으로 사용될 수있다. 여기, 우리는 기본 쥐의 간세포를 분리하는 효소 기반의 방법을 설명하고, 우리는 ELISA 및 정량 실시간 PCR을 사용하여 이러한 세포에서 염증 반응의 평가에 대해 설명합니다.
만성 신장 질환 (CKD)는 급성 및 만성 염증 (1)의 상태로 정의 될 수있다. CKD 환자에서 phosphaturic 호르몬 섬유 아세포 성장 인자 23 (FGF23)의 혈중 농도가 점진적 혈청 인산염이 항상성을 유지하기 위해 증가. 증가 된 혈청 FGF23 수준은 독립적으로 혈액 투석 치료 3, 4를 시작하는 환자 중 심혈 관계 이환율과 사망률과 연관되어 있습니다. 또한, 여러 임상 연구 상승 FGF23 수준 및 C 반응성 단백질 (CRP), 인터루킨 6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 α (TNFα) (5), (6)의 혈청 레벨 사이의 강한 상관 관계를 보여 주었다. 또한, 실험 연구에서, 우리는 최근에 FGF23 직접 간세포를 대상으로하고 증가 CRP와 IL-6 페이지에 의한 염증 반응을 일으킬 수 있다는 것을 증명하고있다간 7 roduction. 따라서, FGF23는 CKD에 전신 염증에 기여하는 순환 요인으로 작용할 수 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
모든 동물 프로토콜과 실험 절차는 의학의 마이애미 밀러 학교의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 준비
2. 간 복구
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
조직학
기본 격리 및 배양 된 세포의 대표적인 광학 현미경 이미지는도 1a에 도시되어있다. 면역 조직 화학적 분석은 절연 간세포 높은 알부민 (적색)뿐만 아니라, 섬유 아세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4) (녹색)을 표현할 수 있음을 보여준다. 핵 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) (파란색)로 염색된다. (그림 1B).
정량적 실시간 PCR
주 절연 간세포 FGF23 처리 (25 NG / ㎖) LPS 또는 IL-6, 24 시간 및 CRP 및 IL-6 mRNA.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
마우스에서 차 간세포를 분리하면 염증 반응 생체를 연구하는 빠르고, 저렴하고 신뢰할 수있는 도구입니다. 정확하게 수행하면 결과가 쉽게 발생하고, 신속하고 비용 효율적인 방식으로 재생 될 수있다. 다음 사항을 신중 성공적인 차단을 보장하기 위해 평가되어야한다.
수술 절개와 IVC의 삽관은 전신 마취가 아닌 안락사 후 수행해야합니다. 젊은, 경험이 연구자는 쥐의 복부의 해부학 적 특징을 숙지하고 올바른 삽관을 수행하기 위해 처음에 더 많은 시간이 필요합니다. 기증자 동물이 살아 유지 관류 크게 분리 된 세포의 생존을 증가, 시작할 때까지. 그것은 상당히 고립 된 간세포의 수율을 증가하기 때문에 위에-간 IVC의 결찰이 수행되어야한다. 대안 적으로, 마이크로 수술 클램프는 IVC에 배치 될 수있다.그러나, 개흉술 다음, 동물은 몇 분 내에 사망하게 될 것이다. 따라서 모든 후속 단계는 간 관류 개시까지 충분한 혈액 흐름을 유지하도록 신속하게 수행되어.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
저자는 선언하는 이익의 충돌이 없습니다.
이 작품은 NIH (R01HL128714 CF에) 및 (KS에 F31DK10236101)와 미국 심장 협회 (CF와 AG)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강력한>소모품 | |||
| 세포 여과기 70 μ m 나일론 셀 여과기 | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | Falcon | 352098 | |
| 100 6인치 면 팁 애플리케이터 | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 인슐린 주사기 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| 조직 배양 접시 100 x 20 mm 스타일 | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 관류 펌프 | Gilson | F155007 | |
| 혈구계 키트, Propper | VWR | 48300-474 | |
| 혈구계 커버 안경, Propper | VWR | 48300-470 | |
| 수술용 가위 - 샤프/블런트 | FST | 14001-12 | |
| 아이리스 가위-터프컷 스트레이트 | FST | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 집게 | F.S.T. | 11203-25 | |
| 학생 조직 집게 | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| 이소플루란, USP 250 mL | Piramal 헬스케어 | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | 분석 주사 | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| 간 관류 배지 (1x) | gibco | 17701-038 | |
| 간 소화 배지 (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| 1차 간세포 해동 및 도금 보충제 | Life Technologies | CM3000 | |
| 1차 간세포 유지 보조제 | Life Technologies | CM4000 | |
| 인산염 완충액 식염수(PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| 콜라겐 유형 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue 솔루션 | VWR | 45000-717 |
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청
허가 요청