조류 정액 컬렉션 Cloacal 마사지와 정액에서 DNA의 분리

요약

이 프로토콜 cloacal 마사지를, 조류, 그리고 수정 상업 추출 키트를 사용 하 여 새 정자에서 DNA 추출에서 정액을 수집 하는 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다.

초록

정액의 컬렉션은 다양 한 정자의 품질, 정자 telomere 역학, 그리고 epigenetics 관련 된 연구를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 유용할 수 있습니다. 새 생물학 연구에 널리 사용 되는 과목 이며 반복된 정자 샘플을 포함 하는 연구에 이상적입니다. 그러나, 몇 가지 리소스는 그 수집 및 조류 정액에서 DNA를 추출 하는 방법을 배울 하고자 현재 사용할 수 있습니다. 여기는 cloacal 마사지, 조류 정자를 수집 하기 위한 부드러운, 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다. 비록이 기술은 문학에서 설립, 그것은 사용 가능한 설명에서 배울 어려울 수 있습니다. 우리는 또한 상업적인 추출 키트를 사용 하 여 수정 하는 조류 정액에서 DNA를 추출에 대 한 정보를 제공 합니다. Cloacal 마사지는 생식 상태에서 어떤 중간 소형 남성 조류에 쉽게 사용할 수 있습니다. 컬렉션, 다음 정액 운동 성 분석에 대 한 즉시 사용 하거나 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 DNA 추출에 대 한 동결 될 수 있습니다. 이 추출 프로토콜 조류 정자에 대 한 세련 되었고 여러 passerine 종 (통행 인 domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus및 Turdus migratorius에서에서 수집 된 샘플에서 성공적으로 사용 되었습니다. )와 1 개의 columbid (비둘기 리비아).

서론

새 생물학 연구에서 널리 이용 되 고 정자 수 쉽게 샘플링할 cloacal를 사용 하 여 정자 품질 및 경쟁¹, 정자 telomere 역학², epigenetics³및 유사한 주제를 포함 하는 연구를 위한 이상적인 주제는 마사지. Cloacal 마사지 새^4,,56에서 정액을 모으기를 위한 부드러운, 비-침략 적 수동 기술입니다. 반복된 샘플을 쉽게 얻을 수 있습니다 그리고 특별 한 도구가 필요, 필드 또는 실험실에서 수행 하는 간단 하 합니다. Cloacal 마사지 수십 년 동안 사용 되었습니다, 비록 사용할 수 설명 작성에서 배울 하기가 어렵습니다. 이 게시는 시간과 cloacal 마사지 학습에 관련 된 불확실성을 줄일 것입니다.

Cloacal 마사지를 사용 하 여 새 들에서 수집 하는 정액 운동 성 평가^4,7 또는⁸인공 수정 대 한 즉시 사용 하거나 고급 이미징, DNA 추출 등 다른 용도 대 한 동결 수 있습니다. Passerine 새에서 정액 샘플 작은 하지만 밀도가 포장된 정자를 포함. DNA는 정자⁹의 특수 보호 기능을 극복 하기 위해 수정 편의상 상업 추출 키트를 사용 하 여 추출 됩니다. 추출 후 정자 telomeres 정량¹⁰를 사용 하 여 측정 수 있다.

프로토콜

이 프로토콜은 척추 동물 주제를 포함 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스 다코타 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 정액 passerine 새 cloacal 마사지를 사용 하 여 컬렉션

참고: Cloacal 마사지 재생산으로 활동적인 새만, 효과적인 정액 컬렉션 기법 이지만, 적절 한 조임 상황에서 번 식 시즌 밖에 성공적으로 수행할 수 있습니다. 생식 활동 cloacal 마사지를 사용 하 여 이전 대상 종에 대 한 결정 되어야 합니다. 캡처 시 야생 조류 또는 조류 포로에서 개최에이 기술을 사용할 수 있습니다.

1. (사육 조건)에 남성 새부터 손바닥 (그림 1)를 만지고 그것의 복 부 측으로 지배적인 손을 비 지배적인 손에 bander의 그립 전송 새.
   1. 새의 머리는 손바닥의 측면 가장자리에 가까운 인지 확인 합니다. 가볍게 머리와 몸을 핑 키, 반지, 그리고 가운데 손가락을 사용 하 여 보호 합니다. 이것은 조류의 환기와 꼬리 노출.
   2. 느슨한 또는 가볍게 손바닥을 사용 하 여 절제 된 새의 다리를 둡니다.

그림 1 : Cloacal 마사지에 대 한 그립. 새는 복 부 쪽 손바닥과 머리 핑 키 손가락에 의해 보안 감동 지배적인 손에 가볍게 확보 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 지배적인 검지와 엄지는 cloaca의 우수한 끝의 양쪽에 놓고 가볍게 함께 ( 그림 2) 꼬리 쪽으로 아주 약간의 압력을 적용 하는 동안 손가락을 꼬집어. cloaca cloacal 점 막 (핑크 인테리어) 노출 evert 것입니다.
   참고: 새 하지 않으면 정액, 현재 생산 cloacal 융기 작은 수 고는 cloaca evert 어렵다. 경험, 재생산으로 활성 및 비활성 남성^5,11의 cloacas 사이 분화 하기 쉽습니다.

그림 2 : 손가락 위치와 cloacal 융기. 우수한 끝 (A)을 약간의 압력을 적용 하 여는 cloaca evert. 재생산으로 활동적인 남성 참새목 cloacal 융기는 분명 하 고 회사 (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 비 지배적인 손을 가진 안정 손, 꼬리의 기지의 등 쪽 측에 검지 손가락의 패드를 놓고 나왔으며 cloaca 바로 아래 엄지손가락의 끝을 놓습니다.
   참고: 짧고 부드러운 축소판 cloacal 마사지를 수행 하기 위한 유리한 이며 실수로 부상에서 새를 보호 한다.
4. 아래는 cloaca 머물고, 중간 압력으로 반복적인 움직임에 cranially 깊은 비 지배적인 엄지 이동. 새는 사정 될 때까지 계속 합니다. 개인에 따라이 일반적으로 1, 몇몇 다스 선 사이의 걸립니다.
5. 최대한 빨리 사정 하는 새, microhematocrit 튜브에 정액을 수집 합니다. 여러 ejaculates 얻기 위해 cloacal 마사지를 반복 합니다.
   참고: Passerine 정액은 밝은 갈색 및 일반적으로 다소 두꺼운 견실 함이 있다. cloaca에서 배출 하는 흰색 또는 어두운 물질 정액, 고 정액 샘플을 오염 시킬 수 있습니다. cloaca에 혈액의 작은 금액의 외관에 혼합 또는 정액 일반적으로 마사지 하는 동안 너무 많은 압력에 의해 발생.
6. DNA 추출에 대 한 1 x PBS (pH 7.4)의 20 µ L 가진 microcentrifuge 관에 정액을 놓습니다. 참고: 1 x PBS에 저장 된 정액 인공 수정에 적합 하지 않습니다 하지만 DNA 추출 나중에 사용할 수 있습니다-80 ° c.에 저장 될 때 PBS 실내 온도 될 수 또는 냉장, 있지만 정액 샘플 예금 될 때 액체 상태에 있어야 한다.
   1. 적은 양의 화합물 현미경 (그림 3) 희석된 샘플을 보고 샘플에서 정자의 존재를 확인 합니다.
7. 추출까지-80 ° C에 희석된 정액을 저장 합니다.

2입니다. 새 정액에서 DNA 추출

참고:이 프로토콜 여러 상업 DNA 추출 키트, 테스트 되었습니다 하지만 단지 하나의 DNA 키트¹²와 함께 사용 하면 성공 했습니다. 단계를 수정 키트 프로토콜에서 표시 됩니다 *.

1. 물에서 dithiothreitol (DTT)의 1 분 솔루션을 준비 하 고는 vortex.*를 사용 하 여 혼합
   1. 약 수 DTT 솔루션 사용 직전까지-20 ° C에서 그것을 저장 하 고. 각 샘플 추출에 필요한 1 M DTT solution.*의 10 µ L
2. 20 mM Tris-Cl, pH 8.0;을 포함 하는 버퍼를 준비 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; 그리고 4 %SDS. 각 샘플 추출에 필요한이 buffer.*의 90 µ L
   1. 실 온에서 버퍼를 저장 합니다. 그것은 시 켰 던 경우 dissolve.*에 56 ° C에 따뜻한
3. 포함 하는 로커 또는 65 흔드는 인큐베이터를 예 열 ° C.*
4. 바로 시작 하기 전에 추출, 10 µ L DTT 솔루션 10 샘플을 추출 하는 경우 각 샘플을 추출, 예: 900 µ L 버퍼 플러스 100 µ L DTT 솔루션 단계 2.2에서에서 준비 하는 버퍼의 90 µ L 믹스. 이 혼합물 DTT buffer.* 라는 것입니다.
5. 70 µ L 1 x PBS 전체 희석된 정액 샘플을 추가 하 고는 vortex.*를 사용 하 여 잘 혼합
6. 100 µ L를 추가 DTT 버퍼 및 10 µ L 성분 K 솔루션 샘플을. 20 초간 소용돌이 다음 품 어 따뜻한 인큐베이터에서 1 시간 로커 또는 shaker.*에 대 한
7. 200 µ L 버퍼 알 및 200 µ L 추가 신선한 EtOH (100%)와 20 seconds.*에 대 한 소용돌이
8. 전체 샘플 스핀 열을 전송 하 고 원심 6000 x g. 삭제에서 1 분 컬렉션 튜브.
9. 새로운 튜브에 열을 놓고 500 µ L 준비 버퍼 AW1를 추가 합니다. 6000 x g. 삭제에서 1 분 컬렉션 튜브 원심.
10. 새로운 튜브에 열을 놓고 500 µ L 준비 버퍼 AW2 추가 합니다. 6000 x g.에서 1 분간 원심 분리기는 흐름을 통해 장소와 열 튜브에 다시 삭제 합니다.
11. 원심 20000 x g. 삭제 3 분 컬렉션 튜브 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 열을 놓습니다.
12. 피펫으로 35 AE의 µ L 열 막에 직접 버퍼 및 5 신속성에 대 한 실 온에서 품 어
13. 원심 1 분 14000 x g. 삭제에서 스핀 열 고-80 ° c.에서 추출한 샘플을 저장

결과

Cloacal 마사지 그리고 DNA 추출을 사용 하 여 설명된 프로토콜 여러 passerine 종과 한 columbid (표 1)에서 수행 되었습니다. 정액 샘플 cloacal 마사지에 의해 수집 된에 정자의 존재는 400 배 확대 (그림 3)에서 복합 현미경 희석된 샘플의 작은 금액을 확인 하 여 확인 되었다. 집 참새는 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여에서 수집 하는 정액 샘플에서 DNA를 추출, 젤 전기 이동 법 (세 가지 예제는 그림 4에서 볼 수 있습니다) DNA 사다리와에 8 개의 샘플 실행 되었습니다. 번짐 없이 독특한 밴드 고품질 DNA의 성공적인 분리를 나타내는 샘플 레인의 모든 8에서 볼 수 있었다. 이 프로토콜을 사용 하 여 추출 하는 다른 모든 샘플 (참조 표 1) 분 광 광도 계...

토론

재생산으로 활성 상태에 있는 중소 조류에서 정액을 수집 하 고 조류 정액에서 DNA를 추출 하는 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.

설명된 정액 DNA 추출 프로토콜 편의상 키트에서 수정 했지만 조류 정액에서 사용 하기 위해 정제 된. 정자는 표준 추출 화학 물질^9,13, 세포 및 passerines에서 수집 된 정액 샘플은 매우 작은 (일반적으로 몇 가지 microliters). 이러한 요소 및 65 ° c.에 잠복기 DTT의 적절 한 농도 사용 하 여 성공적으로 극복 과제 제시 이 방법을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 고립 된 정자 telomere 길이 (일반적으로 사이 40-250 ng / µ L, 사정 볼륨에 따라)의 정량 분석에 대 한 사용 가능한 양의 DNA.

DTT는 이전 페 놀/클로 프롬 반응

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Microhematocrit 모세관	Fisherbrand	22-362566	모든 공급업체를 사용할 수 있습니다. 더 작은 튜브는 치핑 스패로우와 같은 매우 작은 참새류 조류와 같이 작은 정액 샘플을 수집하는 데 더 효과적일 수 있습니다.
마이크로 원심분리기 튜브	Any
1x PBS	Any		DNA 추출 전에 정액 샘플을 보관하는 데 사용됩니다.
DL-Dithiothreitol	시그마-알드리치	D0632
트리스 베이스	시그마-알드리치	10708976001	모든 공급업체를 사용할 수 있습니다.
EDTA	Sigma-Aldrich	1233508	모든 공급업체를 사용할 수 있습니다.
NaCl	시그마-알드리치	793566	모든 공급업체를 사용할 수 있습니다.
SDS	Sigma-Aldrich	1614363	모든 공급업체를 사용할 수 있습니다.
QIAamp DNA 마이크로 키트	Qiagen	56304	Qiagen QIAamp DNA 마이크로 키트를 특별히 권장합니다. 이 DNA 추출 프로토콜은 다른 상용 키트와 함께 시도되었지만 거의 성공하지 못했습니다. 그 이유는 우리에게 알려져 있지 않습니다.