고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Summary

이 논문은 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 막 전위와 형태학을 동시에 정량화하기위한 고 - 내용 현미경 검사 워크 플로우를 제시한다. 세포 투과성 형광 리포터 분자 5- (and- 6) - 클로로 메틸 -2 ', 7'- 디클로로 디 히드로 플루 오렌 시스 디 아세테이트, 아세틸 에스테르 (CM-H ₂ DCFDA) 및 테트라 메틸 로다 민 메틸 에스테르 (TMRM)

Abstract

활성 산소 종 (ROS)은 유전자 발현, 이동, 분화 및 증식을 포함한 필수 세포 과정을 조절합니다. 그러나 과도한 ROS 수준은 DNA, 지질 및 단백질에 대한 비가 역적 산화 손상을 수반하는 산화 스트레스 상태를 유도합니다. 따라서, ROS의 정량화는 세포 건강 상태에 대한 직접적인 프록시를 제공한다. 미토콘드리아가 ROS의 중요한 세포 원 및 표적이기 때문에 같은 세포에서 미토콘드리아 기능과 ROS 생산의 공동 분석은 병리 생리 학적 조건에서 상호 연결을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 따라서, 세포 내 ROS 수준, 미토콘드리아 막 잠재력 (ΔΨ _m ) 및 미토콘드리아 형태학의 동시 정량화를위한 ​​고 함량 현미경 기반 전략이 개발되었습니다. 그것은 다중 웰 플레이트에서 성장한 살아있는 부착 세포의 자동화 된 광역 형광 현미경 및 이미지 분석에 기반을두고 있습니다.세포 - 투과성 형광 리포터 분자 CM-H2 DCFDA (ROS) 및 TMRM (ΔΨm 및 미토콘드리아 형태학)을 사용하여 d를 측정 하였다. 형광 측정 또는 유동 세포 계측법과는 달리,이 전략은 실험 자극 전후 모두 높은 시공간 해상도를 갖는 개별 세포 수준에서 세포 매개 변수를 정량화 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법의 이미지 기반 성질은 신호 강도 이외에 형태 론적 파라미터를 추출 할 수있게한다. 결합 된 기능 세트는 하위 집단, 세포 유형 및 / 또는 치료법 간의 차이를 탐지하기위한 탐색 및 통계 다변량 데이터 분석에 사용됩니다. 여기에, 화학 섭동 후 세포 상태 사이의 모호하지 않은 차별을위한 잠재력을 증명하는 실험 예와 함께 분석에 대한 자세한 설명이 제공됩니다.

Introduction

세포 내 ROS의 농도는 ROS 생성 시스템과 ROS를 제거하는 시스템 사이의 동적 상호 작용을 통해 세 심하게 조절됩니다. 이 둘의 불균형은 산화 스트레스 상태를 일으킨다. ROS의 주요 원인 중 하나는 미토콘드리아이다. 세포 호흡에서의 역할을 감안할 때, 그들은 세포 내 superoxide (O ₂ ^{• -} ) 분자의 대부분을 담당합니다 ² . 이것은 주로 강한 마이너스 내부 미토콘드리아 막 잠재력 (Δψ _m ), 즉 미토콘드리아 과분극 조건 하에서 전자 전달 사슬의 복합체 1에서 O ₂ 로의 전자 누출에 기인한다. 반면에 mitochondrial depolarization은 ROS 생성 증가와 상호 작용하여 여러 형태의 작용 ^{3 , 4 , 5 ,}> 6 ^{, 7 , 8} . 또한 핵분열 - 핵융합 기계 단백질의 산화 환원 변형을 통해 RO....

Protocol

아래의 프로토콜은 NHDF 세포와 재료 파일에 명시된 멀티 웰 플레이트를 사용하여 수행되는 것으로 설명됩니다. 워크 플로의 일반적인 개요는 그림 1 을 참조하십시오.

1. 시약의 준비

1. 10 % v / v 태아 소 혈청 (FBS)과 100 IU / ML 페니실린과 100 IU / ML 스트렙토 마이신 (PS)와 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM) 보충하여 완벽한 매체를 준비합니다. 500 mL의 완전한 배지에 44 mL의 DMEM에 50 mL의 FBS와 5 mL의 PS를 첨가한다.
2. 20 MM HEPES와 행크의 균형 소금 솔루션 (마그네슘과 칼슘,하지만 페놀 레드없이) 보완하여 HBSS - HEPES (HH) 이미징 버퍼를 준비합니다. HH 500 mL에 1M HEPES 스톡 용액 10 mL를 HBSS 490 mL에 넣는다. pH를 확인하고, 필요하다면 pH 7.2로 맞추십시오.
3. CM - H ₂ DCFDA 동결 건조 분말 50 μg을 86.5 ℃에서 녹여 1 mM CM - H ₂ DCFDA 저장 용액을 준비한다.# 181; L 무수 DMSO. vorte....

Results

분석은 여러 대조 실험을 사용하여 벤치마킹되었으며, 그 결과는 Sieprath et al. ¹ . 간단히 말하면, CM-H ₂ DCFDA 및 TMRM의 세포 내 ROS 및 Δψ _m의 외적으로 유도 된 변화에 대한 형광 응답을 각각 동적 범위를 결정하기 위해 정량화 하였다. CM-H ₂ DCFDA의 경우, NHDF는 10 μM에서 160 μM 범위의 TBHP 농도로 처리했을 때 형광 신호의 선형 증가를 보였다. 마찬가지로, TMRM의 경우 NHDF 세포는 1에서 10 μg / μL 범위 내에서 증가하는 oligomycin 농도 (ΔΨ _m 과민성을 유도 함)로 처리했을 때 미토콘드리아 형광의 선형 증가를 나타냈다. 반대로 ΔΨ _m 탈분극을 유도하는 항생제 _인 발리 노마 이신 (valinomycin).......

Discussion

이 논문은 NHDF에서 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction의 동시 정량화를위한 ​​고 함량 현미경 검사법을 설명합니다. 그 성능은 SQV가 처리 된 NHDF에 대한 사례 연구를 통해 입증되었습니다. 그 결과는 별도의 실험 ^{19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} 에도 불구하고 1 형 HIV 프로테아제 억제제로 치료 한 후에 증가 된 ROS 수치 또는 미토콘드리아 기능 장애가 관찰 된 문헌의 초기 증거를 뒷받침한다. 중요한 차이점은 묘사 된 분석법이 형태 학적 데이터와 함께.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<강>시약
테트라메틸로다민, 메틸 에스테르, 과염소산염(TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA(일반 산화 스트레스 지표)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethyl sulfoxide	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well 유리 바닥 MicroWell 플레이트 630 µ L-Black 0.17mm 저유리 뚜껑	Brooks 생명 과학 시스템	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o 페놀 레드 500mL	Lonza	BE10-527F
DMEM 고포도당(L-글루타민	포함) Lonza	BE12-604F
인산염 부화 식염수(PBS) w/o Ca 및 Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1M 500mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) 용액	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Flat-field image 획득에 사용되는 항체
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	flat-field image 획득에 사용되는 항체
Name	Company	카탈로그 번호<	strong>Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		하드웨어 기반 자동 초점 시스템
CFI Plan Apo Lambda 20X Objective	Nikon
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS	module Nikon		이 소프트웨어는 현미경을 조종하고 자동 이미지 획득 prototocol
ImageJ (FIJI) 버전 2.0.0-rc-43 / 1.50g
RStudio 버전 1.0.44	Rstudio
R 버전 3.3.2