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방법 논문

췌장 덕트 주입: 효과적이고 선택적 약물 및 바이러스 성 전달 방법

4.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55332

⸱

2021년 9월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Department of Pediatric Surgery, The 2nd Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

췌장 덕트 주입은 혈통 추적, 유전자 도입 및 세포 주 별 표적을 허용할 수 있는 중요한 기술입니다. 췌장 세포에 대한 약물 및 바이러스 성 전달을위한 췌장 덕트 주입 기술이 여기에 제시됩니다.

초록

췌장은 내분비와 외신 성분을 모두 갖춘 양기능 기관입니다. 많은 병리학은 당뇨병, 췌장염 및 췌장암을 포함하여 췌장을 괴롭히수 있습니다. 이 질병의 세 가지 모두 즉각적인 치료를 개발할뿐만 아니라 병리 생리학을 더 잘 이해하기 위해 연구의 활성 영역을 표시합니다. 이러한 연구 영역을 발전시킬 수 있는 도구는 거의 없습니다. 췌장 덕트 주입은 혈통 추적, 유전자 도입 및 세포 주 별 표적을 허용할 수 있는 중요한 기술입니다. 이 기술은 십이지장과 암풀라의 두 번째 부분의 복잡한 해부를 필요로하며, 담관의 폐색과 췌장 덕트의 캐닝이 뒤따릅니다. 이 기술은 처음에는 기술적으로 도전적이지만 응용 프로그램은 무수합니다. 그룹 간의 절차의 세부 사항에서 모호성은 표준 프로토콜의 필요성을 강조했습니다. 이 작품은 GFP를 표현하는 바이러스 벡터의 췌장 덕트 주입 후 췌장 내의 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 설명합니다. 주입 및 따라서 발현은 다른 조직 유형에 존재하는 발현없이 췌장에 특이적이다.

서론

췌장은 내분비와 외신 성분을 모두 갖춘 양기능 기관입니다. 많은 병리들이 당뇨병, 췌장염 및 췌장암1을포함한 췌장을 괴롭히수 있다. 이 질병의 세 가지 모두 즉각적인 치료를 개발할뿐만 아니라 병리 생리학을 더 잘 이해하기 위해 연구의 활성 영역을 표시합니다.

표적 치료 전달 방법은 도움이 될 것입니다. 우리는 췌장 세포에 약물 및 바이러스 성 전달에 대한 효과적이고 선택적 방법입니다 췌장 덕트 주입 기술을 개발했다. 이 모델에서 췌장 덕트는 선택적으로 캔누레이트되고 일반적인 담관이 가려져 췌장에만 전달될 수 있습니다.

이 기술은 췌장 발달 및병리학에중요한 발달 경로를 더욱 해명하기 위하여 특정 세포 모형의 계보 추적을 허용할 수 있습니다2,3. 바이러스 벡터에서 상이한 프로모터는 세포주및 이들세포주4,5로유전자의 도입을 위해 특정 표적화를 허용한다. 이 작품은 GFP를 표현하는 바이러스 벡터의 췌장 덕트 주입 후 췌장 내의 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 보여 준다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 피츠버그 아동 병원과 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 동물 연구 및 관리 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 적절한 마취 수준으로 코 콘을 통해 흡입 된 이소플루란 (유지 보수1 - 3 %, 유도에 대한 최대 5 %)을 투여하십시오. 집게로 발가락 핀치에 의해 마취의 적절성을 모니터링합니다. 반응의 부족은 적당한 여겨지고, 호흡불경기가 생길 수 있기 때문에, 과다 복용하지 않도록 하십시오.
  2. 목표를 고려하여 복부를 중심으로 해부 현미경 단계에 동물을 배치합니다. 수술 용 테이프로 동물을 고정합니다. 마취 하에 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 연고를 적용합니다.
  3. 매끄럽고 두꺼운 제모 크림층을 바르고 3분 동안 그대로 둡니다. 작은 부위에 제모를 확인하십시오. 크림과 모발을 70% 에탄올에 담근 거즈로 부드럽게 닦아냅니다.
  4. 동물의 복부를 70% 에탄올에 담근 거즈로 닦아내고 베타딘에 흠뻑 젖은 거즈를 제거합니다. 수술 시술 전반에 걸쳐 멸균 상태를 유지합니다.

2. 적절한 노출

  1. 메스를 사용하여 자이포이트 공정에서 배꼽까지 피부에 중간 절개를 합니다. Adson 집게로 회중을 들어 올리고 가위를 사용하여 미드라인에 작은 구멍을 만듭니다.
  2. 피부 절개 길이까지 회중 절개를 확장하여 미드라인(linea alba)에 유지하도록 주의하십시오.
    참고 : 이것은 상부 중간 라인 복강경을 생성합니다.
  3. 일반적인 담관을 드러내기 위하여 무딘 re트랙터로 간을 상승시킵니다. 곡선 불독 혈관 클램프로 일반적인 담관을 고정합니다.
    참고 : 이 기동은 간으로 원치 않는 주입을 방지할 수 있습니다.

3. 췌장 유두와 십이지장 절제술의 식별

  1. 십이지장 확인, 아루가 집게로, 유두를 표시하기 위해 그것을 철회.
    참고: 유두는 십이지덴의 두 번째 부분의 전방 표면에 있는 흰색 반점입니다.
  2. 십이지장을 카를드로 철회하여 췌장 덕트의 과정을 식별할 수 있습니다. 301/2 게이지 바늘로 십이지덴성의 벽을 접선으로 뚫고 유두 바로 맞은편에 있습니다.
    참고 : 바늘은 십이지장으로 들어갈 때 덕트와 동일한 각도를 따라야합니다.

4. 주입.

  1. 카테터가 덕트 내에서 볼 때까지 3.2 단계에서 생성 된 십이지 극을 통해 카테터를 전달합니다. 카테터를 1cm 이하의 덕트에 진출하여 경미한 덕트 지류의 우회를 방지합니다.
  2. 두 번째 곡선 불독 혈관 클램프로 카테터를 제자리에 고정시하십시오. 펌프를 켜고 선택한 볼륨을 주입합니다. 주입된 부피는 25-250 μL, 약 150 μL의 이상적인 부피입니다.
  3. 손실을 상쇄하기 위해 식염수 약 1.5 mL의 복막 내 주입을 관리한다. 탈수를 방지하기 위해 촉촉한 거즈로 노출된 창자를 덮습니다.
  4. 주입이 끝나면 카테터를 제자리에 쥐고 있던 불독 클램프를 제거하십시오. 불독 클램프를 사용하여 췌장 덕트에서 카테터를 부드럽게 제거합니다. 일반적인 담관에서 클램프를 놓습니다.
  5. 실행 봉합사를 사용하여 하나 또는 두 개의 층으로 회막과 피부를 닫습니다.
    참고 : 십이지장 절제술을 닫을 필요가 없습니다.
  6. 수술 후 진통으로, 케토펜의 복용량을 관리 5 시술 동안 mg/kg 다음 날에 하나.
  7. 마우스가 복구될 때까지 열램프 아래 케이지로 돌아갑니다. 마우스에 음식과 물 광고 리비툼을 제공합니다.
  8. 동물을 방치하지 말고, 엄골 의족을 유지하기에 충분한 의식을 되찾을 때까지 방치하지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 받은 동물을 반환하지 마십시오.

5. 샘플 준비

  1. 동물을 이산화탄소 챔버에 놓거나 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
  2. 비장, 간 및 십이지장과 함께 췌장을 수확하십시오. 4 °C에서 하룻밤 파라 포름알데히드에서 조직을 수정합니다. Cryo는 이전에 설명된바와같이 하룻밤 사이에 30% 자당에서 샘플을 보호합니다.
  3. 샘플을 스냅 동결합니다. 마이크로토메를 사용하여 6 μm의 두께로 조직을 섹션. 이전에 설명한7과같이 형광 화상 진찰을 가진 현미경에 화상 진찰을 수행합니다.

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결과

연습과 신중한 수술 기술로, 이 마우스의 생존율은 95% 이상이어야 합니다. 주입 후 1 주일, 원하는 효과는 췌장에서 분명해야한다. 생관10~12주생쥐는 췌장덕 주입을 위해 활용되었다. 여기서 우리는 가짜 수술과 비교하여 녹색 형광성 단백질 (GFP)을 표현하기 위해 CMV 프로모터와 아데노 관련 바이러스 혈청형 8 (AAV8)을 사용합니다. 마우스 췌장은 주입 후 7 일 수확하였다. 췌장, 비장 및 십이지장 의 섹션은 인슐린 항체와 Hoescht로 염색되었습니다. 도 1은 가짜 수술을 받은 것과는 달리 AAV8로 췌장 덕트 주입을 받은 마우스의 췌장 전체에 걸쳐 GFP의 광범위한 발현이 있음을 보여준다. 이 마우스에 있는 간, 비장, 또는 십이지장에서 아무 표현도 없습니다, 따라서 주입의 선택적 본질을 문서화합니다. 이들 데이터는 DNA 및 RNA 발현 프로파일을 포함한 여러 가지 다른 방법으로 확인할 수 있다.<...

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토론

이 작품은 췌장 덕트 주입 뒤에 방법론을 상세히 설명, 췌장에 유전자 및 기타 분자의 전달을위한 효과적인 마우스 모델. 다양한 그룹 간의 절차의 세부 사항에 대한 모호성은 표준화된 프로토콜8,9,10의필요성을강조했다.

젊고 건강한 마우스의 선택으로 시작하는 절차의 몇몇 중요한 단계가 있습니다. 십이지장의 천포, 그러나 작고 통제, 의심 할 여지없이 염증 성 사이토 카인과 완전히 특성화되지 않은 다른 요인의 모집에 이르게 마우스의 외상성 사건이다. 따라서 카테터 도입을 위해 가능한 가장 작은 십이지장 절제술을 만드는 것과 같이 섬세한 해부는 매우 중요합니다. 전체 절차의 가장 중요한 단계는 전달 시스템과 췌장 덕트의 캐닝입니다.

어려움은 췌장 유두의 과도한 중단으로 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 인정이 없습니다. 기금은 절강성 보건 가족 계획위원회 (그랜트 20146242)와 원저우 과학 기술 국 (그랜트 Y20140248)의 재단으로부터 수령되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생쥐 (25 - 30g, 8-12 주령)Jackson Laboratory
KetofenHenry Schein Inc.5487
에탄올(70%)Sigma-Aldrich34923
멸균 식염수Baxter Healthcare Corp.2B-13-00
보호 장비
제모 제품Nair 또는
트리머 거즈 패드 2in x 2inFisher Healthcare22-362-178
바늘(30.5G 및 25G)Becton Dicksinson and Co.305106 및 305122
주사기
펌프Henke Sass Wolf4010.200V0
주입 펌프펌프 시스템 용NE-1000
주입 카테터세계 정밀 기기CMF31G
곡선 불독 클램프 (2)RobozRS-7439
Arruga 집게Roboz RS-5163
Adson 집게RobozRS-5234
바늘 홀더RobozRS-7882
가위RobozRS-5982
코튼 팁 애플리케이터의사 판매 및 서비스22-9988
해부 현미경
봉합오웬스 및 경SXMD1B402
Ketofen 및 Saline Becton Dicksinson and Co.를 위한 309657 주사기사

참고문헌

  1. Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
  2. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
  3. Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
  4. Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
  5. Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
  6. Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
  7. Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
  8. Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
  9. Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
  10. Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
  11. Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
  12. Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).

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