방법 논문

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

DOI:

10.3791/55357

⸱

2017년 7월 18일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

이 논문에서

요약

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우리는 마우스의 맹장에 종양 세포 또는 유기체를 주입하고이 모델에서 순환하는 종양 세포 (CTCs)를 분리하여 정형 적 대장 직장 종양의 형성을 기술합니다.

초록

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쉬운 적용 성과 비용 효율성이라는 장점에도 불구하고 피하 조직 마우스 모델에는 심각한 한계가 있으며 종양 생물학 및 종양 세포 보급을 정확하게 시뮬레이트하지 못합니다. Orthotopic 마우스 모델은 이러한 한계를 극복하기 위해 도입되었습니다. 그러나 이러한 모델은 기술적으로 까다로운 기관, 특히 대장과 같은 기관에서 요구됩니다. 신뢰할 수있게 성장하고 전이하는 균일 한 종양을 생산하기 위해서는 종양 세포 준비 및 주사의 표준화 된 기술이 중요합니다.

우리는 매우 균일 한 종양을 발생시키고 종양 생물학 연구 및 치료 임상 시험에 사용될 수있는 대장 암 (orthoreopic mouse)의 대장 암 모델 (CRC)을 개발했습니다. 원발성 종양, 2 차원 (2D) 세포주 또는 3 차원 (3D) 조직 종양의 종양 세포가 맹장에 주입되어 주입 된 종양 세포의 전이 잠재성에 따라 고도로 전이 된 종양을 형성합니다. 게다가,CTC는 정기적으로 발견 할 수 있습니다. 우리는 종양 보유 마우스로부터의 CTCs의 격리뿐만 아니라 외과 및 주사 기술뿐만 아니라 일차 종양 조직뿐만 아니라 2D 세포주 및 3D 유기체 모두로부터의 종양 세포 제조 기술 및 문제 해결을위한 현재의 팁을 기술한다.

서론

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Colorectal cancer (CRC)는 서구 국가에서 암으로 사망하는 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 차 종양은 종종 절제 할 수 있지만 1, 원격 전이의 발생은 극적으로 죽음에 이르게 종종 예후를 악화합니다. 2 , 3 전이의 생물학적 상관 관계는 종양에서 분리되어 순환하면서 생존하며 표적 기관의 상피에 부착하고 장기를 침범하여 궁극적으로 새로운 병변으로 자라는 순환하는 종양 세포 (CTC)입니다. CTCS이 예후 관련성, 5, 6, 7, 8의 것으로 알려져 있지만 (4), (9) 그 생물은 부분적 CRC에서의 극단적 인 희귀 한 결과로 이해된다. 10

마우스 모델은 강력한 기능입니다.암 생물학의 다양한 측면을 연....

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프로토콜

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여기에 제시된 동물 실험은 기관 및 정부 동물 관리 및 사용위원회가 독립적으로 검토 및 승인했으며 실험 동물 학회 연맹 (FELASA) 지침에 따라 실시되었습니다. 모든 가능한 조치는 마취 및 진통제, 또는 필요한 경우 조기 안락사를 비롯한 고통을 최소화하기 위해 취해졌습니다.

1. 세포 및 organoids의 준비

참고 : 각 주입마다 100,000 개의 셀을 사용하여 20 μL의 부피를 사용하십시오. 누출을 방지하고 표준화 된 주입을 보장하기 위해 기저막 매트릭스 (BMM)를 사용하십시오. 재현성있는 결과를 보장하려면 일정한 간격으로 세포주 인증 검정을 수행하십시오 ( 예 : STR 프로파일 링을 통해 ).

  1. 신선한 조직으로부터의 일차 세포 현탁액의 제조
    참고 : 항상 멸균 상태에서 작업하십시오. 신선도의 즉각적인 전달수술실에서 얼음으로 실험실로 옮겨진 조직은 세포의 높은 생존력을 보장하기 위해 필요합니다.
    환자의 건강과 최적의 치료가 항상 최우선 적이어야합니다. 따라서 연구를위한 조직 표본은 절제 된 종양의 병리학 적 후속 작업 및 스테이징을 방해하지 않는 방식으....

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결과

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이 모델에서 대장 암 종양의 성공적이고 재현성있는 생성은 유출이나 누출없이 세포의 정확한 주입에 결정적으로 달려 있습니다. 이것이 성취된다면,이 모델은 매우 신뢰할 만하 며, 인공 복막염을 유발하는 경우는 거의 없습니다. 종양의 성장 동력학 및 그것의 보급 패턴은 사용 된 유기체 및 세포의 생물학적 특성에 달려있다. HCT116 세포가 안정적으로이 모델에서 간으로 전이 15 일 동안, SW620 세포 형태 동소 종양,하지만 전이하지 않습니다. 15 명

이 모델에서 HCT116 세포를 사용하면 종양 세포 주사 후 35 일 이내에 죽은 마우스가 안정적으로 생성됩니다. 원발 종양의 크기는 약 10 mm이고 ( 그림 1A 및

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토론

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피하 조직 마우스 모델에서 전임상으로 입증 된 활동에도 불구하고, 대다수의 새로운 화합물은 임상 시험에서 실패하고 결코 클리닉에 도달하지 못합니다. 11 피하 마우스 모델의이 명백한 부족 정확하게 종양의 생물학 및 성장 패턴을 직접 원래의 장기에 종양 세포의 주입에 따라 동소 마우스 모델의 개발을 주도하고있다 시뮬레이션합니다.

Orthotopic 마우스 모델은 피하 모델보다 훨씬 정확하게 고형 종양의 생물학 및 보급을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 15 그러나, 주요 단점은 중공 기관뿐만 아니라 종양 성장의 기술적 요구 모니터링으로 특히 기술적으로 까다로운 장기 가난한 재현성이다. 따라서 우리의 모델에서는 반복 된 영상화 절차보다는 미리 정의 된 시점에서 종양의 크기에 초점을 맞추어 기술의 수를 제한했습니다정교하고 동물의 스트레스 검사를 위해. 여기에 설명 된 모델은 종양 세포주의 특성, 종양.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 독일 연구 재단 (WE 3548 / 4-1)과 Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
세포 배양 배지 및 구성 요소
Advanced DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ 매체
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ 매체
Glutamax-I Supplement (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++ 매체
페니실린/ 스트렙토마이신(PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ 배지
DMEMLife Technologies GmbH61965026 2D 세포주의 기본 배지(DMEM/10% FCS)
태아 송아지 혈청(FCS)BIOCHROM AGS 01152D 세포주의 기본 배지(DMEM/10% FCS)
TrypLE Express 효소 해리 버퍼Life Technologies GmbH12604021
Matrigel 기저 멤브레인 매트릭스 (BMM, 페놀 레드 프리)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red)Life Technologies GmbH25200072
6-/48-well plates with lidCORNING3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mLVWR International GmbH734-2066
세포 배양 플라스크 150 cm², 600 mLCorning B.V. Life Sciences355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL 원심분리기 튜브Greiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 카운팅 슬라이드 (TC20 카운팅 기계용)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
파스퇴르 피펫 (유리, 150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251를 사용하여 얇게 당깁니다
. 원발성 종양 조직 준비를 위한130-093-235
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753원발성 종양 조직 준비를 위한
gentleMACS C 튜브Miltenyi Biotec130-093-237원발성 종양 조직 준비를 위한
Human Tumor Dissociation KitMiltenyi Biotec130-095-929발성 종양 조직 준비를 위한
팔콘 70 &마이크로; 원발성 종양 조직 준비용Corning B.V. Life Sciences352350
NameCompany카탈로그 번호Comments
Surgical Equipment
SevofluraneAbbVie Germany GmbH & Co. KG-Medical
oxygenAir Liquide Medical
Temgesic-Bepanthen
- 안과 연고Bayer Vital GmbH
생리식염수 0.9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
1mL 주사기(데드 볼륨 없음) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
30G 주사 바늘BECTON DICKINSON304000
셀룰로오스 면봉Lohmann & Rauscher Deutschland13356
Micro-Adson 펜치FST - 파인 사이11018-12
Iris Scissor - ToughCutFST - 파인 사이언스 툴14058-11
Olsen-Hegar 바늘 홀더FST - 파인 사이언스 툴12002-12
AutoClip KitFST - 파인 사이언스 툴12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (외과용 봉합사)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
탁상용 연구 마취 기계(O2 플러시 및 세보플루란 기화기포함) Parkland ScientificV3000PS/PK
UltraMicro 펌프(Micro4 컨트롤러 포함제어된 이정소 주입을 위한UMP3-4
SYS-Micro4 컨트롤러용 풋스위치World Precision Instruments 15867고도로 제어된 정사소 주입을 위한 장비
3축 수동 미세조작기World Precision InstrumentsM325고도로 제어된 정사소 주입을 위한
장비 Micromanipulator용 마그네틱 스탠드World Precision InstrumentsM10고도로 제어된 정사소 주입을 위한 장비
M10 마그네틱 스탠드용 스틸 베이스 플레이트World Precision Instruments5479고도로 제어된 이정소 주입 장비
Hot Plate 062Labotectect13854
Isis - 면도기AESCULAP - Braun-Binocular
Surgical MicroscopeParkland ScientificVS-2Z
NameCompany<strong>카탈로그 번호Comments
CTC isolation
EDTARoth8040.1
밀도 구배 매체 – FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) 항체 클론 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) 항체 클론 G8.8BioLegend118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², VentGreiner bio-one628102
Fluorescence Cell Culture MicroscopeLeica
Transferman 4r MicromanipulatorEppendorf
CellTram AirMicromanipulator Dmz
단세포 흡인을 위한 마이크로 모세관 제조에 필요
PAP penAbcamab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169피킹 버퍼
Fetal Calf Serum (FCS)BIOCHROM AGS 0115피킹 버퍼
페니실린/스트렙토마이신(PenStrep)Life Technologies GmbH15140122피킹 버퍼
EDTARoth8040.1피킹 버퍼
NameCompany카탈로그 번호Comments
>Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) 항체 클론 9C4BioLegend324201EpCAM 면역조직화학 (그림 2C 참조)
HRP 토끼 항-마우스 IgGAbcamab97046EpCAM 면역조직화학(cf, 그림 2C)
분젠 버너 gentleMACS Dissociator MiltenyiBiotec 원 m 세포 여과기 GmbH-Buprenorphine 10047757 언스 도구 ) 고도로 장비 Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation에 연결된 Eppendorf 흡인 펌프Prism Glass Capillaries Dagan Corporation

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. ....

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