유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)이 심근를 - 유래에서 여기, 우리는 인간의 조작 된 심장 조직의 생성을 보여줍니다. 우리는 HERG 채널 저해제 인 E-4031에 의해 수축력과 수축 패턴의 예시적인 변화를 분석하는 방법을 제시한다. 이 방법은 심장 약물 스크리닝 견고성과 높은 수준의 적합성을 나타낸다.
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이 논문에서
요약
초록
심장 조직 공학은 삼차원 힘 발생 설계 조직을 구성하는 기술을 설명한다. 기초 연구 및 임상 약물 개발에서 이러한 절차의 구현을 위해, 표준화 된 조건에서 자동 생성 및 분석을위한 프로토콜을 개발하는 것이 중요하다. 여기, 우리는 다른 종 (쥐, 마우스, 인간)의 심근에서 엔지니어링 심장 조직 (EHT)를 생성하는 기술을 제시한다. 이 기술은 24 웰 포맷에서의 탄성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)과 포스트 해리 심근 세포를 포함하는 피브린 겔의 조립에 의존한다. 입체 힘 발생 EHTs 주조 후 2 주 내에 구성한다. 이 절차는 일주일에 수백 EHTs의 생성을 허용하고 기술적으로 심근의 가용성에 의해서만 제한된다 (0.4 ~ 1.0 × 10 6 / EHT). auxotonic 근육 수축의 평가는 mechan으로 변형 배양실에서 수행iCal을 24 웰 플레이트에 대한 연동이 챔버의 상부에 배치 된 카메라. 소프트웨어는 각 카메라 EHT에 XYZ 축 이동 제어 시스템. EHT 수축은 자동화도 인식 알고리즘에 의해 검출되고, 힘이 PDMS 포스트의 EHT 단축 탄성 성향 및 형상에 기초하여 계산된다. 이 절차는 표준화 및 멸균 조건에서 EHT의 높은 번호를 자동으로 분석 할 수 있습니다. 심근 수축에 약물 효과의 신뢰성 감지는 심장 약물 개발 및 안전 약리학에 대한 매우 중요합니다. 우리는 인간의 EHT 시스템은 심장 약물 안전 검사를위한 유망한 도구로 나타내는 인간의 심장의 수축 반응 속도에 약물 반응을 복제한다는의 HERG 채널 억제제 E-4031의 예를 함께 보여줍니다.
서론
등의 약물 유발 긴 QT 증후군 등 심장 부작용은 지난 몇 년 동안 시장 인출을 주도했다. 통계는 모든 인출의 약 45 %가 심혈 1에 원치 않는 효과로 인한 나타냅니다. 고가의 발달 과정과 승인 후이 약의 실패는 제약 회사에 대한 최악의 시나리오입니다. 연구 개발 부서는 그러므로 초기에 원하지 않는 심혈관 효과의 탐지에 초점을 맞 춥니 다. 경제적, 윤리적 문제, 동물 실험을 줄이고 새로운 시험 관내 스크리닝 분석으로 대체하기위한 노력을 진행 중이다.
설립 분석의 세트는 미국 식품의 약국 (FDA)과 유럽 의약품 청 (EMA) proarrhythmic 약물 효과 2의 전임상 평가를위한 가이드 라인에 포함되어 있습니다. 분화 다음에 체세포를 재 프로그래밍의 기술인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)이 연구 분야 (3)을 밀어. 지금은 시험관에서 인간의 심근 세포에 신약 후보 물질을 선별 할 수있는 가능성을 제공하며, 간 종 차이의 문제를 피할 수 있습니다. 최근 심장 차별화 프로토콜 4,
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프로토콜
참고 : 다음 단계는 세포 배양 프로토콜을 설명합니다. 무균 조건에서 수행하고 예열 미디어를 사용하십시오.
hiPSC 1. 심장 차별화
- hiPSC 육성
- 코트 6 웰 플레이트 (1 ㎖ / 웰) 또는 감소 된 성장 인자 기저막 매트릭스 T75 플라스크 (7 ㎖ / 플라스크) (예 geltrex, 1 : 200; 재료 표 참조) 둘 베코 변형 이글 배지에서 희석 된 (DMEM)에 대한 37 ° C에서 30 분. 혼합 FTDA 매체 (12)를 준비 기본 DMEM / F-12 배지 2 mM의 L- 글루타민, 0.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 밀리그램 / L의 트랜스페린, 5 ㎍ / L 셀레늄, 0.1 % 인간 혈청 알부민, 1X 지질 믹스 5 밀리그램 / L 인슐린, 50 나노 dorsomorphin 2.5 NG / ㎖ 티빈 A, 0.5 NG / ㎖ 인간 TGFß1 30 NG / ㎖ FGF2.
- 37 ° C, 5 % CO 2, 일일 매체 변화 21 % O 2 (AT FTDA 매체 배양 시드 hiPSC (~ 3 × 10 10분의 5 cm² 이상....
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결과
심장 분화 EHT의 제조
HiPSC는 감소 된 성장 인자 기저막 매트릭스 확장 EDTA 밤새 스피너 플라스크에 형성 배양체 EBS ()로 분해 하였다. 3 일간 중배엽 유도 한 후, 분화는 심장의 Wnt 억제제 개시 하였다. 분화 프로토콜 ~ 십칠일 후 구타 사채는 콜라게나 제 II 형 (도 1)과 하나의 세포에 해리 하였다. EHTs 즉시 EB 해리 (도 2) 한 후 100 μL 조직 당 1.0 × 106 세포에서 심근 절연 갓 제조 하였다. 냉동 세포에서 준비 (예를 들면 상업 공급 업체)의 경우, 세포 배지에서 드롭 현명한 재 부유에 의해 해동하고 원심 분리 후 ECM에 재현 탁. 48 시간 내에서 단일 세포의 자발적인 박동이 EHT에 현미경으로 관찰되었다. 다음 .......
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토론
설계된 심장 조직은 심장 혈관 연구의 도구 상자에 유용한 옵션을 제공합니다. 24 웰 형식의 EHTs 질병 모델링 8, 14, 약물 안전 검사 7, 8, 10, 11, 15, 또는 기본 심장 혈관 연구 16, 17에 대한 가치 입증했다.
기본적인 EHT 프로토콜 잠재적 변형 심근 비 심근 후 부하 (18) 및 강화
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공개 사항
IM, TE와 AH는 EHT 기술 GmbH는 독일의 공동 설립자이다.
감사의 글
저자는 재료의 그 종류 공헌 알레산드라 모레티와 데니스 샤데에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 실험 약리학과 UKE의 독성학과에서 유도 만능 줄기와 EHT 작업 그룹의 큰 지원을 인정합니다. 저자의 작업은 DZHK (심장 혈관 연구를위한 독일 센터) 및 교육의 독일 연구부 (BMBF), 독일 연구 재단 (DFG 에스 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 보조금 지원 ), 영국 국가의 중앙에 교체 정제 및 연구에 동물의 감소 (NC3Rs 균열이-IT는 35911-259146을 부여), 영국 심장 재단 RM / 3만1백57분의 13에 대한 유럽 연구위원회 (고급 그랜트 IndivuHeart), 독일 심장 재단 그리고 프레이 싶게 Hansestadt 함부르크.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| EHT 분석 장비 | EHT Technologies GmbH | A0001 | 소프트웨어 포함 |
| EHT PDMS 랙 | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE 스페이서 | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT 전극 | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT 페이싱 어댑터/케이블 | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-웰-플레이트 | Nunc | 144530 | |
| 6 웰-셀 배양 플레이트 | Nunc | 140675 | |
| 15 mL 팔콘 튜브, 졸업 | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 세포 스크래퍼 | Sarstedt | 831,830 | |
| 스피너 플라스크 | Integra | 182 101 | |
| 교반기 Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | 로터 속도를 40 rpm |
| T175 세포 배양 플라스크로 조정 | 사르스테트 | 831,812,002 | |
| V자형 침전대 | UKE 함부르크 | na | |
| 10×에서 맞춤 제작; DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-티오글리세롤 | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R& D 시스템 | 338-AC | |
| 아가로스 | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS 인슐린 | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R& D 시스템 | 314-BP | |
| 콜라겐분해효소 II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, 타입 V (소 비장에서) | Sigma | D8764 | |
| 도르소모르핀 | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| 태아 송아지 혈청 | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| 피브리노겐 (소) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | 코팅용: 1:200 희석 |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| 말 세럼 | 생명 기술 | 26050088 | |
| 인간 세럼 알부민 | 생물학 산업 | 05-720-1B | |
| 인슐린, 인간 | 시그마 알드리치 | I9278 | |
| L-글루타민 | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | EHT 재조정 혼합용. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| 폴리비닐 알코올 | 시그마 알드리치 | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| 나트륨 셀렌 이 | 그마 Aldrich | S5261 | |
| TGFß 1 | Peprotech | 100-21 | |
| 트롬빈 | 시그마 알드리치 | T7513 | |
| 트랜스퍼린 | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | UKE 함부르크에서 맞춤 제작 | na | |
| iCell 심근 세포 키트 | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| 다막 세포 심근 세포 키트 | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U - HiPSC 심근 세포 키트 | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis 심근 세포 | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
참고문헌
- Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
- Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from:
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재인쇄 및 허가
