이 프로토콜은 생체 재료를 사용하지 않고 심장 조직의 3D bioprinting을 설명합니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 세포만을 사용하여 생체 재료를 사용하지 않고 심장 조직의 3D 생체 인쇄를 설명합니다. Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아 세포를 먼저 분리하고, 원하는 세포 비율로 세고 혼합합니다. 그들은 초저 부착 96- 웰 플레이트에서 개별 웰에서 공동 배양됩니다. 3 일 이내에, 회전 타원체 형태가됩니다. 이 회전 타원체는 진공 흡인을 사용하여 노즐로 집어 들고 3D 바이오 프린터를 사용하여 니들 어레이에 조립됩니다. 회전 타원체는 바늘 어레이에서 융합됩니다. 3 차원 바이오 프린팅한지 3 일 후, 스페 로이드는 손상되지 않은 채로 제거되어 이미 자발적으로 박동하고 있습니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.
서론
3D bioprinting 1 , 2 , 3 에는 여러 가지 방법이 있습니다. 3D 바이오 프린팅은 잉크젯 바이오 프린팅, 마이크로 압출 바이오 프린팅, 레이저 보조 바이오 프린팅, 방법 조합 또는 새로운 접근법과 같은 예를 사용하여 인쇄 기술 1로 분류됩니다. 3D bioprinting은 scaffold-free 또는 scaffold-dependent 방법으로 분류 할 수 있습니다 4 . 3D bioprinting의 대부분의 방법은 scaffold에 의존합니다. 여기에는 bioinks 5 또는 scaffolds 6 과 같은 생체 재료가 필요합니다. 그러나 발판 의존적 인 3D 바이오 프린팅은 스캐 폴딩 재료의 면역 원성, 독점적 바이오 인크의 비용, 분해 속도가 느린 독성 및 분해 제품의 독성과 같은 많은 문제점과 한계에 직면합니다.
Scafspheroids를 사용하는 fold-free ....
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프로토콜
1. 심근 세포의 제조
- 생성 및 인간이 유도 한 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) 10 설명대로 기저막 매트릭스로 코팅 6 잘 접시에.
- 이전에 설명한 방법 11 , 12를 사용하여 hiPSCs를 hiPSC 유래 cardiomyocytes (hiPSC - CMs)로 구분하십시오.
- 분화 후 19 일에, 실온에서 5 분 동안 각 웰에서 0.05 % 트립신 / EDTA 2 mL를 사용하여 심근 세포를 분리한다.
- 세포 해리를 관찰하기 위해 광학 현미경으로 cardiomyocytes를 모니터링합니다.
- 트립신 억제제 0.0125 % 2 mL를 사용하여 트립신을 중화시킨다.
- 분리 된 cardiomyocytes를 풀어 동력 된 피펫 필러를 사용하여 하나의 50 ML 원뿔 튜브로 전송하십시오.
- 펠렛을 얻기 위해 실온에서 250 xg로 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하십시오.
- Roswell Park 5 mL에 펠렛을 ResuspendB-27 (RPMI / B-27 세포 배지)가 보충 된 Memorial....
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결과
4.4 단계 (공동 배양)가 끝나면 각 웰의 세포는 초저 부착 96-well U-bottom plate의 바닥에 응집되어 중력에 의해 회전 타원체가 형성됩니다. 이러한 회전 타원체는 hiPSC-CM, HCF 및 HUVEC를 포함하며 광학 현미경으로 육안 검사가 가능하며 2 차원 투영으로 원형으로 나타나야합니다 ( 그림 1 ). 6.3 단계의 끝에서, 3D 생체 보정 심장 패치는 바늘 어레이 ( 그림 2 , 왼쪽)에 의해 생성 된 바늘 구멍 때문에 조직 공극을 포함해야합니다. 이 시점에서, 회전 타원체 사이의 경계는 불분명 해져야하고, 패치는 회전 타원체의 기계적 통합을 보여주는 자발적으로 치닫기 시작해야합니다. 단계 6.5가 끝나면 조직 공극은 주변 조직 ( 그림 2 , 오른쪽)에 의해 채워 져야하고 3D 생체.......
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토론
3D 바이오프린팅을 위해서는 박동, 기능성 스페로이드를 사용하는 것이 중요합니다. 스페로이드가 뛰지 않으면 계속 사용하면 항상 작동하지 않는 3D 바이오프린팅 패치가 생성됩니다.
이 접근법의 한 가지 이점은 스페로이드의 총 세포 수와 심근 세포, 내피 세포 및 섬유아세포의 비율을 변경하여 패치의 세포 함량을 조작할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 다양한 조직학적 및 기계적 특성을 가진 다양한 유형의 심장 패치를 인쇄할 수 있습니다.
이 접근 방식을 사용하면 다양한 유형의 스페로이드를 사용하여 패치를 만들 수 있을 뿐만 아니라 복잡한 3D 디자인으로 심장 패치의 3D 바이오프린팅을 사용할 수도 있습니다. 최종 3D 구조물의 이러한 복잡성은 정확한 스페로이드 위치 지정을 통한 3D 바이오프린팅에 의해 달성될 수 있지만, 부유 스페로이드7 의 부드러운 회전 또는 원통형 3D 구조물
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 심장 혈관 연구에 대한 기금 모금 및 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2016-MSCRFI-2735)과 같은 기금 출처를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 겔트렉스 | 인비트로젠 | ||
| 트립신/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| 정의된 트립신 억제제 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI 세포 배지 | Invitrogen | 11875-093 | RPMB27이 보충된 RPMI는 HIPSC-CM을 구성합니다 |
| B-27 보충제 | Thermo Fisher | 17504044 | RPM은 B27이 보충되어 HIPSC-CM을 구성합니다. 배양 매체 |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | 아키타현 스미토모 베이클라이트 주식회사 | MS-9096UZ | |
| 레제노바 바이오 3D 프린터 | 싸이퓨즈 바이오메디컬 KK | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T 항체 | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) 항체 | Chemicon | MAB3068 | |
| Thermo Fisher | P36935 | 가 포함된 ProLong Gold Antifade Mountant |
참고문헌
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16
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재인쇄 및 허가
