방법 논문

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

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⸱

DOI:

10.3791/55417

⸱

2017년 3월 24일

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

이 논문에서

요약

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

초록

면역 시스템에 의해 항원 성 에피토프의 확인은 백신 펩타이드 약물의 개발을 용이하게 할 수있다 중화 항체의 보호 메커니즘을 이해할 수있다. 펩티드 스캐닝 노골적 모노클로 날 항체 (단클론 항체)에 의해 인식되는 선형 에피토프를 맵핑하는 간단하고 효과적인 방법이다. 여기에서, 저자는 중화 단클론 항체를 이용하여 신경 괴사 바이러스 코트 단백질의 항원 인식 직렬 절두 재조합 단백질, 합성 펩티드 설계, 도트 블롯 혼성화를 포함하는 에피토프의 결정 방법을 제안한다. 이러한 기술은 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 합성 펩티드 및 모노클로 날 항체의 도트 블롯 하이브리드 화에 의존한다. RG-M56 단클론 항체에 의해 인식 바이러스 외피 단백질 항원의 최소 영역은 6 량체 펩티드 에피토프에 펩티드 맵핑을 트리밍 단계별로 좁힐 수있다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 및 잔여 서브stitution는 에피토프를 구성하는 각각의 아미노산 잔기의 중요성 결합을 특징으로 수행 될 수있다. 에피토프 부위를 플 랭킹 잔기가 펩타이드 형태의 조절에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 동정 된 에피토프 펩티드는 X- 선 회절 연구 및 기능적 경쟁 또는 치료학 대한 에피토프 펩타이드 - 항체 복합체의 결정을 형성하는데 사용될 수있다.

서론

면역계에서 V, D, 및 J 세그먼트의 재조합 항체는 병원균 감염으로부터 숙주를 보호하는 다양한 항원 결합에 대해 상보성 결정 영역 (CDR을)의 상당한 변화를 생성 할 수있다. 항원에 대한 항체의 중화 방어 항체의 CDR을하고 항원의 에피토프 사이의 공간 상보성에 따라 달라집니다. 따라서이 분자의 상호 작용에 대한 이해는 예방 백신 디자인과 치료 펩티드 약물 개발에 도움이 될 것입니다. 그러나,이 중화 상호 작용은 단일 항원 여러 항원 도메인 의해 결과적 에피토프 결정 처리는 더 복잡하게 항체의 복수 개의 CDR에 의해 모두 영향을받을 수있다. 다행히도, 골수종 세포와 개별 항체 생산 세포를 하이 브리 도마 융합 기술의 개발은, 초 셀 끊임없이 나누어 배치 허용모노클로 날 항체 (단클론)로 알려진 하나의 특정 항체 RETE 1. 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항원 항원의 한 영역에 결합하는 이들의 순수한 고 친 화성 모노클로 날 항체를 생산한다. 확립 된 항원 - 항체, 펩티드 주사 등 여러 방식의 관계를, 그 대응하는 단클론 항체를 이용하여 항원의 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수있다. 합성 펩타이드 기술의 최근 발전은 펩타이드 스캐닝 기술은 더 접근하고 수행하는 것이 더 편리 만들었습니다. 간단히, 중복 합성 펩티드의 세트는 표적 항원 서열에 따라 제조되고, 단클론 혼성화 고체지지 막에 관련된다. 펩티드 스캐닝 영역을 결합 항체를 맵핑하는 간단한 방법을 제공하지만, 또한 에피토프 펩티드 각각 AA 잔기 및 항체의 CDR의 결합 상호 작용을 평가하기 위해 잔류 검사 또는 교체를 통해 아미노산 (AA) 돌연변이를 용이 아닙니다.

여기서, 본 연구에서는 중화 단클론 2, 3, 4를 이용하여 노란색 그루퍼 신경 괴사 바이러스 (YGNNV) 외피 단백질의 선형 에피토프의 효율적인 식별을위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 단클론 항체 제조, 건설, 직렬로 절단 된 재조합 단백질의 발현, 합성 중복 펩티드 디자인, 도트 오 하이브리드, 알라닌 검색 및 치환 돌연변이를 포함한다. 펩티드 합성의 높은 비용을 고려하면, 연속적으로 소망하는 목적 단백질의 재조합 단백질을 절단하는 단계는, 수정하고, 합성 펩티드 배열 도트 블롯 분석이 수행되기 전에 항원 성 영역은 약 100 내지 200 AA 잔기 좁혀졌다.

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프로토콜

단일 클론 항체의 1. 준비

  1. 배양 5 % CO 2 보충 37 ºC에서 175T 플라스크에서 무 혈청 배지에서 RG-M56 마우스 단클론이 하이 브리 도마 세포. 매체의 색상은 배양 5 일 후 노란색으로 바뀌면 뜨는를 수집합니다.
    주 : 하이 브리 도마 세포를 소 태아 혈청으로부터 항체의 오염을 피하기 위해, 무 혈청 배지에서 배양 하였다.
  2. 4 ºC에서 30 분 동안 4,500 XG에 뜨는을 원심 분리기와 세포 파편 펠렛을 폐기합니다.
  3. 5 mL의 컬럼 (50 % 슬러리로 제공) 단백질 G 아가로 오스의 2 mL를 넣고 얼음처럼 차가운 PBS의 10 수지 볼륨 (10 mL)로 평형.
  4. 항체 상층 액의로드 200 ㎖ 칼럼 상 (단계 1.2) 및 통과를 폐기합니다.
  5. 그것을 씻어 칼럼에 얼음처럼 차가운 PBS의 10 ML을 추가합니다. 두 번 반복합니다.
  6. 단백질 G-관련된 항체를 용출 컬럼에 50 mM의 글리신, 산도 2.7의 10 ML을 추가합니다. 안부[선택] 배 중화 완충액 100 μL (1 M 트리스, 1.5 M의 NaCl, 및 1 mM의 EDTA, pH를 8.0)를 함유하는 마이크로 원심 튜브에 900 μL 분획.
  7. -20 ºC에서 0.03 % NaN의 3 50 % 글리세롤에서 정제 된 항체를 저장합니다.

2. 건설 및 직렬로 잘린 재조합 단백질의 발현

  1. (10 배의 Pfu 완충액 5 μL, 각각의 dNTP, 0.2 mM의 0.2 μM 정방향 프라이머 3, 0.2 μM 역방향 프라이머 3, 2 mM의 황산, pET20b-1A59 3 플라스미드 DNA 1 NG 및 2.5 U : PCR 반응 혼합물을 제조 부)의 Pfu DNA 중합 효소; 50 μL의 최종 볼륨 O DDH 2를 추가합니다.
    1. 자동 열 자전거 타는 사람에 실행 샘플 다음 매개 변수를 사용하여 : 사이클 1 (5 분 94 ° C); 사이클 2-36 (30 초 94 ºC, 30 초 63 ºC, 60 초 동안 72 ° C); 사이클 37 (7 분 72 ° C).
  2. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 다음 제한 효소 절단을 용이하게하기 위해 PCR 정제 키트 (5)를 사용하여 제품을 추출한다.
  3. 이니까 I 및 I을 XhoI 제한 효소로 PCR 증폭 된 DNA 단편을 Nde I 소화하고을 XhoI 효소 절단 된 애완도 20b (+) 벡터에 이러한 DNA 단편을 각각 결찰. 대장균 DH 5α-6-적격 세포로 구조 변환.
    1. 소화 버퍼 소화 혼합물을 제조 (20 mM 트리스 - 아세테이트, 10 mM의 마그네슘 (CH 3 COO) 2, 50 mM의 KCH 3 COO, 1 mM의 DTT, pH를 7.9)으로 한 PCR 증폭 된 DNA 또는 애완 동물 (20b)의 μg의 이니까 I 및 I을 XhoI 제한의 (+) 벡터 DNA 및 2 U 20 μL의 최종 부피 효소.
    2. 부드럽게 소화 혼합물을 혼합하고 신속하게 스핀 다운. 제한의 완전 절단 앉아 보장하기 위해 건조 욕조에 2 시간 동안 37 ºC에서 품어에스.
    3. 다음 플라스미드의 구축을 용이하게하기 위해 PCR 정제 키트 (5)를 이용하여 제한 효소 소화 DNA 단편을 추출 하였다.
    4. 결찰 완충액 결찰 혼합물을 준비한다 (66 mM 트리스, 5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 ATP, 5 mM의 DTT, pH를 7.5) predigested, PCR 증폭 된 DNA 100 ng를, predigested 애완 20B 10 NG와 (+) 벡터 DNA, 10 μL의 최종 부피의 5 U T4 DNA 리가.
    5. 부드럽게 결찰 혼합물을 혼합하고 신속하게 스핀 다운. 수조에서 18 시간 동안 16 ºC에서 품어.
    6. 지명 타자-5α-유능한 세포 100 μL에 결찰 샘플의 10 μL를 넣고 30 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 배치하기 전에 가볍게 섞는다. 열 충격 (7)을 유도하기 위해 90 초 동안 42 ºC에서 건조 욕조에 microcentrifuge 관을 넣습니다. 즉시 2 분 동안 얼음에 튜브를 전송합니다.
    7. 0.5 % 박토 효모 extrac 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 (1 % 박토 트립 톤의 900 μL를 추가튜브에 t, 0.5 % 염화나트륨, pH를 7.0). 150 rpm으로 45 분 동안 진탕 37 ºC에서 품어. 10 분 동안 4000 x g에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다.
    8. LB의 국물의 50 μL와 펠렛을 재현 탁하고 100 μg의 / ML의 암피실린을 포함하는 미리 예열 LB 플레이트에 각각의 변환을 확산. 16 시간 37 ºC에서 번호판을 품어.
    9. 200 μL 팁을 사용하여 단일 콜로니를 선택하고 느슨하게 덮인 15 mL의 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 3 ㎖의 LB의 국물에 배치합니다. 150 rpm으로 12 시간 동안 진탕 37 ºC에서 품어.
    10. 각 문화 플라스미드 DNA (8)을 추출하고 순서 9를 확인 T7 프로모터 및 T7 터미네이터 프라이머를 사용하여 시퀀스.
  4. 서열 확인 후, 이러한 애완 동물 20B에서 DNA 10ng의 (+) 회사에 의해 대장균의 BL-21 (DE3) 균주에 YGNNV 코트 단백질 유전자의 다양한 길이를 가진 플라스미드를 변형열 쇼크 방법 7 보내고. 단계에 따라 2.3.6-2.3.8 변환을 수행 할 수 있습니다.
  5. 느슨하게 덮인 15 mL의 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 3 ㎖의 LB의 국물로 각각 형질 전환 된 대장균 BL-21 세포에서 하나의 식민지를 전송합니다. 150 rpm으로 흔들면서 37 ºC에서 문화를 품어.
  6. 배양액의 OD (600)는 약 0.6 일 때 25 ºC로 배양을 냉각시키고, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 0.4 mM의 최종 농도로 IPTG를 추가한다. 200 rpm으로 흔들면서 25 ºC에서 추가로 4 시간 동안 문화를 품어.
  7. 미세 원심 관에 문화의 한 ML을 전송합니다. 1 분 12,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다.
  8. 마이크로 피펫 최대 피펫 팅 다운 변성 완충액 100 μL (8 M 우레아, 20 mM 인산 나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH 7.4의)에서 세포 펠렛을 재현 탁. 활발한 텍싱에 의해 섞는다.
    참고 : 샘플 졸용액 사용은 이제 도트 오 하이브리드 분석을 위해, 반투명 약간 끈적하고 준비해야한다.

겹치는 펩타이드 3. 설계 및 합성

  1. 디자인 및 각 도트 블로 팅에 의해 RG-M56 단클론 항체의 에피토프 영역을 좁힐 수있는 YGNNV 코트 단백질의 195-338 AA 지역에서 10 AA 잔류 물에 의한 후속과 겹쳐 3 직렬 20 머 펩티드를 합성.
  2. 설계 및 합성 3 세 8 머 펩티드 (202 195 VNVSVLCR, 197 VSVLCRWS 204, 199 VLCRWSVR 206) 다음의 합성 펩티드 상 6 AA 잔류의 중복과 도트 블로 팅에 의해 195-206 금주의 에피토프 영역을 좁힐 수 있습니다.
  3. 디자인과 3 ~ 7 머를 합성 (196 NVSVLCR 202, 195 VNVSVLC 201), 6- 메르 (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC (201), 1을 최소화하기 위해 자신의 이웃 펩티드 상에 각각 6, 5의 중복, 4 AA 잔류, 97 VSVLCR 202), 5 머 펩티드 (202 195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, 198 SVLCR) 도트 블로 팅에 의해 에피토프 영역입니다.

4. 도트 오 하이브리드

  1. 10 mg / ml의 최종 농도로 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 각 합성 펩티드를 녹인다.
    주 : 합성 펩티드의 용해도 변화를 극복하기 위해, 모든 합성 펩티드를 DMSO에 용해한다. DMSO 완전히 소수성 또는 친수성 펩티드를 용해하는 양 용매이다.
  2. 2 분 동안 메탄올과 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 담근다.
    주 : PVDF 막은 DMSO에 내성이 100 %까지이다; 다른 사람들은 그렇게하지 않을 수 있습니다.
  3. 수정 Towbin 버퍼 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.3) 용으로 PVDF 막 평형2 분.
    주 : ~ 20 % (V / V)의 메탄올는 전송 결과를 개선하기 위해 수정 Towbin 완충액에 첨가 할 수있다.
  4. 개질 Towbin 완충액 크로마토 종이를 헹군다. 크로마토 그래피 종이 위에 PVDF 막 놓습니다. 수정 Towbin 버퍼가 다음 단계를 계속하기 전에 PVDF 막 표면에서 사라질 때까지 기다립니다.
  5. 10 μL 팁으로 막에 각각의 펩타이드 샘플 2 μL를 추가합니다. 10 분 동안 크로마토 그래피 용지에 PVDF 멤브레인을 공기 - 건조. 지나치게 확산을 방지하기 위해 막에 천천히 그리고 점차적으로 각 펩타이드 샘플을 추가한다.
  6. 부드러운 흔들림 실온에서 30 분 동안 5 % 탈지 우유 TBST 버퍼 막 (0.05 % (v / v)의 트윈 20, 20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.4) 차단.
  7. 막에 5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼에서 1000 : 1의 최종 희석에 RG-M56 단클론 항체를 추가합니다. 부드러운 흔들림과 1 시간 동안 37 ºC에서 막을 품어.
  8. 그래서 항체를 제거lution. 부드러운 흔들림 5 분 동안 TBST 버퍼에 막 씻으십시오. 두 번 반복합니다.
  9. 멤브레인을 5 % 탈지 우유 TBST 버퍼에서 5000 : 1의 최종 희석 차 항체 (염소 항 - 마우스 IgG, 된 Fc 공액 알칼리성 포스파타제)을 추가한다. 부드러운 흔들림과 1 시간 동안 37 ºC에서 막을 품어.
  10. 항체 솔루션을 폐기하십시오. 부드러운 흔들림 5 분 동안 TBST 버퍼에 막 씻으십시오. 두 번 세척 단계를 반복합니다.
  11. 어둠 속에서 15 분 동안 실온에서 BCIP / NBT 기질 용액으로 막을 개발. 신호가 나타날 때 DDH 2 O로 막을 세척하여 현상을 중지합니다.
  12. 멤브레인을 공기 - 건조 이미지 시스템을 사용하는 도트 블롯 이미지를 캡처.
  13. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 3 점 블롯의 강도를 측정한다.

5. 알라닌 스캐닝 및 교체

  1. 디자인과 3 알라닌과 methi을 합성onine 대체 펩티드. VAVSVLCR (202), (195) VNASVLCR (202), (195) VNVAVLCR (202), (195) VNVSALCR (202), (195) VNVSVACR (202), (195) VNVSVLAR (202) 8 메르 펩타이드 195 VNVSVLCR 202 알라닌 각각 AA 잔류 물을 교체하고 합성 펩타이드 195 ANVSVLCR 202, 195, 195 VNVSVLCA (202) . SJNNV 유전자형 에피토프 펩타이드 195 VNVSVMCR (202)를 만드는 메티오닌하는 AA 잔류 류신 (200)를 교체합니다.
  2. 알라닌 검색 및 치환 돌연변이가 블로 팅 도트 수행하기 위해 제 4 절을 따르십시오.

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결과

이 실험의 목표는 단클론 항체를 이용하여 블롯을 통해 도트 에피토프를 확인 하였다. 신속하고 효율적으로 단클론 항체에 의해 인식되는 항원 영역을 좁히기 위해, C 말단에 6xHis 융합 태그의 전체 길이와 직렬로 절단 YGNNV 재조합 코트 단백질은 대장균 PET 발현 시스템 (10) (도 1a)에서 발현되었다. 생성 된 재조합 단백질은 도트 블롯 혼성화를 위해 RG-M56 단클론 항체 및 항 6xHis 항체를 이용하여 PVDF 막에 발견되었다. 도트 블롯은 1-338 AA (전체 길이), 51-338 AA 및 195-338 aa는 있지만 1-100 AA 또는 1-200 aa는 재조합 단백질 (그림 1B)에 대해 긍정적 인 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. 도트 배열 항 6xHis 항체에 대해 혼성화 모든 재조합 단백질 발현을 확인 하였다. 이러한 데이...

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토론

이 프로토콜은 단클론 항체 인식 선형 에피토프를 확인하기위한 신속하고 간단한 기술을 제공한다. 고려 펩티드 합성 및 합성 펩티드의 생산 효율의 비용을 고려하여 바이러스 코트 단백질의 항원 성 영역은 펩타이드 주사 분석 전에 연속적으로 절단 재조합 단백질 발현을 감소시켰다. 50-10 사이의 분자량이 kDa의 재조합 단백질은 쉽게 시스템을 통해 표현 될 수 있으므로 따라서, 안정적이고 효율적인 E. 콜라이 애완 동물 발현 시스템이 순차적으로 절단 된 재조합 단백질을 생산하는 데 사용되었다. 이러한 방식으로, 에피토프는 쉽게 관리하기 100~200 AA 영역까지 좁아 질 수있다. 그것은 제조 6xHis 태그 융합 단백질 허용 6xHis-태그의 발현에 대한 코드의 발현을 확인하기 위해 항 6xHis 항체를 사용 immunodetected되도록하는 서열을 함유로서 애완 동물 (20B) (+) 벡터를 구체적으로 선택되었다 재조합 페이지roteins. 생성 된 재조합 코트 단백질은했다 도트 블롯 혼성화 분석을 통하여 RG...

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공개 사항

저자는 이 보고서와 관련하여 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 펩타이드 합성과 DNA 염기서열 분석에 대한 전문 지식을 제공해 준 Academia Sinica의 세포 및 유기체 생물학 연구소(ICOB) 핵심 시설의 Miss Ching-Chun Lin과 Miss Diana Lin에게 각각 감사를 표합니다. 이 연구는 Academia Sinica의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
하이브리드-SFM 매체Gibco12045-076
Dulbeccos의 Phophate-Buffered Saline (PBS)Gibco21600-069
Pfu DNA 중합효소 써모 사이언티픽 EP0502 버퍼 포함
T4 DNA LigaseRoche10799009001완충액
포함 NdeI New England BiolabsR0111S완충액
XhoI New England BiolabsR0146S완충액
포함 pET-20b(+) 벡터Novagen, Merck Millipore69739
E. coli DH-5α 유능 세포RBC BioscienceRH617
E. coli BL-21(DE3) 유능 세포RBC BioscienceRH217
암피실린Amresco0339-25G
LB 육수 Invitrongen12780-052
이소프로필티오-&베타;-D-티오갈락토시드 (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
메탄올Merck Millipore106009
폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노라우레이트(트윈-20)J.T.BakerX251-07
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마D2650
글리신Amresco0167-5KG
트리스Affymetrix, USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
글리세롤Amresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment 항체Jackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (폴리비닐리덴 플루오라이드, PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
Protein G Agarose Fast FlowMerck Millipore16-266
QIAquick PCR 정제 키트,Qiagen28106
UVP, BioSpectrum 600 이미지 시스템UVP해당 사항 없음
VisionWorks LS 분석 소프트웨어 Ver 6.8UVP해당 없음
MyCycler thermal cyclerBioRad1709713
,

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