자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

요약

이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.

초록

Mechanosensitive 세포 표면 접착 착물 셀들은 주변의 기계적 특성을 감지 할 수있다. 최근의 연구는 접착 부위에 힘을 감지 분자 및 혈통 특정 유전자 발현을 조절하고 표현형 출력을 구동 힘에 의존하는 전사 인자를 모두 확인했다. 그러나, 생화학 적 경로에 기계적인 긴장을 변환 신호 네트워크는 애매 남아있다. 세포 표면 수용체에 적용된 기계적 장력에 종사하는 신호 전달 경로를 탐색하기 위해, 초상 자성 마이크로 비즈가 사용될 수있다. 여기서 우리는 세포 표면의 접착 단백질의 힘을 적용하는 자성 비드를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면, 리간드 피복 된 비드에 부착 된 접착 단지 자기 분리에 의해서도 힘 따라 다양한 생화학 적 방법에 의해 세포 내 신호 전달 경로, 또한 접착 리모델링을 조사 할 수있다. 이 프로토콜은 리간드 공동의 제조를 포함ated 초상 자성 구슬, 그리고 응용 프로그램이 생화학 적 분석 한 다음 인장 힘을 정의합니다. 또한, 우리는 인테그린 기반의 접착에 적용하는 장력을 보여주는 데이터의 대표 샘플이 부착 리모델링을 유발 단백질 티로신 인산화를 변경 제공합니다.

서론

후생 동물에서 기계적인 긴장은 증식, 분화 및 생존 ^{1, 2} 등 세포 프로세스의 무수의 조절을 통해 조직 개발 및 항상성을 지시합니다. 기계 긴장은 세포 외 기질에서 발생할 수 또는 부착 세포 샘플 세포 외 기질에 끌어과 긴장에 민감한 분자를 통해 강성을 프로브 액토 마이 오신의 수축성 기계를 통해 자신의 세포 외 환경을 생성 할 수 있습니다. 장력에 응답하여, mechanosensitive 접착 단백질은 복잡한 신호 캐스케이드를 트리거 형태 적 변화를 겪는다. 차례로,이 신호 전달 경로는 세포 외 환경에 세포의 행동을 조정 증식, 분화 및 생존을 포괄 mechanoresponse을 조율. 이러한 프로세스는 빠르게 메카의 루프에 다시 공급하는 (초 분) 단기 기간에 정착 될 수있다 mechanosensitive 구조를 수정하여 notransduction. 예를 들어, 인테그린 기반 유착의 Rho는 GTPase 매개 골격 리모델링 ^{3, 4, 5} 내지 장력에 응답하여 강화한다. 병행하여, 다른 신호 전달 경로는 결....

프로토콜

자석 구슬 1. 리간드 활용

주 : 리간드 결합은 2.8 μm의 직경 상자성 토실 활성화 된 비드를 사용하여 수행된다 (원액 농도 10 ⁸ 비드 / ㎖, 30 mg의 비드 / ㎖). 다음 프로토콜은 60mm 조직 배양 접시에서 80 % 컨 플루 언시로 성장 MRC-5 세포에 해당하는 약 2 × ¹⁰⁵ 세포의 샘플들에 기초한다. 따라서 다른 합류점에서 서로 다른 크기 또는 셀의 판을 사용하는 경우 구슬 및 시약의 볼륨을 조정합니다. 셀당 2 비드 있기 위하여 상자성 비드의 양을 사용한다. 따라서, 4 × ¹⁰⁵ 구슬은 60mm 플레이트 필요하다.

1. 철저하게 적어도 30 초를 텍싱하여 원래 유리 병에 구슬을 재현 탁. 1.5 ML의 microcentrifuge 관 (4 × ¹⁰⁶ 비드에 대응하는) 재 부유 상자성 비드의 40 μL 분취.
2. 자기 separati에 튜브를 배치용액으로부터 자성 비드를 분리하기 위하여 스탠드. , 상층 액을 버리고 자기 분리 스탠드에서 튜브를 제거하고 1 mL의 0.1 M 나트륨 인산 산도 7.4의 구슬을 재현 탁.
   1. 1 mL의 0.1 M 나트륨 인산의 pH ....

결과

기술의 개략도는도 1a에 도시되어있다. 리간드 결합 후, 자성 비드를 20 분 동안 세포를 배양 한 후 영구 자석은 시간의 다양한 시간 동안 30-40 PN의 인장력을 적용하기 위해 사용된다. 도 1b는 MRC5 세포 부착 수용체에 결합 2.8 μm의 FN 코팅 된 자성 비드를 나타낸다.

세포 용해 후의 초상 자성 비드의 세정 단계는 매우 중요 및 정제의 정도를 결정한다. 세 세척의 최소 권장합니다. 장시간 노출과 GADPH의 면역 블롯은 접착 단지의 순도 (그림 2a)을 테스트하는 데 유용 할 수 있습니다.

FN 코팅 비드 장력에 응답하여 접착 복합체에서 시간이 지남에 따라 발생하는 mechanotransduction 프로세스를 조사 하였다. 접착 복잡한 분획 자기 분리 한 후, 파쇄물 및 밀착성 복잡한.......

토론

여기에 기재된 방법은 세포 표면 접착 수용체에 장력을 적용하고 그 이후의 정제를 허용하는 간단한 방법을 구성한다. 그러나 일부 단계는 대상 접착 수용체에 따라 효율적으로 접착 정화 및 잠재적 인 최적화를 수행 할 수 있습니다 수행하는 것이 중요하다. 우리는 사용자가 아래에 발생할 수있는 잠재적 인 문제를 제시한다.

우리는 2.8 μm의 직경 자성 비드를 사용하지만, 더 큰 비드는 4.5 μm의 직경을 사용할 수있다. 식균 작용은 30 ~ 60 분 배양시보다 신속하게 발생할 수있는 그 구슬 변위가 자기장 ^{(34), (35)에} 따라 제한 될 수 있도록 더 큰 구슬이 강한 접착력을 가지고 있기 때문에, 구슬의 직경은 2-5 μm의 제한되어야한다. 따라서, 짧은 시간에 배양 시간을 제한하고 적절한 비드 크기를 사용하는 것이 중요하다. 셀당 인큐베이션 비드의 수 (F)의 양에 영향.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
네오디뮴 자석 (60mm 접시의 윗면에 있음)	K& J Magnetics, Inc	DX88-N52	등급 N52 치수: 1 1/2" 직경 x 1/2" 두께
의 네오디뮴 자석(60mm 접시 하단)	K& J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	등급 N42 치수: 1/2" 지름 x 1/4" 두께의 검은 플라스틱 코팅
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	초파라마그네틱 비즈
DynaMag-2 자석	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	소 혈장에서 추출한 Fibronectin
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	소 Apo-Transferrin
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM 고포도당, GlutaMAX 보충제, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15mm 문화 접시	팔콘	353004