방법 논문

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석 체외 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

DOI:

10.3791/55390

⸱

2017년 4월 5일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기에서는 체외에서 중추신경계로의 림프구 전이를 조사할 수 있는 인간 혈액-뇌 장벽 모델에 대해 설명합니다.

초록

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중추 신경계 (CNS)에 넘쳐 림프구는 면역 감시 중요하다. 림프구의 혈관 외 유출의 질병 관련 변경은 CNS의 병태 생리 학적 변화 될 수 있습니다. 따라서, CNS에 림프구 이동의 조사 염증성 CNS 질환을 이해하고 새로운 치료 방법을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 체외 모델을 제시한다. 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포 (HBMEC)는 confluently 혈액 - 뇌 장벽의 내피를 모방 삽입 트랜스 웰 다공성 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 상에 성장된다. 배리어 기능 zonula occludens 면역, transendothelial 전기 저항 (티이)의 측정뿐만 아니라, 에반스 블루 투과 분석에 의해 확인된다. NK 세포를 -이 모델은 / 어두워 CD56 밝은 CD16으로 드문 림프구 아형의 diapedesis의 조사를 할 수 있습니다. Furtherm철광석, 다른 세포, 사이토 카인 및 케모카인, 질병과 관련된 변경, 및 림프구의 이동성에 대한 구별 능력 치료법의 효과를 연구 할 수있다. 마지막으로, 내피 장벽의 염증성 자극의 영향뿐만 아니라, 다른 치료법이 분석 될 수있다.

서론

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조직에 혈액에서 림프구 마이그레이션은 면역 감시 중요하다. 특정 분자 상호 작용의 시퀀스는 소장, 피부, 림프절, 중추 신경계 (CNS), 및 기타 조직으로 한 부위 특이 적 혈관 외 유출을 보장한다. 림프구 이동에 변화가 넓은 확산 질환이 다수의 병태 생리에 참여하고 있습니다. 면역 특권 CNS로 마이그레이션 단단히 통제 목적에 따라이 프로세스의 변화는 뇌척수염 3, 시신경 척수염, 뇌졸중, 및 다발성 경화증 (MS) 2, 4, 5, 6, 7과 같은 CNS 관련 질환에 관여한다. 따라서 더 나은 질병의 병태 생리를 이해하고 도구를 개발하는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 것이 중요하다 질병 부담이 8, 9,

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프로토콜

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1. 셀 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포의 문화 (HBMEC)

  1. 세포 배양 플라스크의 코팅
    1. 상기 피브로넥틴 용액을 제조 15 mL의 원심 분리 튜브에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 150 μL의 피브로넥틴을 넣고 잘 섞는다.
    2. 바닥을 덮는 T-25 세포 배양 물 플라스크 피브로넥틴 용액 2 mL를 넣고. 배양기에서 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 세포 배양 플라스크를 인큐베이션. 피브로넥틴 코팅 된 플라스크를 37 ℃ / 5 % CO 2에서 2 주 동안 저장 될 수있다.
  2. 시드와 HBMEC의 세포 배양
    1. 세포 배양 플라스크의 바닥에서 대기음 피브로넥틴 용액. 6 mL의 ECM-B 배지에 현탁하고 7.2 × 104 HBMEC / cm² 이상 추가 (= ECM-B는 5 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 %의 내피 세포 성장 보충 보충). 37 ° C / 5 % CO 2에서 인큐베이션. 현미경을 사용하여 매일 세포의 성장을 확인하십시오.
    2. 3 일마다 매체를 변경합니다.수확 또는 HBMEC 약 80 %의 합류에 도달 분할 세포. HBMEC 생리적 특성의 손실을 방지하기 위해 통로 (1) 및 (15....

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결과

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NK 세포 및 인간 혈액 - 뇌 장벽 모델 (도 1A)를 사용하여 T 세포의 서브 세트 윤회를 나타내는 대표적인 결과를 나타낸다. HBMEC 단층의 무결성은 단단히 접합 분자 ZO-1, transendothelial 전기 저항 (티이) 측정 및 에반스 블루 투과 (도 1b)의 염색에 의해 확인 하였다. 다음 3 - 사일 배양 HBMEC가 꽉 접합 분자 ZO-1 (왼쪽 그림 1B 등)를 표시했다. 또한 HBMEC (오른쪽,도 1b) 에반스 청색 transendothelial 전기 저항 (도 1b의 중앙)뿐만 아니라 감소 된 투과성을 나타내는 단층으로 성장했다. 및 CD56는 CD4 +와 CD8 + T 두 전직 등의 세포를 포함 CD16 + NK 세포 하위 집합 및.......

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토론

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여기서 우리는 인간의 혈액 - 뇌 장벽에 걸쳐 림프구의 윤회를 조사하기 위해 기술을 제시한다. 중추 신경계에 림프구 이동의 체외 분석에서 림프구의 혈관 외 유출, 잠재적 인 질병 관련 변경 및 새로운 치료 방법의 기본 프로세스를 연구하는 것이 중요하다.

혈액 - 뇌 장벽 모델의 몇 가지 수정이 가능합니다. 예를 들어, 상기 상부 구획으로부터 세포 이주되지 않은 세포 집단의 조성을 조사하기 위해 분석 될 수있다. 또한, 24 시간 전에 분석에 IFN-γ 및 TNF-α와 HBMEC 단층 치료 염증성 CNS 장애, 21, 25의 효과를 연구하기 위해 염증이 혈액 - 뇌 장벽을 모방하는데 사용될 수있다. 마찬가지로, 다른 물질과 HBMEC 또는 림프구의 치료는 림프구의 혈관 외 유출에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다 (예를 들어 자신을부착 분자.......

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공개 사항

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저자는 이 기사의 연구, 저자 및/또는 출판과 관련하여 다음과 같은 잠재적인 이해 상충을 선언했습니다. 및 U.B.는 재무 공개가 없습니다. TSH. Biogen으로부터 여행 및 회의 비용을 받았습니다. NS는 Biogen과 Novartis Pharma로부터 연사 및 자문위원회 사례금과 Biogen으로부터 여행 경비를 받았습니다. H.W.는 Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis 및 Sanofi-Genzyme의 과학 자문 위원회/운영 위원회에서 활동한 대가로 보상을 받았습니다. 그는 또한 Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis 및 Sanofi-Genzyme으로부터 연사 사례금 및 여행 지원을 받았습니다. 그는 Biogen, Merck Serono, Novartis 및 Sanofi-Genzyme에서 컨설턴트로 보상을 받았습니다. H.W.는 Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany 및 Sanofi US로부터 연구 지원을 받았습니다. C.C.G.는 Genzyme, Novartis Pharma GmbH 및 Bayer Health Care로부터 회의 참석에 대한 연사 사례금과 여행 경비를 받았습니다.

감사의 글

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이 연구는 Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress toward Tackling the Disease"(Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CaCl2 또는 MgCl2PBSGibco14190-094
에서 추출한SigmaF1141-5MG
Greiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
Penicillin/StreptomycinScienCell1001-b
내피 세포 성장 보충제ScienCell1001-b
TranswellCorning3472clear, 6.5 mm 직경, 3.0 & 마이크로; m 기공 크기
96웰 플랫 바닥 플레이트Corning3596
Evans 블루시그마E2129-10G원액: 1g/50mL PBS
B27Gibco17504-04450x 농축
Infinite M200ProTecan
96웰 블랙 플랫 바닥 플레이트Greiner BioOne675086
48웰 플레이트Corning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
유량 계수 형광구Beckman Coulter7547053
Na-EDTA시그마E5134
BSASigmaA2153
Gallios 10색 유세포 분석기Beckman Coulter
Kaluza 1.5aBeckman Coulter
TNF-&알파;Peprotech300-01A
IFN-&감마;Peprotech300-02
CD3-PerCP/Cy5.5Biolegend300430클론 UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692클론 N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330클론 3G8
CD4-FITCBiolegend300506클론 RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332클론 B9.11
Fibronectin 없이 소 혈장 T-25 세포 배양 플라스크

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-1....

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재인쇄 및 허가

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태그

CD56bright CD16dim NKTNF

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