우리는 마우스의 맹장에 종양 세포 또는 유기체를 주입하고이 모델에서 순환하는 종양 세포 (CTCs)를 분리하여 정형 적 대장 직장 종양의 형성을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
쉬운 적용 성과 비용 효율성이라는 장점에도 불구하고 피하 조직 마우스 모델에는 심각한 한계가 있으며 종양 생물학 및 종양 세포 보급을 정확하게 시뮬레이트하지 못합니다. Orthotopic 마우스 모델은 이러한 한계를 극복하기 위해 도입되었습니다. 그러나 이러한 모델은 기술적으로 까다로운 기관, 특히 대장과 같은 기관에서 요구됩니다. 신뢰할 수있게 성장하고 전이하는 균일 한 종양을 생산하기 위해서는 종양 세포 준비 및 주사의 표준화 된 기술이 중요합니다.
우리는 매우 균일 한 종양을 발생시키고 종양 생물학 연구 및 치료 임상 시험에 사용될 수있는 대장 암 (orthoreopic mouse)의 대장 암 모델 (CRC)을 개발했습니다. 원발성 종양, 2 차원 (2D) 세포주 또는 3 차원 (3D) 조직 종양의 종양 세포가 맹장에 주입되어 주입 된 종양 세포의 전이 잠재성에 따라 고도로 전이 된 종양을 형성합니다. 게다가,CTC는 정기적으로 발견 할 수 있습니다. 우리는 종양 보유 마우스로부터의 CTCs의 격리뿐만 아니라 외과 및 주사 기술뿐만 아니라 일차 종양 조직뿐만 아니라 2D 세포주 및 3D 유기체 모두로부터의 종양 세포 제조 기술 및 문제 해결을위한 현재의 팁을 기술한다.
서론
Colorectal cancer (CRC)는 서구 국가에서 암으로 사망하는 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 차 종양은 종종 절제 할 수 있지만 1, 원격 전이의 발생은 극적으로 죽음에 이르게 종종 예후를 악화합니다. 2 , 3 전이의 생물학적 상관 관계는 종양에서 분리되어 순환하면서 생존하며 표적 기관의 상피에 부착하고 장기를 침범하여 궁극적으로 새로운 병변으로 자라는 순환하는 종양 세포 (CTC)입니다. CTCS이 예후 관련성, 5, 6, 7, 8의 것으로 알려져 있지만 (4), (9) 그 생물은 부분적 CRC에서의 극단적 인 희귀 한 결과로 이해된다. 10
마우스 모델은 강력한 기능입니다.암 생물학의 다양한 측면을 연구합니다. 종양 세포를 면역 접종 (동종 쥐 종양 세포를 사용하는 경우) 또는 면역 결핍 일 수있는 수령 마우스에 피하 주사하여 고전적이고 피하 종양 모델을 생성합니다. 피하 종양 모델은 저렴하고 빠른 데이터를 생성합니다. 그들의 종점 종양 성장은 용이하고 비 침습적으로 측정 될 수있다. 그러나, 그러한 모델에서 항 종양 활성을 입증 한 새로운 화합물의 88 %가 임상 시험에서 실패합니다. 11 이것은 부분적으로 인간과 쥐 사이의 종간의 차이로 인한 것이다. 그러나이 실패의 대부분은 피하 조직 마우스 모델의 예측 가치가 낮기 때문입니다.
종양 세포가 기원 기관에 주입되어 원래의 미세 환경에서 성장하는 정형 마우스 모델은 암 연구에 점점 더 많이 사용됩니다. 11 , 12 , 13 , 14 Orthotopic 모델은 국소 종양 성장 조건을 시뮬레이션 할뿐만 아니라, 해부학 적으로 정확한 종양 성장 부위의 결과로, 정위 마우스 모델은 또한 전이의 현실적인 시뮬레이션을 가능하게하여 CTC 생물학 8 , 15 , 16 또는 CRC의 다른 치료법에 대한 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 13 , 17
orthotopic 마우스 모델의 주요 단점은 기술적 인 복잡성입니다. 세포가 주입되어야하는 기관에 따라, 실험자가 재현 할 수있는 종양을 유도 할 수있을 때까지 학습 곡선은 오히려 길다. 종양 세포를 장 벽에 주입해야하기 때문에 대장 암 모델에 특히 적용됩니다. 종양 세포는 종종 천공, 종양 세포 누출 또는 종양 세포 종양 감소를 초래합니다. 이것은연구는 1 차 조직 샘플, 2 차원 세포주 및 3 차원 유기체 배양과 맹장 (맹장)으로의 세포 준비 방법을 설명하기위한 것입니다. 여기에 기술 된 기술은 고도로 균일 한 종양을 유도하고, 주입에 사용 된 세포주의 종양 생물학적 특성에 따라 수혜자 마우스에서 먼 전이 및 CTCs의 재현성있는 형성을 유도합니다. 15 명
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프로토콜
여기에 제시된 동물 실험은 기관 및 정부 동물 관리 및 사용위원회가 독립적으로 검토 및 승인했으며 실험 동물 학회 연맹 (FELASA) 지침에 따라 실시되었습니다. 모든 가능한 조치는 마취 및 진통제, 또는 필요한 경우 조기 안락사를 비롯한 고통을 최소화하기 위해 취해졌습니다.
1. 세포 및 organoids의 준비
참고 : 각 주입마다 100,000 개의 셀을 사용하여 20 μL의 부피를 사용하십시오. 누출을 방지하고 표준화 된 주입을 보장하기 위해 기저막 매트릭스 (BMM)를 사용하십시오. 재현성있는 결과를 보장하려면 일정한 간격으로 세포주 인증 검정을 수행하십시오 ( 예 : STR 프로파일 링을 통해 ).
- 신선한 조직으로부터의 일차 세포 현탁액의 제조
참고 : 항상 멸균 상태에서 작업하십시오. 신선도의 즉각적인 전달수술실에서 얼음으로 실험실로 옮겨진 조직은 세포의 높은 생존력을 보장하기 위해 필요합니다.
환자의 건강과 최적의 치료가 항상 최우선 적이어야합니다. 따라서 연구를위한 조직 표본은 절제 된 종양의 병리학 적 후속 작업 및 스테이징을 방해하지 않는 방식으로 얻어야합니다. 따라서 대부분의 경우 병리학 적 진단을 방해하지 않기 위해 훈련 된 병리학자가 얻은 연구 표본을 보유하는 것이 합리적입니다.- 절제된 표본 (이상 1cm 3 ~)에서 멸균 제거 직후, 20-30 ML 인산 버퍼 식염수 (PBS)가 미리 채워진 50 ML 튜브에 조직 샘플을 놓으십시오. 얼음에 튜브를 보관하고 즉시 실험실로 옮깁니다.
- 페트리 접시에 조직을 넣고 충분한 혈액으로 두 번 씻어서 나머지 혈액을 제거하십시오.
- sca로 조직을 작은 조각 (~ 2 ~ 4mm)으로 자릅니다.lpel ( 예 : # 20 또는 # 36 블레이드 사용).
- 종양 조직을 단일 세포 현탁액에 추가로 해리하기 위해 제조자의 지시에 따라 해리자를 사용하십시오. 또는 효소 종양 소화의 다른 프로토콜을 사용하십시오.
- 결과 단일 세포 현탁액의 세포 수를 세십시오 ( 예 : 콥터 카운터 또는 혈구 미터에서).
- 원심 분리기 (1,500 xg에서 5 분)와 PBS로 두 번 세포 현탁액을 씻으십시오.
- BMM에 5 x 10 6 세포 / ML의 농도로 세포를 Resuspend하고 얼음에 그들을 유지.
- 주사 세포주의 제조
- 표준 배양 조건 하에서 모든 대장 암 세포주 (37 ° C, 5 % CO 2) 성장 및 수술의 날을 준비.
- 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 세포를 수확하고 ( 예 : 콥터 카운터 또는 혈구 미터에서) 세포를 계산하고 req를 계산합니다주사 할 동물의 수에 따라 모든 주사에 대한 유익한 양.
- 실제로 필요한 분량의 3-5 배를 준비하여 분주 손실과 사출 주사기의 사 용량을 고려하십시오.
- 원심 분리기 (1,500 g에서 5 분)와 PBS로 두 번 세포 현탁액을 씻으십시오.
- BMM에 5 x 10 6 세포 / ML의 농도로 세포를 Resuspend하고 얼음에 그들을 유지.
- 유기체 준비
주 : 모든 3D 유사 장기 배양 표준 배양 조건에서 성장된다 (37 ° C, 5 % CO 2). 유기체 배양에 대한 자세한 프로토콜은 이전에 발표되었습니다. 18 , 19 , 20 기존의 세포주와 유사하게 우리는 1 회 주사 당 100,000 개의 세포를 가진 20 μL의 BMM을 권장합니다. 유기체는 다음과 같이 수술 당일에 준비됩니다 :- 다음 매체를 준비하십시오.(DMEM) / F12 + 1 % HEPES (1M) + 1 % 글루타민 (200mM) + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신.
- 15 mL 튜브에 1 mL DMEM / F12 +++를 미리 채우십시오.
- 조심스럽게 배양 판 표면에서 유기체를 흡인하고 3-5 개 웰의 내용물을 하나의 15 mL 튜브로 옮긴다.
- 조심스럽게 확장 된 유리 피펫으로 위아래로 pipetting하여 작은 조각으로 organoids을 부셔.
- 튜브에 5 ML DMEM / F12 + + +를 추가하고 5 분 1,000 XG에서 원심 분리기를 따라 갔다.
- 원심 분리 후, 뜨는을 제거하고, 600 μL 효소 해리 버퍼에서 펠렛을 resuspend하고 6 잘 접시 중 하나에 현탁액을 전송하십시오.
- 37에서 품어 ° C 1-5 분 다음 조심스럽게 organoids을 분해하기 위해 현탁액을 위아래로 pipet.
참고 : 현미경으로 소화를 확인하십시오; 모든 셀 클러스터가 분리되면 완료됩니다.단일 세포에 d. - 성공적으로 소화가되면 소화를 멈추기 위해 1.4 mL의 DMEM / F12 +++를 첨가하십시오. 그런 다음 소화 한 유기물의 모든 우물을 50 mL 튜브에 옮긴다.
- 세포를 세고 모든 주사에 필요한 양을 계산하십시오.
- 피펫 팅 손실과 사출 주사기의 사후 부피를 고려하여 실제로 필요한 양의 3 ~ 5 배 준비
- 원심 분리기 (1,500 xg에서 5 분)와 PBS로 두 번 세포 현탁액을 씻으십시오.
- BMM에 세포를 5 × 10 6 세포 / mL의 농도로 Resuspended 얼음에 그들을 유지.
2. Orthotopic 마우스 모델
- 수술받는 동물의 준비
참고 : 사용받는 사람으로 6~8주 된 NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD의 SCID 감마, NSG) 마우스. 21 NSG는 성숙한 B, T 및 NK 세포가 결핍 된 면역 결핍 마우스 중 가장 면역력이 약한 생쥐 중 하나입니다.fects. 21 그들은 안정적으로 낮은 세포 수를 주입하는 경우에도 종양의 성장 및 원격 전이에 매우 경향이 있습니다. NSG 마우스는 탁월한 브리더 스이며 기존의 특정 병원체가없는 (SPF) 단위로 유지 될 수 있습니다.- 첫 절개 전에 0.05 mg / kg의 부 프레 노르 핀을 피하 주사하십시오.
- 전신 마취시 3-3.5 vol %의 세보 플루 란을 사용하십시오. 발가락 핀치 반사의 손실은 충분한 마취를 나타냅니다.
- 각막의 건조를 피하기 위해 마취 된 쥐의 눈을 안과 용 연고로가립니다.
- 작은 테이블에서 쥐를 앙와위로 세우십시오.
- 복부를 전기 면도기 (면도기 크림을 사용할 수도 있음)로 면도하고 적어도 3 회 클로르헥시딘 / 요오드 및 70 % 알코올로 소독하십시오.
- 수술 밭을 멸균 용 커튼으로 덮어 라.
참고 : 수술 전 항생제 사용은 선택 사항이며 기관 지침에 따릅니다.
- Midline 개복술과 맹장 노출
- 하복부의 피부를 작게 정중선 절개 (3 ~ 5 mm)하기 위해 가위 (메스를 사용)를 사용하십시오. 포셉로 복벽 근육을 집어 들고 조심스럽게 가위로 절개하여 복강을 엽니 다.
- 확인하고 조심스럽게 외상성 집게로 맹장화. 복부에 맹장의 맹인 결말 주머니를 위치 시켜서 조준합니다.
- 체외 수정이 완료되면 항상 따뜻한 식염수로 맹꽁이를 유지하십시오.
- 정위 주사, 복부 폐쇄 및 수술후 회복
- Intracecal 주사의 경우 30G 캐뉼라가있는 표준 1 mL 주사기를 사용하십시오. 이 주사기를 마이크로 주입 펌프에 장착하십시오. 마이크로 주입 펌프는 다시 마이크로 조작기에 장착됩니다.
- 조심스럽게 외상성 포셉을 사용하여 맹장의 끝 부분을 잡아서 천천히 쓰다듬어 부드럽게 부드럽게 만듭니다.d 따뜻한 식염수로 moistened 집게의 두 번째 세트와 함께.
- 맹장 바로 위에 캐뉼라를 놓습니다.
- 쌍안 외과 현미경으로 시각 제어하에 다음 단계를 수행하십시오.
- 조심스럽게 맹장의 외관 부분의 양쪽 끝에있는 두 개의 외상성 포셉로 맹장을 잡고 약간 늘인 다음 천천히 똑바로 평행하게 놓인 캐뉼라 위로 천천히 당깁니다. 누출과 복막 파종으로 이어질 수 있기 때문에 전체 장 벽을 관통하지 않도록 (따라서 세포를 관강에 주입하는 것) 관통 초기 지점을 초과하는 혈관을 관통하지 않도록하는 것이 중요합니다.
- 대장쪽으로 캐뉼라가 아니라 캐뉼라쪽으로 장을 움직입니다. 두 포셉 사이에 장을 잡고 잡아 당깁니다. 외과 의사의 손은 떨림을 줄이기 위해 표면 위에 있어야합니다.
- 혈청 사이의 세포를 주입합니다 (위의 매우 얇은 반투명 안감으로 보임).e 교내 혈관)과 근막. 따라서 캐뉼라는 얇은 반투명 막 아래의 혈관 위에 시각적으로 배치해야합니다.
- 캐 뉼러가 장 벽 내부에있는 동안 떨림을 줄이기 위해 풋 스위치를 사용하여 주사를 시작하십시오.
- 캐 뉼러가 제 위치에 있으면 주입을 시작하십시오. 20 초의 지속 시간을 사용하면 펌프의 컨트롤 유닛에 1 μL / s 설정이 적용됩니다.
참고 : 손상된 혈관으로 또는 근처에서 주사하면 혈관 내 직접 전이와 먼 전이가 발생하므로 피해야합니다. - 주사가 끝나면 정맥을 뒤로 당겨 조심스럽게 제거하십시오.
- 맹장 아래에 마른 면봉을 놓고 증류수로 꼼꼼하게 씻어 누출 된 세포를 용해시켜 인공 복막염을 예방하십시오.
- 복부 폐쇄 및 수술 후 회복
- r 이후맹장을 부드럽게 복강으로 되 돌린다.
- 신속하게 흡수 가능한 6-0 봉합으로 복부 벽을 닫습니다.
- 수술 상처 클립으로 피부를 닫으십시오.
- 마취로 완전히 회복 될 때까지 38 ° C로 설정된 히팅 맵에 마우스를 놓습니다.
- 다음 48 시간 동안 마우스의 수술 후 상태를 밀접하게 관찰하십시오. 조난의 경우, 12 시간마다 0.05 mg / kg buprenorphine으로 치료하십시오.
- 종양 성장으로 인한 고통의 징후가 있는지 적어도 매일 1 회 마우스를 모니터링하십시오.
3. 전체 혈액 샘플로부터 순환 종양 세포의 분리
참고 : 마취 마우스에 경피 성 심장 천자로 혈액을 채취하고 안락사하십시오. 이상적으로는 1,000 μL의 혈액을 항응고제 (Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 또는 헤파린) 100 μL가 미리 채워진 주사기에 주입합니다. 항 - 인간 -EpCAM (상피 세포 부착분자) 항체를 사용하여 CTC를 동정한다. 이것은 인간 상피 세포주가 마우스 모델에 사용된다면 아주 잘 작동합니다. 다른기구의 경우, 다른 항체가 필요할 수 있습니다.
- CTC 농축 :
- 5 ML 밀도 그라디언트 매체 15 ML 튜브를 미리 채우고 조심스럽게 15 ML 튜브에 혈액을 전송하십시오.
- 원심 분리기 (브레이크없이 300 xg에서 30 분)와 조심스럽게 상층 액을 제거합니다.
- 나머지를 새로운 15 mL 튜브와 원심 분리기에 붓습니다 (15 분, 300 xg 브레이크 사용).
- mononuclear 세포를 포함하는 interphase를 복구 (나머지를 버리고) PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 200 μL PBS / 1 % EDTA에 펠렛을 Resuspend하고 EpCAM 항체 4 μL를 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 20 분 동안 품어 낸다.
- 상영 및 따기
- 다음과 같은 완충액을 준비하십시오 (다음에서 피킹 완충액이라고 함). PBS + 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS) + 1 % 페니실린 / S트레 피드 마이신 (1 %) + 0.8 % EDTA.
- PAP 펜을 사용하여 6cm의 멸균 페트리 접시에 ~ 1cm의 원을 그려 (액체가 접시에 분산되는 것을 방지하십시오),이 원에 피킹 버퍼 700μL를 피펫으로 넣으십시오.
- 서클 내에서 700 μL 따기 버퍼에 세포 현탁액 50 μL를 추가합니다. 현미경으로 세포의 밀도를 확인하십시오. 너무 빽빽한 경우 다른 요리로 샘플을 나눕니다.
- 세포가 진정 될 때까지 기다리십시오 (~ 5 분).
- 스테인드 (= EpCAM 양성) 세포의 세포 현탁액 드롭.
- 세포가 발견되면, micromanipulator와 세포를 선택하고 의도 다운 스트림 분석 ( 예 : RNA 추출 버퍼 또는 배양 매체)에 따라 50 μL 버퍼에 넣어.
- 예정된 다운 스트림 분석에 따라, EpCAM- 음성 세포 및 / 또는 음성 대조군으로서의 배지를 분리한다.
- 하류 분석 ( 예 : 세포 배양, PCR)으로 진행하십시오.
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결과
이 모델에서 대장 암 종양의 성공적이고 재현성있는 생성은 유출이나 누출없이 세포의 정확한 주입에 결정적으로 달려 있습니다. 이것이 성취된다면,이 모델은 매우 신뢰할 만하 며, 인공 복막염을 유발하는 경우는 거의 없습니다. 종양의 성장 동력학 및 그것의 보급 패턴은 사용 된 유기체 및 세포의 생물학적 특성에 달려있다. HCT116 세포가 안정적으로이 모델에서 간으로 전이 15 일 동안, SW620 세포 형태 동소 종양,하지만 전이하지 않습니다. 15 명
이 모델에서 HCT116 세포를 사용하면 종양 세포 주사 후 35 일 이내에 죽은 마우스가 안정적으로 생성됩니다. 원발 종양의 크기는 약 10 mm이고 ( 그림 1A 및
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토론
피하 조직 마우스 모델에서 전임상으로 입증 된 활동에도 불구하고, 대다수의 새로운 화합물은 임상 시험에서 실패하고 결코 클리닉에 도달하지 못합니다. 11 피하 마우스 모델의이 명백한 부족 정확하게 종양의 생물학 및 성장 패턴을 직접 원래의 장기에 종양 세포의 주입에 따라 동소 마우스 모델의 개발을 주도하고있다 시뮬레이션합니다.
Orthotopic 마우스 모델은 피하 모델보다 훨씬 정확하게 고형 종양의 생물학 및 보급을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 15 그러나, 주요 단점은 중공 기관뿐만 아니라 종양 성장의 기술적 요구 모니터링으로 특히 기술적으로 까다로운 장기 가난한 재현성이다. 따라서 우리의 모델에서는 반복 된 영상화 절차보다는 미리 정의 된 시점에서 종양의 크기에 초점을 맞추어 기술의 수를 제한했습니다정교하고 동물의 스트레스 검사를 위해. 여기에 설명 된 모델은 종양 세포주의 특성, 종양...
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 독일 연구 재단 (WE 3548 / 4-1)과 Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14)의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 배양 배지 및 구성 요소 | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ 매체 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ 매체 |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ 매체 |
| 페니실린/ 스트렙토마이신(PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ 배지 |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 2D 세포주의 기본 배지(DMEM/10% FCS) | |
| 태아 송아지 혈청(FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | 2D 세포주의 기본 배지(DMEM/10% FCS) |
| TrypLE Express 효소 해리 버퍼 | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel 기저 멤브레인 매트릭스 (BMM, 페놀 레드 프리) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75 cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| 세포 배양 플라스크 150 cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 mL, 50 mL 원심분리기 튜브 | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 카운팅 슬라이드 (TC20 카운팅 기계용) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| 파스퇴르 피펫 (유리, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | 를 사용하여 얇게 당깁니다 |
| . 원 | 발성 종양 조직 준비를 위한 | 130-093-235 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | 원발성 종양 조직 준비를 위한 |
| gentleMACS C 튜브 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | 원발성 종양 조직 준비를 위한 |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | 발성 종양 조직 준비를 위한 |
| 팔콘 70 &마이크로; 원 | 발성 종양 조직 준비용 | Corning B.V. Life Sciences | 352350 |
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| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | 피킹 버퍼 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | 피킹 버퍼 |
| 페니실린/스트렙토마이신(PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | 피킹 버퍼 |
| EDTA | Roth | 8040.1 | 피킹 버퍼 |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| >Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) 항체 클론 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM 면역조직화학 (그림 2C 참조) |
| HRP 토끼 항-마우스 IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM 면역조직화학(cf, 그림 2C) |
참고문헌
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