Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

요약

여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.

초록

비판적으로 크기의 뼈 결함의 재건 복구, 충분 한 혈액 공급의 부족 하 고 새로운 조직의 괴 사를 일으키는 동안 가난한 신생 조직 엔지니어링 건설 기계 내에서 인해 심각한 임상 문제 남아 있다. 신속한 vascularization 새로운 조직의 생존 및 기존 호스트 조직 통합에 대 한 중요 한 전제 조건입니다. 맥 관 구조 건설 기계에서의 드 노 보 세대 뼈 재생 좀 더 효율적인, 수 있도록 복구를 발판으로 성장 하는 조직에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 이 문제를 해결 하려면 소재 비 계의 유전 수정 골 신생을 촉진 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 시각화 및 추적 vivo에서 실시간으로 3 차원 (3D) 건설 기계 또는 새로운 뼈 조직에 혈관 형성은 여전히 뼈 조직 공학에 대 한 장애물. Multiphoton 현미경 (MPM) 고해상도 및 최소한-침략 적 방식으로 생물학 구조에서 체적 데이터를 취득할 수 있는 새로운 바이오 이미징 양식 적임 이다. 이 연구의 목적은 multiphoton 현미경에 vivo에서 calvarial 중요 한 뼈 결함 수리에 대 한 유전자 변형된 3D-PLGA/nHAp 비 계에 신생을 시각화 했다. PLGA/nHAp 건설 기계 했다 공업화 신생을 촉진 하 고 뼈 재생을 향상 하려면 lentiviral 벡터 (LV-pdgfb)를 들고 성장 인자 pdgf b 유전자의 지속적인된 납품에 대 한. 비 계 이식 calvarial 중요 한 뼈에서 마우스 모델을 결함, PHp 건설 기계에서 혈관 영역 (BVAs) PH 건설 기계에서 보다 훨씬 더 높은 했다. 또한, pdgf b 와 신생 관련 유전자, vWF 및 VEGFR2의 식을 대응 하 게 증가 했다. MicroCT 분석 새로운 뼈 형성을 극적으로 향상 PHp 그룹에서 다른 그룹에 비해 표시. 우리의 지식, 이것은 multiphoton 현미경 조사는 3 차원 생물 분해성 scaffold에서 vivo에서 및 실시간으로 신생 뼈 조직 공학에 사용 되었다 처음으로.

서론

뼈는 개별¹의 수명 기간 동안 개장 하 고 매우 vascularized 조직 이다. 큰 뼈 결함 없앤 외상, 종양 절제, 또는 craniofacial 기형 발생의 신속 하 고 효과적인 뼈 재생 복잡 한 생리 적 과정 이다. 뼈 결함 수리를 위해 사용 하는 전통적인 치료 접근 포함 autograft와 이식 이식, 하지만 그들의 사용을 포함 여러 문제 및 제한 사항, 제한 된 가용성, 중요 한 기증자 사이트 병 적 상태, 감염의 위험이 높은 고 면역 거부^2,3호스트. 그러나, 인공 뼈 이식 이러한 제한을 완화 하는 효율적인 대안을 제공 합니다. 그들은 생 분해성 소재로 만들어질 수 있다, 적당 한 기 공 크기, 조작 하기 쉬운 하 고 유전자 변형된^4,5일 수 있다.

현재, 다양 한 조직 엔지니어링 건설 기계 조직 공학 뼈^6,7의 개발에 고용 되었다 있다. 뼈 수리 및 재생을 보다 효과적으로 유....

프로토콜

동물 보호 관리 및 사용의 실험실 동물의 광 동성에 대 한 가이드 준수 했다. 모든 절차는 감독 및 동물 연구, 심천 연구소의 첨단 기술, 과학의 중국 아카데미에 대 한 윤리 위원회의 승인 아래 수행 했다.

1. lentiviral (LV) 생산

Spe를 사용 하 여 세포 발기인의 하류

1. lentiviral 식 벡터 (pLenti6/5-eGFP 또는 LV eGFP)에 사용자 지정 다중 복제에 pdgf b cDNA 클론 사이트 나 고 샐 내가 pLenti6/5-PDGFB-eGFP 플라스 미드 (LV-pdgfb) ²⁵ 구성 제한 사이트.
2. 공동 바이러스 포장 플라스 미드 (pLP1, pLP2, 및 pVSV G)와 transfecting에 의해 HEK 293 피트 셀에서 lentiviral 입자 (LV-pdgfb)을 생산 클로로퀸과 인산 칼슘 표준 방법을 사용 하 여 (최종 농도: 25 µ M) ²⁵.
3. transfection의 48 h 후 수확 하 고 포함 하는 바이러스의 500 mL 필터링 필터 (0.45 μ m)와 표면에 뜨는. 그 후, ultracentri....

결과

원통형 다공성 PLGA/nHAp 투어 높이 0.6 m m와 4mm 직경에서 3D 프린터 조작 했다. 장비의 형태학 스캐닝 전자 현미경과 microCT를 통해 분석 되었다. 그림 1A 이식된 발판의 사진을 보여줍니다. MicroCT 검색 공개 숨 구멍의 85% 이상 크기 200에서 400 µ m (그림 1B)에 배열 했다. Sem의 영상 시연 발판의 표면 (그림 1의 D-F) 건설 기계 내부 상호 micropores (직경 약 5-10 µ m)와 거친 microtopography 했다. 코팅된 LV eGFP 입자의 총 금액의 약 40% (4.5 x 10⁵) 24 시간 이내 초기 버스트 효과 함께 시작 PLGA/nHAp 건설 기계에서 발표. 출시 LV 바이러스의 bioactivity 24 시간에 정상을 도달 하 고 지속적으로 감소, 1.......

토론

뼈는 지속적으로 치유 하 고 개별¹의 일생 내내 개장 독특한 용량 매우 vascularized 조직 이다. Vascularization의 레벨은 골 및 결함 수리를 위해 중요 하다. 낮은 vascularization 조직 공학 뼈의 넓은 임상 응용 프로그램을 제한합니다. 건설 biomimetics의 이론에 따르면 매우 vascularized 조직 공학 뼈 큰 세그먼트 뼈 결함을 복구 하기 위한 도구가 되고있다. 장비의 다양 한 종류는 비교적 작은 뼈가 있는 결함을 수리에 성공적으로 적용 되었습니다. 그러나, 중요 한 뼈 결함, 아직도 얼굴 장애물, 복구 장비의 응용 프로그램에 대 한 부족 한 혈액 때문에 주로 공급 결함 수리에 대 한. 따라서, 큰 뼈 결함 복구의 과정에서 혈액 공급을 개선 조직 공학의 주요 문제 중 하나입니다.

수 있는 자극, 모집, chemotaxis, 차별화, 그리고 ^{에 있는 neov.......}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA)	Sigma	P1941	L/G 비율 75:25, MW 66000-107000
하이드록시아파타이트 나노입자	시그마	702153	평균 직경 < 200 nm
클로로퀸 디포스페이트 염	시그마	C6628
FITC-conjugated 250-kD 덱스트란	시그마	FD250S
1,4-디옥산	링펑, 상하이		0.45 미크론
Stericup 필터	Merck Millipore Corporation	SLHV033RB
PDGF-BB Cdna	Sino Biological, Inc	MZ50801-G
Anti-PDGF-BB 마우스 다클론 항체	BioVision, Inc	5489-30T
PDGF-BB 재조합 단백질		4489-50
칼슘-인산염 형질주입 솔루션	Promega Corporation	E1200
L-DMEM	Hyclone	SH30021.01
DPBS	Hyclone	SH30028.01
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Thermo Fisher Scientific
15140122 FBS	Thermo Fisher Scientific	10099-141
Transwell	Corning	3422
남성 BALB/c 마우스	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
소듐 펜토바르비탈	Merck	1063180500
다광자 현미경 이			형광(TPEF) 및 2차 고조파 발생 신호(SHG)를 감지하기 위해 Shenzhen Institutes of Advanced Technology에서 만든 홈메이드입니다.
isoflurane	Keyuan, Shandong	401750169
TRIzol 시약	Invitrogen	15596018
PrimeScript RT 마스터 믹스 (Perfect Real Time)	Takara	RR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR036B
Hematoxylin 및 eosin	Beyotime	C0105
Paraffin	Leica& 주의;	RM2235
초원심분리기 OPtima L-100XP	Beckman Coulter	L-100XP
저온 프린터	칭화 대학교		만든 Tsinghua 대학교
LightCycler 480 기기	로슈	5815916001
microCT	Bruker	1176
상용 소프트웨어	Bruker
부프레노르핀

광자 여기 집에서