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방법 논문

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55335

⸱

2017년 2월 24일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

이 논문에서

요약

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

초록

내인성 재생 프로그램은 신경 손상과 죽음 다음 (다니오 레 리오) 망막 성인 제브라 피쉬에서 뮐러 아교 세포에 의해 시작된다. 뮐러 아교 세포의 세포주기를 재 입력하고 세포 분열의 다음 라운드를 받아야하고 손실 된 신경 세포 유형으로 분화 신경 전구 세포를 생성합니다. 두 뮐러 아교 세포 및 신경 전구 세포의 핵은 DNA 복제 및 Interkinetic으로 설명한 프로세스의 망막, 즉 그들이 각각 기부 내부 핵 층 (INL) 및 (ONL)에는 외부 핵 층 사이에 이전의 별개의 위치에 유사 분열 핵 마이그레이션 (INM). INM은 주로 개발 망막에서 연구되고있다. 자세히 zebrafish의 망막을 재생 성인의 INM의 역학을 조사하기 위해 형광 표지 뮐러 아교 세포 / 신경 전구 세포의 라이브 세포 이미징이 필요합니다. 여기, 우리는 분리하는 조건 및 문화 지느러미 망막을 제공의 Tg에서 [GFAP : nGFP] 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 노출 된 mi2004의 제브라 피쉬. 우리는 이러한 망막 문화가 지속적으로 GFAP의 철새 동작을 모니터링하는 광자 현미경을 사용하여 최대 8 시간 동안 망막 절편의 두께에 걸쳐 Z - 스택 이미지를 획득, 라이브 세포 이미징 실험을 수행하는 실행 가능한 것을 보여 nGFP 양성 세포를 . 또, 정점 및 기저 INM의 속도를 결정하는 사후 영상 분석을 수행하는 내용을 설명한다. 요약하면, 우리는 신경 재생의 성인 모델에서 INM의 역학을 공부하는 조건을 설립했다. 이것은이 중요한 세포 과정에 대한 우리의 이해를 발전 우리가 INM을 제어하는 ​​메커니즘을 확인 할 수 있습니다.

서론

인간과 달리, 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 전시회 망막 뉴런 1, 2, 3, 4의 세포 사멸시 강력한 재생 응답. 종양 괴사 인자 α, 망막 신경 세포가 죽음으로부터 방출 된 시그널링 분자는 신경 세포로 분화하기 전에 증식 계속 신경 전구 세포를 5 증식 및 생산할 수있는 기저 내부 핵 층 망막 (INL)에 상주 뮐러 아교 세포를 유도 이 사망 종류 3,4-. 재생 응답의 증식기 동안 뮐러 아교 세포의 핵 및 유래 신경 전구 세포는 세포주기 (Interkinetic 핵 마이그레이션 INM) (6) 상에 반복적 이동성 패턴을 겪는다 > 7. 기초 INL에 위치 핵이 발생하는 핵이 INL에 basally 반환하기 전에 그들이 나누는 외부 핵 계층 (ONL)에 이주하기 전에 자신의 DNA를 복제합니다. 라이브 세포 이미징 방식 나중에 사우어 8, 9, 10, 11, 12에 의해 해석을 확인하면서 처리는 먼저, 조직 학적 방법을 사용 neuroepithelial 개발 중에 기재 하였다. 두 조직 화학적 및 라이브 셀 촬상 접근법 INM 망막 9, 11, 12, 13을 포함 neuroepithelia 개발에 그 기능을 기본 메커니즘을 결정하는데 사용되어왔다. 그러나 망막을 재생 성인의 INM을 지배하는 메커니즘은 자세히 연구되지 않았다외부 참조 "> 6, 7. 라이브 셀 이미징은 성인 재생 망막에 INM을 제어하는 신호 전달 경로에 대한 지식을 향상 할 수있는 매우 중요한 방법이 될 것입니다.

최근까지, 망막 INM의 라이브 세포 이미징 라이브 제브라 배아 하나 또는 병아리 배아 또는 출생 후의 마우스 망막 이식편 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16에 한정되었다. 마우스, 래트 및 지브라 피쉬 포함한 다양한 종의 동물 성체의 망막 이식편은 다른 세포 생물학적 접근 17, 18, 19, 20을 위해 이용되었지만, 라이브 세포 이미징 실험 망막 하 이식편을 사용하여적이 시간의 기간을 브리핑하기 위해 제한된 몇 시간 (21, 22)를 통해 지속적으로 실행되지 않았다. 여기서 우리는 다 광자 현미경 (6)을 사용하여 라이브 세포 이미징 실험을 모니터링 INM을 수행하기 위해 문화 가벼운 손상 성인 zebrafish의 망막에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. INM 역학으로, 예를 들면 속도가 오히려 잠재적 면역 세포 화학을 이용하여 검출되지 않을 분열의 위치보다 더 영향을받을 수도 INM 제어 메커니즘을 조사 할 때 라이브 셀 촬상 방법은 면역 조직 화학적 방법에 비해 유리하다.

향후,이 방법은 또한 가능성이있다하는 등의 뮐러 아교 세포 또는 미세 아교 세포의 행동에 의해 광 수용체를 죽음의 식균 작용으로 망막 재생하는 동안 다른 동적 프로세스를 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다.

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프로토콜

참고 : 제브라 피쉬가 발생하고 Freimann 생명 과학 센터의 노트르담 Zebrafish의 시설에서 유지 하였다. 이 논문에 기술 된 방법은 노트르담 동물 관리 및 사용위원회의 대학 승인 및 비전 및 안과 연구 협회에 의해 비전 연구에 동물의 사용을 위해 문을 준수하고 있습니다.

1. 솔루션

  1. 조직 문화 후드 및 장비 / 조직 문화 후드로 전송되는 시약을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 준비합니다.
  2. (500 2- 페녹시 에탄올 1) 시스템의 물 1 L에 2- 페녹시 에탄올 2 mL를 넣고.
  3. 0.1 밀리미터의 NaHCO3, pH가 8.0을 준비합니다. 멸균 조직 문화 후드에서 솔루션을 소독하기 위해 10 ML의 주사기와 0.2 μm의 기공 크기의 주사기 필터를 사용합니다.
    참고 : NaHCO3을 효율적으로 fluorodishes의 커버 슬립 표면을 가로 질러 세포와 조직 접착제를 확산시키는 데 사용된다 () 3.2 단계.
  4. 준비 1.0 M CaCl2를 1.0 M의 MgCl 2. 멸균 조직 배양 후드에서 10 ㎖ 시린지 및 0.2 ㎛의 세공 크기의 주사기 필터로 멸균.
  5. Hank's 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 준비하려면, 1 mM의 각각의 최종 농도에서 페놀 레드없이 칼슘 / 마그네슘 2+없이 1 배 HBSS에의 MgCl 2 CaCl2를 살균 및 멸균을 추가합니다. 무균 환경에서 작업 할 수 있습니다.
  6. 50 % 페놀 레드없이 1 배 최소 필수 중간 (MEM), 25 % 염화칼슘 2의 MgCl 2를 포함하는 HBSS는 (섹션 1.4 참조), 25 % 말 혈청 (HS), 10 단위 / mL의 페니실린, 10를 혼합 배지를 준비하려면 μg의 / ML의 스트렙토 마이신. 무균 환경에서 작업 할 수 있습니다.
    참고 :함으로써 노이즈 비율로 신호에 영향을 미치는, autofluoresces으로 페놀 레드를 포함하는 매체를 피하십시오. (23)
  7. 페놀 레드없이 1 배 MEM 1 % 저 융점 아가로 오스의 10 ㎖를 준비합니다. 아가로 오스 / 1 배 MEM은 전자 레인지,를 사용하여 용융AVE. 유체의 증발에 의한 이온 농도를 변경됩니다 반복 재가열로 아가로 오스 (예를 들어, 10 ㎖)의 작은 볼륨을 준비합니다.
  8. 배양에 앞서, 오토 클레이브를 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브 살균.

2. 라이트 피해 패러다임

  1. 어두운 적응
    1. 이 장소 - 3의 Tg [GFAP를 : nGFP] 6에서 mi2004의 제브라 피쉬 (또는 관심의 다른 형질 전환 제브라 피쉬) - 14 일에 대한 빛의없는 환경으로 시대의 14개월. 더욱 상세 내용은 참고 2, 6, 24, 25을 참조하십시오.
  2. 2,800 룩스 2, 6, 24, 25의 광을 방출이 형광 램프 사이의 시스템 물에 3 어두운 적응 형질 전환 제브라 피쉬 - 2를 포함하는 탱크를 배치합니다.
  3. 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 제브라 피쉬를 노출. 33 °의 C - 광 노광시, 수온 (31) 사이에 유지되는 것을 보장.

배양 3. 준비 (망막 분리의 날)

  1. 70 % 에탄올을 사용하여, 조직 배양 후드 성분 살균 / 조직 배양 후드로 옮기고되는 도구 (예를 들어, MEM 및 HBSS, 피펫, 멸균 피펫 팁 등을 포함하는 플라스.).
  2. fluorodishes의 준비
    1. 세포 및 조직 접착제와 각각의 망막을위한 코트 하나 fluorodish는 (재료의 표 참조).
    2. 70 μg / ML의 최종 농도 0.1 mM의 NaHCO3을의 세포 및 조직 접착제를 희석 각 fluorodish 50 μL를 추가하고, 200 μL 피펫 팁으로 fluorodish의 중심을 가로 질러 용액을 확산 (약 1-1.2 cm 직경 ).
    3. RT에서 3 시간 - 1 코팅 fluorodishes을 품어(또는, 4 ° C에서 O / N을 품어).
    4. 솔루션을 제거하고 각 세척을위한 1 배 MEM 500 μL와 배를 씻어. 망막 외식가 장착 될 때까지 건조에서 코팅 fluorodishes을 방지하기 위해, MEM에서 그들을 유지합니다.
  3. 단계 1.6에 설명 된대로 배지를 준비합니다. 배양액을 1 주일까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.

망막의 Explants 4. 분리 및 배양

참고 : 아래에 설명 된 프로토콜은 주로 설명 광 손상 패러다임에 의해 병변 된 망막 영역이다 지느러미 망막의 분리입니다. 따라서, 손상에 의한 증식과 interkinetic 핵 마이그레이션 관련 이벤트는 지느러미 망막에 발생합니다. 그러나 상기 분리 방법은 연구 / 조사 질문의 특정 요구 사항에 따른 망막 영역을 생성하도록 조정될 수있다.

  1. 하나의 광 손상 형질 전환 제브라 피쉬 a를 안락사1 타 시간 : 500 2- 페녹시 에탄올.
  2. 1,000 μL 피펫으로 한 fluorodish에서 MEM을 제거 유체 유적의 박막 있도록.
  3. 마른 종이 타월에 제브라 피쉬 이동 뒤몽 포셉 (핀셋 # 5, 45 ° 각도)의 곡선 쌍의 눈을 제거하고 fluorodish에 그것을 전송할 수 있습니다.
  4. 시신경과 눈 뒤쪽 표시되도록 입체 현미경을 사용하여, (도 1D)에 fluorodish의 커버 슬립 상에 동공과 눈의 방향.
  5. 맥퍼슨 - Vannas 가위 한 쌍의 눈 뒤쪽에 가까운 절단, 시신경을 제거합니다. 또한, 안구의 외측에 감 결합 조직을 제거한다.
  6. 사상 판을 통해 하나의 가위 블레이드 피어싱과 코와 눈의 시간적 양쪽을 따라 절단하여 광학 줄기에서 절개를하는 동안 # 5 포셉 한 쌍의 비강 및 시간 측면 사이의 눈을 잡고 (그림 1E 참조 , 분할 리네브라스카).
  7. 망막의 등 쪽과, 지느러미 망막에서 복부를 별도의 조직을 당겨 다른 쌍을 유지 # 5 포셉 두 쌍을 사용.
    참고 : 공막이 위를 향하면서 렌즈와 신경절 세포 층이 coverslip에 직면 있도록 지느러미 망막의 방향을하는 것이 좋습니다.
  8. # 5 포셉 (그림 1H, I)의 두 번째 쌍의 망막에 연결되어있는 렌즈를 누른 상태에서, # 5 포셉 한 쌍의 지느러미 망막에서 공막을 제거합니다.
  9. 렌즈를 제거하려면, 맥퍼슨 - Vannas 가위를 사용하여 망막 (그림 1I, J)을 손상시키지 않고 렌즈 뒤에 잘라. 경우에 따라 렌즈는 단계 4.7에서 분리합니다. 이 경우, # 5 포셉의 두 번째 쌍의 절단 가장자리에있는 망막을 잡고 집게로 조심스럽게 공막를 제거합니다.
  10. 망막에 손상을주지 않고 렌즈를 제거하는 동안 유리체를 제거합니다. 커버 슬립 대향 신경절 세포 층 망막 평평fluorodish의 (그림 1L, M).
  11. 1 % 저 융점 아가로 오스 10 μL와 망막 둘러싸고 아가로 오스가 고형화하자.
  12. 심지어 약간의 상승이 조직에 깊이 집중하는 능력에 영향을 미칠 수있는 액체 아가로 오스가 망막을 들어 올리지 않는 것을보십시오. 리프팅이 관찰되는 경우, 아가로 오스를 제거하는 피펫을 사용합니다. 더 추가하기 전에 잔류 아가로 오스 세트를 보자.
  13. 전체 fluorodish을 충당하기 위해 1 % 저 융점 아가로 오스를 추가하기 전에 여러 번 단계를 반복 4.12. 아가로 오스가 확정되면, 1.5 mL의 배지를 추가합니다.
  14. 망막 분리 조작에 의해 발생하는 응력을 회복 할 수 있도록 약 12 시간 동안 32 ° C로 설정 5 % CO 2 / 공기 환경에서 망막 이식편 배양을 유지한다. 빛 처리 제브라 같은 온도에서 망막을 유지하도록 32 ° C의 온도를 설정한다 (단계 2.3 참조).

5. 다중 광자 현미경

참고 :이 원고에서 수행 된 실험은 적외선 레이저 (재료의 표 참조)하는 40X 아포 장거리 침수 목표 (1.15 NA)가 장착 된 광자 현미경, 검류계 스캐너와에 최적화 된 네 35mm 배양 접시에 대한 삽입을 포함 환경 챔버. 이미지는 비 descanned 검출기 (R-NDD)을 획득 하였다.

  1. 촬상에 앞서, 5 % CO 2 / 공기 분위기를 달성하는 환경 챔버를 평형. 빈 배양 접시가 방으로 가스의 누출을 방지하기 위해 홀더에 삽입되어 있는지 확인합니다.
  2. 현미경 시스템을 켭니다.
  3. 환경 챔버가 평형되면, 40X 아포 장거리 침수 목적 (NA 1.15)에 굴절률 액체를 추가 할 수 있습니다.
    주 : 물과 유사한 광학 특성을 갖는 굴절률 액체 장기 촬상 중에 물의 증발을 방지하기 위해 사용된다.
  4. 장소 독감챔버에 망막 외식과 orodishes. 브라이트 라이트를 사용하여 빛의 경로로 시료를 놓고 초점면에 지느러미 망막의 midregion을 가지고.
  5. GFAP에 초점을 GFP의 epifluorescent 빛을 사용 nGFP는 뮐러 아교 세포의 핵 (그림 2A, C)를 양성.
    참고 : nGFP 양성 핵하거나 희미 형광됩니다 외식 평면 또는 아가로 오스 이식편에서 축적 장착하지 않는 경우가 GFAP에 집중하기 어려울 것이다.
    1. 같은 망막 이식편 내에서 다른 지역으로 이동하는 초점 문제를 극복 여부를 확인합니다. 그렇지 않으면 다른 망막 이식편로 이동합니다.
  6. 이미지 수집 소프트웨어에서 'A1 MP GUI'는 'TiPad'에서 'A1 컴팩트 GUI'와 'ND 취득'창을 엽니 다. 광자 이미징의 경우, 'IR NDD'옵션이 'A1 컴팩트 GUI'에서 선택되어 있는지 확인합니다.
  7. 'settin에서g '필드는, 1 차 다이크로 익 미러 IR-DM을 선택하고 GFP의 형광을 취득 50분의 525 대역 통과 필터를 선택합니다.
  8. 'A1MP GUI'라고 표시된 창에서 IR 레이저에 전환합니다. 레이저가 준비하는 것은 몇 분 정도 소요됩니다. GFP의 형광을 자극하고 'A1 MP GUI'창에서 '자동 정렬'버튼을 클릭하여 레이저를 정렬 910 nm의 파장을 설정합니다.
  9. 객실 및 장비 등은 광전자 증 배관의 과다 노출을 방지하기 위해 'A1 MP GUI'에 셔터를 열기 전에 꺼 또는 포함되어 있는지 확인합니다. 소음을 줄이기 위해, 어두운 환경에서 현미경 집.
  10. 두개의 줌, 4.8 μS / 화소의 화소 보압 시간 300 X 300 픽셀의 시야의 이미지를 획득. 대략 'A1MP GUI'와 'A1 컴팩트 GUI'창에서 이득에서 '수집 영역'을 변경하여 레이저 출력을 설정합니다.
  11. 는 z 스택 설정
    1. ND 획득 '창'을 내 Z '서브 윈도우'는의 Z - 스택의 상단에 초점면을 설정 신경절 세포 층에 초점을 맞 춥니 다. 일부 GFAP : nGFP 양성 세포는 일반적으로 망막 (도 2A, D)의 기부 제한을 식별하는 데 도움 신경절 세포 층에 위치한다.
    2. ONL의 수준을 통해 초점면을 이동 (그림 2A, B), 희미하게 표시 GFAP의 존재에 의해 특징되는 다음 INL (그림 2A, C)에서의 대응에 라운드 및 확대 상대적 nGFP 양성 세포를 .
    3. 는 z-스택의 하위로이 비행기를 설정합니다. 전체 ONL (그림 2A, B) 이미징 될 것입니다 있는지 확인합니다.
    4. 이미징 기간 동안 다시 조정 필요 초점면의 변화를 경험하는 경우 '홈'위치로 지정하는 'Z'서브 윈도우의 중간 위치를 두 번 클릭합니다. 로 변경 '대칭 모드 정의'와 '상대'을 클릭합니다.
    5. 1 ㎛ 0.7 사이의 Z-단계의 크기를 설정합니다.
  12. Z 강도 보정 :
    1. 때문에 빛의 산란에 픽셀 강도의 손실을 보상하기 위해 Z-강도 보정을 적용 할 때 조직의 깊은 층에있는 영상.
    2. 보정을 설정하려면 'Z-강도 보정'창을 엽니 다. 'Z-스택 범위', 'ND에서'선택을 설정합니다.
    3. 게인 (A1 컴팩트 GUI합니다 ( 'A1MP GUI'에서 '수집 영역') 레이저 강도를 (이 경우, 신경절 세포 층에 해당)가 'Z-강도 보정'창 하단의 초점면을 클릭하고 설정 ).
    4. 이후 선택한 초점면의 'Z-강도 보정'창에서 '장치 설정'아래에 표시되는 설정을 확인하는 'Z-강도 보정'창에서 'Z 값'옆에있는 화살표를 클릭합니다.
    5. 중간 A의 과정을 반복레이저 전력 이득을 증가시키는 ND 상부면. 필요할 경우 추가의 초점 평면을 첨가 할 수있다. 4 - 그림 2에 실험에 대한 구체적인 레이저 및 게인 설정은 표 1을 참조하십시오.
    6. 'A1 MP GUI'창에서 '인수 영역'을 설정합니다. (15)보다 큰 인수 영역과 photobleaching에 우회하는 영상의 시작에 이득보다 높은 126을 선택 피하고 소음 증가했다.
      참고 : 레이저 및 광전자 증 배관 튜브 광표백을 피하면서 설정 한 현미경 최적의 촬영 조건을 얻기 위해 현미경 시스템, 테스트 레이저 및 게인 설정 사이에 차이가있다.
    7. 'Z-강도 보정'창에서 '상대 강도 보정'을 선택합니다.
  13. 'ND 인수'창에서 '시계열'서브 윈도우에서 8 시간에 시간과 '지체없이'로 간격을 설정합니다. 그런 다음, t에서 '실행 Z-수정'을 클릭해야합니다'ND 획득'창 버튼에서 그는 'Z-스택'하위 창은 3-D의 시계열을 획득한다.
  14. 이미지 수집의 기간에 걸쳐 29 °의 C - (27)의 온도에서 망막 외식을 유지한다.
  15. 화상 획득 기간 동안, 필요할 경우, 포스트 영상 분석을위한 이미지 품질을 유지하기 위해 전력 레벨 이득을 재조정. 5.11.4 - 조정에 대한 단계 5.11.2를 수행합니다.
  16. 초점면 이동하는 경우, 일시 중지하거나 실행을 중지하고 단계를 다시 5.11를 수행합니다.
    참고 : '상대 Z-보정'단계 5.12.7에서 선택되었다 단계 5.11.4이 수행 된 경우 광범위한 광표백가 발생하지 않는 한, 전력 및 이득 수준을 재조정 할 필요는 없습니다.

속도 6. 분석

  1. 이미지에 '관심 지역'을 설정, 시간의 압축을 풉니 다. '시간 측정'도구를 사용하여 스프레드 시트에 시간 값을 내보낼 수 있습니다.
  2. 디를 포함하는 영역을 자르기이용하므로의 GFAP : nGFP 양성 핵.
  3. 그 다음에 분할 핵 기저 INL 관련하여 이전의 거리를 측정하기 위해 기준 포인트를 설정하기 위해 INM을받지 않은 적어도 하나의 핵을 포함되도록 자른 영역을 선택한다. 참고 : 기초 INL에 남아 핵를 선택하려면,이 시계열의 3 차원 재구성을 준비하는 데 도움이됩니다.
  4. GFAP 경우 대안 : nGFP 양성 세포의 획득주기에 걸쳐 ONL 관찰되어 기준점을 식별하기 위해 기저 INL에 ONL 핵에서 스패닝 고정 길이의 수직 라인을 사용한다.
  5. '쇼 조각보기'기능을 사용하여 직교 돌기를 생성합니다. 그 후, '최대 강도 투사'에서 '조각'의 모드를 변경합니다.
  6. 직교 최대 투사의 'XY'보기를 끄십시오. 이주중인 / 분할 핵, 가장 볼 수있는 방향에 따라LSO는 'xz'- 또는'yz'보기 중 하나를 끕니다.
  7. 마우스 오른쪽 버튼으로 남아있는 이미지를 클릭이보기에서 새 문서 만들기 '함수'XZ '또는'를 함께 yz' 이미지 시리즈 '를 추출합니다. 필요한 경우, 이미지를 회전.
  8. '수동 측정'기능을 사용하여, 기초의 INL 유지 및 INM받지 않는 핵의 하부 레벨에서는 이미지의 수평 라인을 그릴 (= 기준점,도 4a를 - E 적색 가로줄).
  9. 기준선 및 분석 소프트웨어의 '선 측정'도구 (- E도 4a 참조)를 사용하여 시계열에 대한 이주 핵의 기점 사이의 거리를 측정한다.
  10. 핵막가 고장 나면 그것은 전체 셀에 GFP의 확산 다음으로 식별되면, 소마의 기초 위치를 측정한다.
  11. 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하면, 거리에게 플레이 플롯cleus (그림 4 층) 전달 된 시간에 대해 마이그레이션.
    1. 발생 (V a)는, 그래프의 거리가 핵 봉투 고장 전의 기간 동안 여행 혀끝의 이동 속도 (그림 4 세대)를 결정합니다.
    2. 차트에서 데이터 계열을 선택, 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 해당 기능 'Y = MX + C'를 포함하는 선형 회귀 곡선을 삽입합니다. 함수의 기울기 'm'은 속도를 나타내고, V A (도 4G).
    3. 반복 기저 이동 속도, V의 B (그림 4H)을 결정하기 위해 빠른 기초 마이그레이션의 첫 단계에 대한 6.11.1과 6.11.2 단계를 반복합니다.

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결과

그림 1의 회로도에 설명 된 절차에 따라 망막의 분리는 가벼운 손상 성인의 Tg에서 평평 지느러미 망막의 배양을 할 수 있습니다 [GFAP : nGFP] 5 % CO 적어도 24 시간에 걸쳐 mi2004 제브라 피쉬 2 / 공기 환경을 제공합니다. 이러한 평면 장착 망막 이식편 깊은 조직 레벨에서의 이미지의 초점 평면에 사용될 수있다. 예는 뮐러 아교 세포 / 광 손상 망막에서 유사 분열하는 동안 ONL에 위치한 뮐러 아교 세포 - 특이 적 프로모터의 GFAP (아교 섬유 성 산성 단백질)에서 GFP로 표지 된 신경 전구 세포의 핵 (도 2a - D, 3). 아래의 막대 광 수용체에 EGFP을 표현 nt19 제브라 피쉬의 눈 : 더이 방법은 다양한 망막 세...

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토론

손상된 성인 제브라 망막 주로 사용한 면역 세포 화학 방법을 5, 25, 26, 27, 28, 29, (30)의 재생을 관리하는 메커니즘을 조사 연구. 배양 망막 이식편에 조건을 설정하고, 이러한 INM 같은 현상 라이브 세포 이미징을 수행 우리 깊이 공간 및 시간 정보를 얻을 수있는 기술을 제공한다. 이 기술은 이동 속도, 유사 분열 및 길이 및 세포 분열의 위치 의향 동안 타이밍 및 핵막 고장의 위치를 ​​결정할 수있다. 또한, 그 이후의 위치에 관해서 분할면 및 발생 딸 세포의 운명을 확립 할 수있다. 궁극적으...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

우리는 윌리엄 아처와 노트르담 통합 이미징 시설에서 제공하는 지원을 주셔서 감사합니다. 특별 감사는 지속적인 도움과 자신의 관심과 제브라 피쉬의 축산에 대한 Freimann 생명 과학 기술자로 보내집니다. 본 연구는 DRH에 NIH 국립 안과 연구소 (R01-EY018417, R01-EY024519)과 Zebrafish의 연구 센터, 노트르담 대학교, 노트르담, IN에서 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dumont 펜치 #5World 정밀 기기14098
Dumont 펜치 #5, 45° 각도World 정밀 기기14101
McPherson-Vannas 가위World 정밀 기기501233
FluordishWorld 정밀 기기FD35-100
실체현미경Nikon 해부 실체 현미경의SMZ-1B
작동합니다 : 생물학적 안전 캐비닛 클래스 유형 A2Labconco등가 유형은
조직 배양 인큐베이터, ThermoscientificHEPA 클래스 100등가 유형은
Sylvania 형광등 OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0.2 µ를 작동합니다. m 기공 크기 Acrodisc 주사기 필터VWR4192
10 mL Luer-lok 주사기VWRBD309604
60 mL Luer-lok 주사기VWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, 페놀 레드 제외, GibcoThermoScientific14175-095
MEM w/o 페놀 레드, GibcoThermoScientific5100-038
호스 세럼, 열 비활성화ThermoScientific26050-070
페니실린/스트렙토마이신VWR16777-164
초순수 저융점 아가로스ThermoScientific16520-100
에탄올, 절대ThermoScientificBP2818-4
2-페녹시에탄올Sigma77699
Corning Cell-Tak 세포 및 조직 접착제 VWR354240
굴절률 액체 
Nikon A1 다광자 현미경은
니콘
유사한 유형은, MaiTai 적외선 레이저 Nikon 과 동등한 시스템이 장착된 Cargille Lab 1803Y 40X Apo 장거리 침수 대물렌즈(NA 1.15), 35mm 페트리디쉬용 인서트가 장착된 환경 챔버, Okolab 등가 시스템이 NIS 분석 소프트웨어를 작동합니다.

참고문헌

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