바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

요약

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

초록

Chromatin 대상으로 단백질의 바인딩 속성의 매우 chromatin의 복잡 한 본질 및 가장 포유류 chromatin 수정 복합물의 다른 유형의 자연 전하실 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복 하기 위해 우리 chromatin 바인딩된 단지의 상대적 바인딩 선호도 평가 하기 위한 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 적응 시켰다. 이 쉽고 간단 분석 결과 비 전문가 바인딩 두 관련된 복합물, 복잡 한 소 단위는 손실 또는 개별 도메인 비활성화의 선호도 변화 및 변화에의 선호도에 상대적 차이 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. chromatin 가로로 변경 후 바인딩 선호도입니다. 순차적으로 다시 소금의 양을 증가에 대량 chromatin 중단, 우리 chromatin에서 특정 단백질의 차입을 프로 파일링 할 수 있습니다. 이러한 프로필을 사용 하 여, 우리 chromatin 수정 복잡 한 변경 또는 변경 chromatin 환경에 미치는 바인딩 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 다른 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험에 SSE 결합해, 개별 도메인 및 다양 한 염색 질 환경에서에서 복잡 한 기능에 단백질의 역할을 확인할 수 있습니다 우리.

서론

진 핵 세포에서 DNA 규칙은 세포내와 세포 외 자극에 응답을 협조 하는 단백질의 구색에 의해 엄격 하 게 제어 하는 복잡 하 고 정교한 시스템 이다. DNA는 히스톤 octamers 느슨하게 DNA 따라 분포 하거나 꽉 코일¹로 압축 될 수 있는 형태로 nucleosomes 주변 감 쌌 다. DNA와 히스톤의이 구조 배열 읽기, 쓰기 및 지우기 히스톤²포스트 번역 상 수정 (PTM)는 단백질의 네트워크에 의해 통제 된다 chromatin로 알려져 있다. 일부 히스톤 PTMs, acetylation, 등 그들은 히스톤과 DNA²사이 상호 작용을 변경, 입금은 아미노산의 변경. 히스톤 PTMs 모집 transcriptional 레 귤 레이 터, chromatin remodelers, DNA 손상 복구 기계, 및 게놈³의 특정 지역에 DNA 복제 기계를 또한 제공 합니다.

대부분 방법 chromatin 상호 작용을 공부 하 고 작은 규모의 상호 작용을 조사 하거나 큰 게놈 넓은 분석을 포함 합니다. 바인딩 연구 생체 외에서 종종 전기 이동 기동성 교대 분석 실험....

프로토콜

1. 준비

1. 소형 솔루션 버퍼 a: 0.3 M의 준비 100 mL 자당, 60 m m KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 그리고 0.5 %NP-40. 스토어 4 º C.
   참고: 일부 셀 라인, HEK293T, 등 덜 엄격한 lysing 조건 필요합니다. 핵 lyse 쉽게를 사용 하 여 수정 버퍼 a: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 m m KCl, 5 mM MgCl ₂, 0.05 m m EDTA, 0.1 %NP-40, 및 10% 글리세롤.
2. 2 x mRIPA 솔루션의 250 mL 재고 솔루션을 준비: 100 mM Tris pH 8.0, 2 %NP-40, 그리고 0.5% 나트륨 deoxycholate.
3. 5 M NaCl 100ml 재고 솔루션 준비.
4. 1 x mRIPA 솔루션 50 mL 6 소금 농도의 각각에 대 한 준비 2 x mRIPA와 5 M NaCl 솔루션을 사용 하 여: 0 m m, 100 m m, 200mm, 300mm, 400mm, 및 500 mM NaCl. 실험을 시작 하기 전에 차가운 얼음에 모든 솔루션
5. 성장 세포 원하는 조건에서 라인.
   참고: 때 단백질 노크의 효과, 최저 라인에 대 한 SSE wildtype 셀에....

결과

이 논문에서는, 장점과 우리 문학⁶에서 적응 하는 일반적으로 사용 되 순차적 소금 추출 (SSE) 메서드의 응용 프로그램을 설명 합니다. 그림 1, 우리는 비-순차적으로 ARID1a와 PBRM1의 차입 패턴을 감지 하 여 단백질을 추출에 SSE의 재현성을 비교 합니다. 우리는 지속적으로 ARID1a, BAF 소 단위 NaCl 및 PBRM1, 독점적인 PBAF 소 단위 200mm에서 주로 elutes, 300 mM NaCl에서 주로 elutes 관찰 합니다. 그림 1a 는 8 백만 OVCA429 세포와 SSE의 3 개의 독립적인 복제를 보여줍니다. 그림 1b 묘사 비순차적 소금 추출 핵 2 백만 셀에서 절연 단일 소금 버퍼에 다시 중단 했다. 두 방법 ARID1a 200m.......

토론

소금 기사를 통해 chromatin와 단백질 상호 작용의 일반적인 고용 되어 수십 년^14,15; 그러나, 이것은 하지 되어 체계적으로 최적화 하기 전에 그것의 전체 유틸리티를 공개. 이 순차 방법 단백질 또는 환경을 변경 하는 때 chromatin 바인딩에 변화를 구별 하는 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. SSE 매우 적응 하 고, 최적화할 수 이며 중요 한 것은, 그것은 기술적으로 간단 하 고 특수 장비를 요구 한다. 시작 하기 전에 최적화 하는 데 필요한 핵심 요소는: 휴대폰 번호, 소형 버퍼 조건 및 부 화 시간을 시작.

휴대폰 번호의 가장 중요 한 점은 모든 샘플 사이 일관 되 다는 것입니다. BAF 단지에서 볼 때, 8 백만 셀을 사용 하 여 어떻게이 단지 바인딩됩니다;의 좋은 프로 파일 제공 그러나, 셀의 개수 (또는 버퍼의 양을) 관심.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨, 크리스탈 2.5 kg AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
설탕, 크리스탈 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
염화칼륨, 과립 500g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R) 베이스, 기본 표준 및 완충액, >=99.9%(적정), 결정질	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA(에틸렌디니트릴로) 테트라아세트산, 이나트륨염, 이수화물 125G AR(ACS)	Avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 기판, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES 완충액 용액 (1M)	Gibco	15630-080
염화마그네슘, 6-수화물, 크리스탈 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	5958-04
글리세롤, 1L	Amresco	0854-1L
DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g	Amresco	0613-100G
Eppendorf Research plus pipette	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R 냉장 마이크로 원심분리기	Eppendorf	5424 R
Secondary mouse IgG HRP linked	세포 신호	7076
보조 토끼 IgG HRP 관련	세포 신호	7074
BMI-1 항체	Millipore
PBRM1 항체	Bethyl	A301-591A
ARID1a 항체	Santa Cruz	sc-32761
BRD4 항체	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
독소루비신	AK Scientific	25316-40-9
디메틸 설폭사이드(DMSO)	Macron	4948-02
미니 트랜스 블롯 셀	BioRad	1703930
미니 젤 탱크	ThermoFisher	A25977
알부민, 소 (BSA)	Amresco	0332-100g	PBS-T에서 5 % 용액으로 웨스턴 블롯 차단 솔루션으로 사용
볼트 MOPS SDS 러닝 버퍼 (20x)	Life Technologies	B0001
볼트 LDS 샘플 버퍼 (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 - 250 kDa	ThermoFisher	26619
메틸 알코올, 무수	마크롱	3041-10
트립신 kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
SODIUM AZIDE, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 500g UN1325	Amresco	0227-500G
글리신, 전기 영동 용, > = 99 %	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌	VWR	20170-333
1000 &마이크로; L 피펫 팁	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris 프리 캐스트 젤 4-12 %	Invitrogen	NW04125BOX
Leupeptin Hemisulfate, 5 MG	RPI Research Products	22035-0.005	프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.
APROTININ, 10 MG	RPI 연구 제품	20550-0.01	프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.
PEPSTATIN A, 5 MG	RPI 연구 제품	30100-0.005	프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.
OVCA429 세포	: Karen, Cowden, Dahl의 선물. Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
HeLa 세포	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A 매체	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
최소 필수 매체(MEM), 분말	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA(100X) 비필수 아미노산	Gibco	11140-050
FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. 출처	Omega Scientific	FB-11
페니실린-스트렙토마이신 솔루션	Life Technologies	15140-122
글루타맥스	Life Technologies	35050-061
피루브산 나트륨	Life Technologies	11360070
VWR Power 출처	VWR	13-690-032

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