바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

Summary

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

Abstract

Chromatin 대상으로 단백질의 바인딩 속성의 매우 chromatin의 복잡 한 본질 및 가장 포유류 chromatin 수정 복합물의 다른 유형의 자연 전하실 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복 하기 위해 우리 chromatin 바인딩된 단지의 상대적 바인딩 선호도 평가 하기 위한 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 적응 시켰다. 이 쉽고 간단 분석 결과 비 전문가 바인딩 두 관련된 복합물, 복잡 한 소 단위는 손실 또는 개별 도메인 비활성화의 선호도 변화 및 변화에의 선호도에 상대적 차이 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. chromatin 가로로 변경 후 바인딩 선호도입니다. 순차적으로 다시 소금의 양을 증가에 대량 chromatin 중단, 우리 chromatin에서 특정 단백질의 차입을 프로 파일링 할 수 있습니다. 이러한 프로필을 사용 하 여, 우리 chromatin 수정 복잡 한 변경 또는 변경 chromatin 환경에 미치는 바인딩 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 다른 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험에 SSE 결합해, 개별 도메인 및 다양 한 염색 질 환경에서에서 복잡 한 기능에 단백질의 역할을 확인할 수 있습니다 우리.

Introduction

진 핵 세포에서 DNA 규칙은 세포내와 세포 외 자극에 응답을 협조 하는 단백질의 구색에 의해 엄격 하 게 제어 하는 복잡 하 고 정교한 시스템 이다. DNA는 히스톤 octamers 느슨하게 DNA 따라 분포 하거나 꽉 코일¹로 압축 될 수 있는 형태로 nucleosomes 주변 감 쌌 다. DNA와 히스톤의이 구조 배열 읽기, 쓰기 및 지우기 히스톤²포스트 번역 상 수정 (PTM)는 단백질의 네트워크에 의해 통제 된다 chromatin로 알려져 있다. 일부 히스톤 PTMs, acetylation, 등 그들은 히스톤과 DNA²사이 상호 작용을 변경, 입금은 아미노산의 변경. 히스톤 PTMs 모집 transcriptional 레 귤 레이 터, chromatin remodelers, DNA 손상 복구 기계, 및 게놈³의 특정 지역에 DNA 복제 기계를 또한 제공 합니다.

대부분 방법 chromatin 상호 작용을 공부 하 고 작은 규모의 상호 작용을 조사 하거나 큰 게놈 넓은 분석을 포함 합니다. 바인딩 연구 생체 외에서 종종 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 등온선 적정 열 량 측정, 형광 편광, 펩 티 드 pulldowns 등 분석 실험에서 히스톤 펩 티 드 또는 DNA 재조합 개별 도메인을 사용합니다. 이 분석 실험 일반적으로 개별 단백질 도메인에 초점을, 때문에 그들은 퍼즐의 작은 조각의 이해를 촉진 하지만 다중 단백질에서 협력 성격의 다중 도메인 단백질, 혼자 그들의 역할을 이해 하 고 우리를 허용 하지 않습니다. 단지입니다. 필연적인의 또 다른 레이어는 대부분 포유류 chromatin 수정 복합물의 이기종 구성에 의해 추가 됩니다. 이 단백질이 질 chromatin 프리의 동적 특성을 함께에서 하면 도전 하는 비보에 바인딩 chromatin 단백질의 상호 작용 chromatin 시험관을 정리 있습니다.

Vivo에서 방법을 만든 중요 한 발전; 그러나, 그들은 종종 비싼, 시간이 소모 및 기술적으로 도전입니다. 그러나 그것 요구 한다 상당한 최적화⁴chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (칩 seq) 이어서 전체 게놈, 단백질 및 히스톤 수정 현지화를 결정 하는 데 매우 유용 하다. 단백질 상호 작용; 보존 하는 chromatin 가교 화 들은 그러나,이 인공 상호 작용을 일으켜서 고⁵마스킹 epitope를 발생할 수 있습니다. 또한, immunoprecipitations (IP) 매우 특정 항 체와 DNA 전단 및 칩-정량은 종종 사용할 수의 선험적으로알려진된 바인딩 사이트를 사용 하 여 IP 조건의 광범위 한 최적화를 필요로 합니다. 칩 조건의 최적화, 후 샘플의 처리 비용이 많이 드는 고 시퀀싱 분석을 개월에 몇 주를 요구 한다. 이 방법은 유용 하지만 게놈, 비용에서 단백질 바인딩된 chromatin의 지역화를 식별 및 약속 시간을 작은 변화 글로벌 바인딩 속성에 영향을 미칠 수 있습니다 방법에 대 한 가설을 생성 하려면이 메서드를 사용 하 여 금지 .

이 문서에서 우리는 chromatin-바인딩 단백질의 글로벌 바인딩 프로필을 검토 하 고 단백질, 복잡 한, 또는 글로벌 PTM 프로필에 변경 상호 작용을 변경할 수 있습니다 어떻게 구별 하는 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 사용 하는 방법을 설명 합니다. 소금 기사는 일반적으로 광범위 하 게 사용된 하는 기술, 어떻게이 순차적 방법은 매우 재현 가능 하 고 다양 한 설명 합니다. SSE 특성을 어떻게 복잡 한 또는 심지어 단일 도메인의 단일 소 단위 대량 chromatin에 대 한 복잡 한의 전반적인 선호도에 기여 수 있습니다. SSE 경우 단백질의 바인딩을 영향을 변화 chromatin 풍경에 의해 칩 seq와 다른 게놈 넓은 연구를 사용 하 여 확인 될 수 있는 히스톤 마크 대상에 대 한 흥미로운 가설을 제공 하는 결정을 하기 위해 사용할 수 있습니다.

우리는 원래 적응이 방법에서 우 외., Polybromo1의 기능 검사 (PBRM1) PBAF chromatin remodeler^6,7의 바인딩에. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 PBAF chromatin 개장 하는 복잡 한 내에서 chromatin 바인딩에 대 한 PBRM1의 역할을 결정 하 고이 함수⁷에 6 개의 개별 bromodomains의 상대적 기여도 결정.

여기 우리가 화학 억제 물에 의해 단백질 chromatin에서의 변위를 검사를 다른 세포 유형, 단지, 수정 하는 비슷한 chromatin의 상대적 바인딩 선호도 평가에서 chromatin 바인딩 탐험이 방법을 최적화 하는 방법에 설명 하 고 chromatin 바인딩 chromatin 풍경에 변경 후의 효과 결정 합니다.

Protocol

1. 준비

1. 소형 솔루션 버퍼 a: 0.3 M의 준비 100 mL 자당, 60 m m KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 그리고 0.5 %NP-40. 스토어 4 º C.
   참고: 일부 셀 라인, HEK293T, 등 덜 엄격한 lysing 조건 필요합니다. 핵 lyse 쉽게를 사용 하 여 수정 버퍼 a: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 m m KCl, 5 mM MgCl ₂, 0.05 m m EDTA, 0.1 %NP-40, 및 10% 글리세롤.
2. 2 x mRIPA 솔루션의 250 mL 재고 솔루션을 준비: 100 mM Tris pH 8.0, 2 %NP-40, 그리고 0.5% 나트륨 deoxycholate.
3. 5 M NaCl 100ml 재고 솔루션 준비.
4. 1 x mRIPA 솔루션 50 mL 6 소금 농도의 각각에 대 한 준비 2 x mRIPA와 5 M NaCl 솔루션을 사용 하 여: 0 m m, 100 m m, 200mm, 300mm, 400mm, 및 500 mM NaCl. 실험을 시작 하기 전에 차가운 얼음에 모든 솔루션
5. 성장 세포 원하는 조건에서 라인.
   참고: 때 단백질 노크의 효과, 최저 라인에 대 한 SSE wildtype 셀에 비교 해야 합니다. 이러한 SSE는 병행 하 여 수행 되어야 합니다. 예제를 보려면 화학 억제제 또는 자극을 사용 하 여, 섹션 3-5을 참조 하십시오.

2. 기본 순차적 소금 추출

각

1. 수확 8 백만 세포 그리고 얼음 차가운 PBS의 5 mL로 두 번 세척.
   참고: 그것은 같은 수의 셀을 해당 단백질 농도가지고 중요 합니다. 세포의 정확한 수는 개별 셀 라인 또는 특정 단백질에 대 한 최적화 할 수 있습니다. 그건 중요 하지 너무 많은 단백질 농도 있는 증가 평형 바인딩에 따라 차입 곡선의 관찰을 하지 것 이다. 그러나, 너무 셀 수 충분 한 단백질, 곡선을 감지 하 고 chromatin 펠 릿은 어렵게 시키고 분수 사이 손실 될 수 있습니다.
2. 다시 버퍼 A의 1 mL + protease 억제제 셀을 일시 중단, 전송 1.5 mL 마이크로 원심 튜브, 그리고 10 분에 대 한 4 º C에서 하단에 회전 톱으로
3. 4 º C에서 5 분 동안 6000 x g에서 원심 분리 하 여 핵 분리.
   참고:이 단계 후 핵 여전히 해야 합니다 그대로. 핵 봉투 그대로 경우 펠 릿 다시 일시 중단 완전히; 그러나 때 봉투 lysed는 염색 질은, 펠 릿 하지 다시 일시 중단 합니다. 핵 봉투는 버퍼 A 부 화 후 그대로입니다, 사용 하 여 버퍼 A. 수정
4. 추가 200 µ L mRIPA 0 mM NaCl + protease 억제제 다시 펠 릿을 중단 하기 전에 각 핵 펠 릿을. 1 mL 피 펫과 15 번 pipetting으로 각 샘플을 균질. 그러나 펠 릿을 쉽게 중단 다시 한다,, 핵 pipetted는 고 샘플 및 끈 적 하 고 두꺼운 플라스틱 어렵다 될 것 이다 lyse 것입니다.
5. 펠 릿을 끝으로, 원심 분리기 튜브의 하단에 대 한 피 펫 팁의 끝을 가볍게 하기 위해
   . 일단 DNA는 핵에서 발표 하지만 pipetting 않으려고 그것을 깰 것 이다 펠 릿 완벽 하 게 분해 되지 것입니다
6. 때 샘플 균질 되었습니다, 모든 3 분 ice에 모든 샘플을 품 어
   참고: 보육 시간 관심사의 단백질에 따라 최적화 되어야 할 수 있습니다.
7. Centrifuging 6500 x g 4 º C에 3 분에 대 한 샘플 하 여 펠 릿 격리 chromatin.
8. 깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기를 전송 상쾌한 튜브. 이 0 mM 분수 될 것입니다. 이 0 mM mRIPA 솔루션 lysis로 세척 단계는 핵 역할 하 고 chromatin와 관련 되지 않은 모든 느슨한 단백질 제거 수.
9. 추가 200 µ L mRIPA 100 mM NaCl + protease 억제제 다시 펠 릿을 중단 하기 전에 각 chromatin 펠 릿을. 15 번 위아래로 펠 릿 pipetting으로 chromatin 펠 릿 헤어.
   참고:이 시간에 펠 릿 pipetted의 수와 일치 하도록 중요.
10. 3 분 동안 얼음에 품 어입니다. 이 인큐베이션 단계 여러 샘플 있을 때 특히 중요 하다는 평형 상태에 도달 하는 모든 샘플 수.
11. 4 º C와 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 전송 3 분 6500 x g에서 원심 분리기.
12. 나머지 소금 농도 대 한 2.6-2.10 반복.
    참고: 400 m m NaCl, 후 mRIPA 펠 릿 명확 하 고 효험이 고 튜브의 맨 아래에 유지 되지 않습니다. 펠 릿 절연 상쾌한 동안 원심 분리기 튜브의 뚜껑에 놓일 수 있습니다.
13. 단백질 로드 x 4의 추가 70 µ L 각 분수를 염색 하 고 서쪽 오 점 분석에 대 한 SDS 아크릴 아 미드 젤에 각 분수의 30 µ L 로드.
    참고: 단백질의 바인딩 프로필을 확인, 그것은 로드 로드 보다 lysate, 동등한 단백질 농도의 동일한 볼륨에 중요 한.
14. 표준 서쪽 오 점 막에 전송 하 여 수행 하 고 기본 항 체를 사용 하 여 관심사의 단백질에 대 한.
15. Quantitate는 chromatin에서 eluted 단백질을 적외선 형광 IRDye 2 차 항 체에 오와는 이미징 이미지 오 품 어. 개발의 다른 방법을 사용할 수 있습니다, 하는 동안 좋습니다 형광 또는 적외선 이미징, 그것은 자연에서 더 양적.
16. 사용 ImageJ 또는 유사한 소프트웨어 각 소금 농도에서 eluted 단백질에 대 한 강도 계산. 소금 농도 대 한 밴드 강도 그래프, 관심사의 단백질의 차입 패턴 확인할 수 있습니다.

3. 순차적 소금 추출의 존재는 " 리더 " 억제제

1. 셀 (4 백만)의 두 세트를 수확 하 고 표준 SSE에서 핵 분리.
2. 다시 mRIPA 0 m NaCl m의 200 µ L에 두 집합을 일시 중단 하 고 3 분 동안 품 어. 이것은 모든 무료 핵 단백질의 제거에 대 한 수.
3. 추가 200 µ L mRIPA 0 mM NaCl 각 펠 릿을. 컨트롤 집합을 하나의 샘플을 DMSO (1 mM (+) JQ1의 2 µ L) 억제제를 추가.
4. 동요는 펠 릿으로 15 번 pipetting 및 5 분 ice에 품 어
5. 4 º C와 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 전송 3 분 6500 x g에서 원심 분리기.
6. 모든 소금 농도 대 한 3.3-4를 반복 하 고 수행 하는 표준 서쪽 오 점.

4. 순차적 소금 추출의 존재는 " 작가 " 억제제

1. 억제제 (10 µ M 사)와 세포 치료 또는 3 h. 위해 DMSO
2. 각 치료에 대 한 4 백만 셀 수확.
3. 억제제 모든 버퍼에 추가 된 샘플에 대 한 표준 SSE 수행.

5. 순차적 소금 추출 다음 DNA 손상

1. 1 헤에 대 한 1 µ M 독 소 루비 셀 치료
2. 셀에 미디어를 변경 하 고 3 h. 위해 복구 하도록 허용
3. 8 백만 세포를 수확 하 고 기본적인 SSE 수행.

6. 비-순차 소금 추출

1. 12 백만 세포를 수확 하 고 PBS로 세척.
2. 분할 세포는 마이크로 원심 튜브 당 2 백만 셀.
3. 버퍼 A의 500 µ L에 다시 일시 중단 하 고 10 분에 대 한 품 어
4. 6000 x g.에서 원심 분리 하 여 핵을 분리
5. MRIPA 버퍼 + NaCl의 각각의 200 µ L에서 알 약을 다시 중단.
6. 1 mL 피 펫 팁 15 번 pipetting으로 각 샘플을 균질.
7. 3 분에 대 한 얼음에 품
8. 6500 x g에서 원심 분리 하 여는 chromatin를 분리 하 고 튜브를 청소 상쾌한 전송. 염료를 로드의 70 µ L을 추가 하 고 서쪽 오 점 분석에 대 한 SDS 페이지 젤에 30 µ L을 실행.

Results

이 논문에서는, 장점과 우리 문학⁶에서 적응 하는 일반적으로 사용 되 순차적 소금 추출 (SSE) 메서드의 응용 프로그램을 설명 합니다. 그림 1, 우리는 비-순차적으로 ARID1a와 PBRM1의 차입 패턴을 감지 하 여 단백질을 추출에 SSE의 재현성을 비교 합니다. 우리는 지속적으로 ARID1a, BAF 소 단위 NaCl 및 PBRM1, 독점적인 PBAF 소 단위 200mm에서 주로 elutes, 300 mM NaCl에서 주로 elutes 관찰 합니다. 그림 1a 는 8 백만 OVCA429 세포와 SSE의 3 개의 독립적인 복제를 보여줍니다. 그림 1b 묘사 비순차적 소금 추출 핵 2 백만 셀에서 절연 단일 소금 버퍼에 다시 중단 했다. 두 방법 ARID1a 200m...

Discussion

소금 기사를 통해 chromatin와 단백질 상호 작용의 일반적인 고용 되어 수십 년^14,15; 그러나, 이것은 하지 되어 체계적으로 최적화 하기 전에 그것의 전체 유틸리티를 공개. 이 순차 방법 단백질 또는 환경을 변경 하는 때 chromatin 바인딩에 변화를 구별 하는 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. SSE 매우 적응 하 고, 최적화할 수 이며 중요 한 것은, 그것은 기술적으로 간단 하 고 특수 장비를 요구 한다. 시작 하기 전에 최적화 하는 데 필요한 핵심 요소는: 휴대폰 번호, 소형 버퍼 조건 및 부 화 시간을 시작.

휴대폰 번호의 가장 중요 한 점은 모든 샘플 사이 일관 되 다는 것입니다. BAF 단지에서 볼 때, 8 백만 셀을 사용 하 여 어떻게이 단지 바인딩됩니다;의 좋은 프로 파일 제공 그러나, 셀의 개수 (또는 버퍼의 양을) 관심...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
염화나트륨, 크리스탈 2.5 kg AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
설탕, 크리스탈 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
염화칼륨, 과립 500g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R) 베이스, 기본 표준 및 완충액, >=99.9%(적정), 결정질	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA(에틸렌디니트릴로) 테트라아세트산, 이나트륨염, 이수화물 125G AR(ACS)	Avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 기판, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES 완충액 용액 (1M)	Gibco	15630-080
염화마그네슘, 6-수화물, 크리스탈 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	5958-04
글리세롤, 1L	Amresco	0854-1L
DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g	Amresco	0613-100G
Eppendorf Research plus pipette	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R 냉장 마이크로 원심분리기	Eppendorf	5424 R
Secondary mouse IgG HRP linked	세포 신호	7076
보조 토끼 IgG HRP 관련	세포 신호	7074
BMI-1 항체	Millipore
PBRM1 항체	Bethyl	A301-591A
ARID1a 항체	Santa Cruz	sc-32761
BRD4 항체	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
독소루비신	AK Scientific	25316-40-9
디메틸 설폭사이드(DMSO)	Macron	4948-02
미니 트랜스 블롯 셀	BioRad	1703930
미니 젤 탱크	ThermoFisher	A25977
알부민, 소 (BSA)	Amresco	0332-100g	PBS-T에서 5 % 용액으로 웨스턴 블롯 차단 솔루션으로 사용
볼트 MOPS SDS 러닝 버퍼 (20x)	Life Technologies	B0001
볼트 LDS 샘플 버퍼 (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 - 250 kDa	ThermoFisher	26619
메틸 알코올, 무수	마크롱	3041-10
트립신 kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
SODIUM AZIDE, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 500g UN1325	Amresco	0227-500G
글리신, 전기 영동 용, > = 99 %	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌	VWR	20170-333
1000 &마이크로; L 피펫 팁	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris 프리 캐스트 젤 4-12 %	Invitrogen	NW04125BOX
Leupeptin Hemisulfate, 5 MG	RPI Research Products	22035-0.005	프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.
APROTININ, 10 MG	RPI 연구 제품	20550-0.01	프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.
PEPSTATIN A, 5 MG	RPI 연구 제품	30100-0.005	프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.
OVCA429 세포	: Karen, Cowden, Dahl의 선물. Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
HeLa 세포	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A 매체	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
최소 필수 매체(MEM), 분말	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA(100X) 비필수 아미노산	Gibco	11140-050
FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. 출처	Omega Scientific	FB-11
페니실린-스트렙토마이신 솔루션	Life Technologies	15140-122
글루타맥스	Life Technologies	35050-061
피루브산 나트륨	Life Technologies	11360070
VWR Power 출처	VWR	13-690-032