바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

요약

이 작품에서는, 우리는 하이브리드 β-lactamase 기술에 따라 conductimetric 바이오 센서를 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 새로운 방법을 보고 합니다. 이 메서드는 β-lactams의 가수분해 시 양성자의 출시에 의존합니다.

초록

바이오 센서 병원 체 검출, 분자 진단, 환경 모니터링, 식품 안전 관리 등 다양 한 분야에서 점점 더 중요 하 고 구현 되 고 있다. 이러한 맥락에서 우리는 효율적인 기자 효소가 여러 단백질 단백질 상호 작용 연구로 β-lactamases를 사용. 또한, 강하게 펩 티 드 또는 구조적된 단백질/도메인의 삽입을 허용 하도록 그들의 능력 공상 단백질을 생성 하는이 효소의 사용을 권장 합니다. 최근 연구에서 우리 균 licheniformis BlaP β-lactamase에 단일 도메인 항 체 단편을 삽입. Nanobodies, 라고도 하는 이러한 작은 도메인 camelids에서 단일 체인 항 체의 항 원 묶는 도메인으로 정의 됩니다. 일반 이중 체인 항 체 처럼 그들은 높은 화력과 특이성 그들의 목표에 대 한 표시. 결과 공상 단백질 β-lactamase 활동을 유지 하면서 대상에 대 한 높은 선호도 전시. 이 nanobody 및 β-lactamase moieties 유지 기능 제안 합니다. 현재 작업에서 우리는 우리의 하이브리드 β-lactamase 시스템 바이오 센서 기술에 결합 하 여 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 특정 바인딩 대상에 nanobody의 효소의 촉매 활동 발표 양성자의 conductimetric 측정 덕분에 검색할 수 있습니다.

서론

바이오 센서는 바이오 분자 상호 변환기¹이라고 하는 물리적 또는 화학적 신호 장치를 결합 하는 분석 장치. 기록 된 신호 다음 해석 하 고 고정 및 무료 파트너 간의 상호 작용을 모니터링 변환할 수 있습니다. 바이오 센서의 대부분은 호르몬 등 다른 병원 체 마커²analytes를 검출 하는 항 체의 사용을 포함. 다른 센서 형식을 사용할 수 있습니다 하 고 질량, 자석, 광학 또는 전기 화학 바이오 센서를 포함 합니다. 후자는 가장 일반적으로 사용 되는 센서, 그리고 바인딩 이벤트를 전기 신호로 변환 하 여 작동. 공연 및 모든 항 체 기반 바이오 센서의 감도 기본적으로 두 개의 매개 변수에 강하게 의존: i)는 항 체와 ii)²신호 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 속성의 품질.

항 체는 2 개의 무거운 사슬과 2 개의 가벼운 사슬 구성 높은 분자 질량 dimeric 단백질 (150-160 kDa). 빛과 무거운 사슬 사이 상호 작용은 주로 소수 성 상호 작용 보존된 이황화 결합에 의해 안정 된다. 각 체인에는 본질적으로 보완 결정 영역 (CDR1-2-3) 라는 3 하이퍼 영역을 통해 항 원와 상호 작용 하는 변수....

프로토콜

1. 단백질 샘플 준비

1. 고 정화 하이브리드 단백질 BlaP-택시-Lys3로 우리의 이전 연구¹⁵에 보고 합니다. 50 m m 인산 버퍼 pH 7.4 다음 구성에서에서 단백질을 저장: 8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나₂HPO₄ 의 1.44 g, KH₂포₄ 증류수 800 mL에 용 해의 0.24 g 수정 전에 7.4 해결책의 pH 1 솔루션의 최종 볼륨을 조정 L. 필터 단백질 해결책 소독.
2. 암 탉 달걀 흰 lysozyme (HEWL) 재고 솔루션을 준비 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS 단계 2.1.1 참조) 10 mL에 상업적으로 구입한 HEWL의 100 밀리 그램 (40000 단위/mg)을 분해. 0.22 μ m 휴즈와 필터를 사용 하 여 여과 하 여 단백질 해결책 소독.

2. 바이오 센서 분석 실험

1. 솔루션 및 버퍼 준비
   1. 8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나₂HPO₄, 1.44 g 및 KH₂포₄ 증류수 8....

결과

설계 및 엔지니어링의 공상 단백질 BlaP-택시-Lys3

그림 1 균 licheniformis에서 BalP 클래스 A β-lactamase의 관대 한 루프에 택시 Lys3의 삽입을 나타냅니다. 삽입은 잔류물 Asp198와 Lys199 사이 수행 되었다. 트 롬 빈 분열 사이트 택시-Lys3의 각 측면에 도입 되었다. BlaP-택시-Lys3 공상 단백질 인코딩 구성 식 플라스 미드와 변형 세포 암 피 실린의 작은 농도 면 전에 서 성장 할 수 있었다. 이 결과 하이브리드 β-lactamase 제대로 접혀, 수용 성 이다 그것은 효율적으로 암 피 실린에 대 한 저항을 제공할 수 있는 박테리아의 periplasmic 공간으로 성공적으로 배설 될 수 있음을 나타냅니다. 우리는 더욱 우리의 공상 단백질의 bifunctionality 분석. 우리의 이전 연구에서 .......

토론

이 작품에서는 캐리어 단백질으로 BlaP β-lactamase를 사용 하 여 nanobody를 functionalize 하는 방법을 소개 하 고 우리는 우리가 성공적으로 구현할 수 결과 하이브리드 단백질 potentiometric 센서 분석 결과 보여. 다른 바이오 센서 분석 실험에 비해 우리의 작업의 주요 혁신 측면은 전기 신호를 생성 하는 효소 활동을 항 체 부분의 공유 결합. 이 소위 단백질 삽입 기술 선물 장점과 한계가이 섹션의 주요 초점이 될 것입니다.

하이브리드 β-lactamase 기술의 장점입니다.

Β-lactamases는 효율적인 효소
감도는 바이오 센서의 신호 대 잡음 비율에 영향을 주는 가장 중요 한 매개 변수 중 하나는 신호를 생성 하는 데 사용 하는 효소 활동입니다. 이러한 맥락에서 β-lactamases 여러 장점을 제시: 그들은 작은 (≈29 kDa), 단위체, 매우 안정, 그리고 더 중.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris– HCl	Roche	10812846001
EDTA	시그마-알드리히트	E9884
KCl	시그마-알드리히트	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-메르캅토에탄올	Sigma-Aldricht	M6250
알라닌	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysate	Sigma-Aldricht	22090
benzylpenicillin sodium	Sigma-Aldricht	B0900000
암탉 달걀 흰자 라이소자임	Roche	10837059001
헵탄	Sigma-Aldricht	246654
메탄올	Sigma-Aldricht	322415
수산화암모늄 용액	Sigma-Aldricht	380539	28% NH3  H2O에서, 두 배 증류법으로 순화하는 (집중하는?)
실험실 소모품
6-well plates	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meter	WTW	1AA110	Lab pH meter inoLab pH 7110
진공 및 여과 시스템	Nalgene	NALG300-4100	수신기 포함 필터 홀더, 유통업체 :
			및 동료 (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		중단, Autolab PGSTAT302N
디지털 멀티미터 성공, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		중단, 후속 Metrahit Base

Yunus