Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas
Summary
As propriedades antimicrobianas de metais como cobre e prata foram reconhecidas há séculos. Este protocolo descreve a ablação por laser pulsada em líquidos, um método de síntese de nanopartículas metálicas que proporciona a capacidade de afinar as propriedades dessas nanopartículas para otimizar seus efeitos antimicrobianos.
Abstract
O surgimento de bactérias resistentes a múltiplos fármacos é uma preocupação clínica global levando alguns a especular sobre o nosso retorno a uma era de medicamentos "pré-antibióticos". Além dos esforços para identificar novos fármacos antimicrobianos de pequena molécula, tem havido grande interesse no uso de nanopartículas metálicas como revestimentos para dispositivos médicos, curativos para feridas e embalagens de consumo, devido às suas propriedades antimicrobianas. A grande variedade de métodos disponíveis para a síntese de nanopartículas resulta em um amplo espectro de propriedades químicas e físicas que podem afetar a eficácia antibacteriana. Este manuscrito descreve o método de ablação a laser pulsada em líquidos (PLAL) para criar nanopartículas. Esta abordagem permite o ajuste fino do tamanho, composição e estabilidade das nanopartículas usando métodos de pós-irradiação, bem como a adição de surfactantes ou exclusores de volume. Ao controlar o tamanho e a composição das partículas, uma grande variedade de propriedades físicas e químicas da nanopa de metalPodem ser exploradas as partículas que podem contribuir para a sua eficácia antimicrobiana, abrindo assim novas vias para o desenvolvimento antibacteriano.
Introduction
As nanopartículas (NPs) são geralmente definidas como partículas que têm pelo menos uma dimensão com menos de 100 nm de comprimento. Os métodos tradicionais de síntese NP química geralmente requerem agentes redutores perigosos, como boroidridos e hidrazinas. Em contraste, a ablação a laser de alvos de metal sólido imersos em um meio líquido (ablação a laser pulsada em líquidos – PLAL) fornece uma rota ecológica para a síntese NP que satisfaz todos os 12 dos Princípios da Química Verde 1 , 2 . Em PLAL, um alvo de metal submerso é irradiado por pulsos de laser repetidos. À medida que o laser abla o alvo, uma pluma densa de aglomerados atômicos e vapor é liberada no meio líquido em que os NPs se juntam rapidamente. Os NP produzidos por PLAL são finamente dispersos em um meio aquoso e o tamanho, polidispersão e composição dos NPs podem ser facilmente controlados pela variação do líquido aquoso de ablação, bem como do laser parAmostras 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
As características das nanopartículas podem ser ajustadas ajustando uma série de parâmetros do laser, incluindo: fluência, comprimento de onda e duração do pulso (revisado na referência 7 ). A fluência do laser é calculada como a energia do pulso dividida pela área do ponto do laser na superfície do alvo. Os efeitos precisos da fluência sobre o tamanho e a polidispersão das NPs são algo controversos. Em geral, verificou-se que, para os sistemas de laser pulsado "longos" e "ultra-curtos", existem regimes de fluência baixos e altos que produzem tendências negativas e positivas de tamanho, respectivamente 8 , 9 , 10 , 11 . NP tamanho distributivoOs ons podem ser medidos empiricamente usando técnicas como dispersão de luz dinâmica e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), conforme descrito abaixo.
A escolha do comprimento de onda do laser pode afetar os mecanismos físicos pelos quais os NPs são formados. Em comprimentos de onda mais curtos (ultravioleta), os fótons de alta energia são capazes de quebrar as ligações interatômicas 12 . Este mecanismo de foto-ablação é um exemplo de uma síntese de NP de cima para baixo, porque resulta na liberação de fragmentos de material ultra-pequenos que tendem a produzir maiores amostras de polidispersão ao saciar no líquido de submersão 12 , 13 , 14 . Em contraste, a ablação do infravermelho próximo (λ = 1,064 nm) produz um mecanismo de síntese ascendente dominado pela ablação plasmática 12 . A absorção do laser pelo alvo libera elétrons que colidem com e, em seguida, livres, elétrons encadernados. Como cOllisions aumenta, o material é ionizado, inflamando assim um plasma. O líquido circundante limita o plasma, aumenta a sua estabilidade e aumenta ainda mais a absorção 12 . À medida que o plasma em expansão é extinto pelo líquido de confinamento, os NPs são condensados com várias geometrias 4 , 12 , 15 .
A escolha da duração do pulso do laser pode afetar ainda mais o processo de formação de NP. Os lasers de pulsação longa comumente usados, com durações de pulso superiores a alguns picosegundos, incluem todos os milímetros, micro, nano e alguns aeroses pulsados com picosegundo. Neste regime de largura do pulso, a duração do pulso do laser é maior do que o tempo de equilíbrio elétron-fonão, que é normalmente na ordem de alguns picosegundos 4 , 16 , 17 , 18 , 19. Isso resulta em vazamento de energia no meio de ablação circundante e na formação de NPs por mecanismos térmicos, como emissão termiônica, vaporização, ferver e derreter 1 , 20 .
A atividade antibacteriana dos NPs é fortemente influenciada pelo tamanho de partícula 21 , 22 , 23 , 24 . A fim de aumentar a redução de tamanho e a monodispersão, os NPs podem ser irradiados uma segunda vez usando um laser de um comprimento de onda perto da ressonância plasmática de superfície (SPR) do NP. A radiação laser incidente é absorvida pelo NP através da excitação do SPR. A fragmentação do NP pode ocorrer através da evaporação térmica 25 , 26 ou da explosão de Coulomb 27 , 28 . A fotoexcitação aumenta tA temperatura do NP acima do ponto de fusão, resultando no derramamento da camada externa da partícula. Verificou-se que a adição de agentes tais como polivinilpirrolidona (PVP) ou dodecilsulfato de sódio (SDS) à solução pode melhorar grandemente os efeitos pós-irradiação 5 . O impacto da adição de vários solutos foi descrito em vários relatórios 1 , 4 , 6 . A facilidade de manipulação de características de NP por PLAL oferece um novo método para desenvolver novos antimicrobianos baseados em NP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os efeitos antimicrobianos reproduzíveis das NPs requerem produção consistente de NP com tamanhos e concentrações semelhantes. Portanto, é fundamental padronizar os parâmetros do laser, incluindo fluência, comprimento de onda e duração do pulso. Embora a dispersão de luz dinâmica seja um método fácil e rápido para estimar o tamanho de NP, a quantificação precisa da distribuição de tamanho requer medição direta por TEM. Como cada raio laser tem características distintas em termos de perfil de modo e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (NSF premia CMMI-0922946 a DB, CMMI-1300920 a DB e S.O'M., E CMMI-1531789 a S.O'M., DB e EAK) e um Busch Biomedical Research Grant para EAK e S.O'M.
Materials
| Nanosecond Nd:YAG laser | Ekspla | NL303 | |
| Motorized xy scanning stage | Standa | 8MTF | |
| UV-VIS spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | |
| Dynamic light scattering unit | Malvern | Zetasizer ZS 90 | |
| Microbalance | Maktek | TM 400 | |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM 902 | |
| Silver foil target | Alfa Aesar | 12127 | |
| 250 mm focal length lens | Edmund Optics | 69-624 | |
| Copper TEM grids | Pacific Grid-Tech | Cu-400LD | Lacey/thin film coated grid |
| E. coli MG1655 | ATCC | 47076 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP3581 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214010 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-100 | |
| Stainless steel disc (for ablation stage) | Metal Remnants, Inc. | N/A | 1.5 inch diameter, 16 gauge |
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540G | |
| Magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-57 | |
| Magnetic stir plate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Laser energy and power meter | Coherent | 1098579 | |
| Carbon tape | Shinto Chemitron Co. Ltd. | STR Tape | |
| Sonicating water bath | Branson | 1510 | |
| Air compressor | GMC | Syclone 3010 | For drying ablation target |
| 75 mm focal length lens | Edmund Optics | 34-096 | Focusing lens for post-irradiation |
| Quartz cuvette | Precision Cells Inc | 21UV40 | 50 mm light path (for post-irradiation) |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Light microscope | Nikon | 50i | This microscope is used to focus the laser on the ablation stage. This particular model is no longer available, but any light microscope with a 4X objective will work. |
| CCD camera | AmScope | MT5000-CCD | |
| Micrometer slide | Ted Pella | 2280-70 |
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