방법 논문

심장 약물 안전 검사를위한 인간 공학 심장 조직의 자동 수축 분석

DOI:

10.3791/55461

⸱

2017년 4월 15일

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1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

이 논문에서

요약

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유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)이 심근를 - 유래에서 여기, 우리는 인간의 조작 된 심장 조직의 생성을 보여줍니다. 우리는 HERG 채널 저해제 인 E-4031에 의해 수축력과 수축 패턴의 예시적인 변화를 분석하는 방법을 제시한다. 이 방법은 심장 약물 스크리닝 견고성과 높은 수준의 적합성을 나타낸다.

초록

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심장 조직 공학은 삼차원 힘 발생 설계 조직을 구성하는 기술을 설명한다. 기초 연구 및 임상 약물 개발에서 이러한 절차의 구현을 위해, 표준화 된 조건에서 자동 생성 및 분석을위한 프로토콜을 개발하는 것이 중요하다. 여기, 우리는 다른 종 (쥐, 마우스, 인간)의 심근에서 엔지니어링 심장 조직 (EHT)를 생성하는 기술을 제시한다. 이 기술은 24 웰 포맷에서의 탄성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)과 포스트 해리 심근 세포를 포함하는 피브린 겔의 조립에 의존한다. 입체 힘 발생 EHTs 주조 후 2 주 내에 구성한다. 이 절차는 일주일에 수백 EHTs의 생성을 허용하고 기술적으로 심근의 가용성에 의해서만 제한된다 (0.4 ~ 1.0 × 10 6 / EHT). auxotonic 근육 수축의 평가는 mechan으로 변형 배양실에서 수행iCal을 24 웰 플레이트에 대한 연동이 챔버의 상부에 배치 된 카메라. 소프트웨어는 각 카메라 EHT에 XYZ 축 이동 제어 시스템. EHT 수축은 자동화도 인식 알고리즘에 의해 검출되고, 힘이 PDMS 포스트의 EHT 단축 탄성 성향 및 형상에 기초하여 계산된다. 이 절차는 표준화 및 멸균 조건에서 EHT의 높은 번호를 자동으로 분석 할 수 있습니다. 심근 수축에 약물 효과의 신뢰성 감지는 심장 약물 개발 및 안전 약리학에 대한 매우 중요합니다. 우리는 인간의 EHT 시스템은 심장 약물 안전 검사를위한 유망한 도구로 나타내는 인간의 심장의 수축 반응 속도에 약물 반응을 복제한다는의 HERG 채널 억제제 E-4031의 예를 함께 보여줍니다.

서론

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등의 약물 유발 긴 QT 증후군 등 심장 부작용은 지난 몇 년 동안 시장 인출을 주도했다. 통계는 모든 인출의 약 45 %가 심혈 1에 원치 않는 효과로 인한 나타냅니다. 고가의 발달 과정과 승인 후이 약의 실패는 제약 회사에 대한 최악의 시나리오입니다. 연구 개발 부서는 그러므로 초기에 원하지 않는 심혈관 효과의 탐지에 초점을 맞 춥니 다. 경제적, 윤리적 문제, 동물 실험을 줄이고 새로운 시험 관내 스크리닝 분석으로 대체하기위한 노력을 진행 중이다.

설립 분석의 세트는 미국 식품의 약국 (FDA)과 유럽 의약품 청 (EMA) proarrhythmic 약물 효과 2의 전임상 평가를위한 가이드 라인에 포함되어 있습니다. 분화 다음에 체세포를 재 프로그래밍의 기술인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)이 연구 분야 (3)을 밀어. 지금은 시험관에서 인간의 심근 세포에 신약 후보 물질을 선별 할 수있는 가능성을 제공하며, 간 종 차이의 문제를 피할 수 있습니다. 최근 심장 차별화 프로토콜 4, 5는 윤리적 문제없이 심근 세포의 무제한 공급을 제공한다. 그러나 가장 중요하고 가장 심근 세포의 생체 내 파라미터있어서 수축력의 측정은, 잘 구축되지 않는다. 이것은 성인 심근에 비해 인간 유도 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hiPSC-CM)의 상대적인 미성숙 (6)에 관한 것이다. 이 발전 가능한 단셀 7 (설계 심장 조직, EHT) 3 차원 심장 조직을 설계하는 것이다. EHT 프로토콜은 단일 또는 인간 쥐 심근 8 매립에 기초 SUP>, 두 개의가요 성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 소식 24 웰 형식 (11) 사이의 피브린 겔 9, 10. 몇 일 이내에 심근 세포는 단일 세포로 자발적으로 계약을 시작하고 셀룰러 네트워크를 형성하기 시작합니다. 7-10일 후, 전체 조직의 거시적 수축 볼 수 있습니다. 이 과정에서, 세포 외 매트릭스는 직경, 길이의 감소에 이르게하는 개조된다. PDMS의 굽힘에 EHT 결과의 단축 연속 부하로 개발 EHT에서 심근 쓰는, 휴식시에도 게시 할 수 있습니다. EHTs 몇 주 동안 auxotonic 근육의 수축을 계속 수행. 인간 EHTs 약물 스크리닝 질병 7 모델링 적합성을 나타내는 생리 학적 및 약리학 적 자극에 대한 반응을 도시한다.

이 논문에서 우리는 generati에 대한 강력하고 쉬운 프로토콜을 제시인간 EHT 및 HERG 채널 억제제의 존재 하에서 수축 패턴의 농도에 따라 변화의 자동화 된 분석의 수축력에.

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프로토콜

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참고 : 다음 단계는 세포 배양 프로토콜을 설명합니다. 무균 조건에서 수행하고 예열 미디어를 사용하십시오.

hiPSC 1. 심장 차별화

  1. hiPSC 육성
    1. 코트 6 웰 플레이트 (1 ㎖ / 웰) 또는 감소 된 성장 인자 기저막 매트릭스 T75 플라스크 (7 ㎖ / 플라스크) (예 geltrex, 1 : 200; 재료 표 참조) 둘 베코 변형 이글 배지에서 희석 된 (DMEM)에 대한 37 ° C에서 30 분. 혼합 FTDA 매체 (12)를 준비 기본 DMEM / F-12 배지 2 mM의 L- 글루타민, 0.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 밀리그램 / L의 트랜스페린, 5 ㎍ / L 셀레늄, 0.1 % 인간 혈청 알부민, 1X 지질 믹스 5 밀리그램 / L 인슐린, 50 나노 dorsomorphin 2.5 NG / ㎖ 티빈 A, 0.5 NG / ㎖ 인간 TGFß1 30 NG / ㎖ FGF2.
    2. 37 ° C, 5 % CO 2, 일일 매체 변화 21 % O 2 (AT FTDA 매체 배양 시드 hiPSC (~ 3 × 10 10분의 5 cm² 이상)그림 1A). (2-1 : 6 1) (0.5 mM의, 배양 시간 ~ 4 분 EDTA), 에틸렌 디아민 테트라 아세트산과 80 % 컨 플루 언시, 항로.
  2. 배아 체의 형성 (EB)
    1. 높은 밀도 T75 플라스크에 hiPSC 육성.
      1. 칼슘 및 마그네슘 (PBS)없는 인산 완충 식염수로 두 번 세포 융합 플라스크를 세척하고 10 분 ~ 0.5 mM의 EDTA 부화. 세포가 플라스크의 바닥에서 분리하지 않도록합니다.
      2. 유리 피펫 EDTA를 제거 세포를 분리 벤치에서 10 mL의 PBS로 세포 탭 플라스크를 세척.
        참고 : 사용하여 세포 스크레이퍼 필요한 경우.
      3. 부피의 ¼을 추가 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포를 수집 (예를 들어 10 ㎖ RMPI 40 ㎖의 세포 현탁액) RPMI 1640 배지 (또는 다른 표준 1.8 mM의 칼슘을 함유하는 배지)에서 5 분 동안 250 XG에서 원심 분리한다.
    2. FTDA 배지에서 재현 탁 된 세포 펠렛은 4 ㎎ / ㎖의 폴리 비닐 알코올 (PVA)과 보충10 μM Y27632 및 노이 바 우어 챔버 내의 세포 수를 계산.
    3. 세포 현탁액과 스피너 플라스크 채우기 (30 × 106 세포 / 100 ㎖ FTDA 매체는 PVA 및 Y-27632는 보충 단계 1.2.2 참조) (40 rpm으로 자기 교반기의 회전 속도를 조정 스피너 플라스크에 형성 EB 개시 ) 밤새 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO 2, 5 % O 2)이다.
  3. 중배엽 차별화
    1. EB 형성시, 외투 세포 배양은 37 ℃에서 하룻밤 동안 비 이온 계면 활성제 (14 ㎖ / T175)를 현탁 배양에 적합한 플라스크.
    2. 다음날 아침, PBS (30 ㎖ / T175) 회 활성제 코팅 플라스크를 세척 하였다. 다시 PBS를 추가하고 필요할 때까지 인큐베이터에 보관하십시오.
    3. 인큐베이터에서 스피너 플라스크를 제거합니다.
      참고 : 세포 현탁액은 작은 거시적으로 볼 사채 (그림 1B)와 명확해야한다.
    4. 50㎖의 삼각 욕조를 50 ㎖ 현탁액을 전송전자 및하자 교환 사채는 5 ~ 20 분 동안 정착.
    5. 상등액을 제거하고 2 % PVA 10 μM Y-27632로 보충 된 RPMI 1640 7 ml로 펠렛을 세척 하였다. 눈금 15ml의 원뿔형 튜브 추정치 EB 부피 (~ 50-100 μL)로 전송 현탁액.
    6. 코팅 T175 플라스크에 스피너 플라스크의 내용물을 이동시켜 최대 20 분 동안 침강 용 V 형 선반에두고. 상층 액을 제거하고 위에서 언급 한 바와 같이 배아 체를 씻는다. 침전이 너무 오래 걸릴 것 같은 200 개 이상의 mL를 T175 플라스크를 기입하지 마십시오. 초기 스피너 플라스크의 부피가 200 ㎖을 초과하는 경우, 여러 T175 플라스크에 EB 현탁액을 분리하고 세척 후 다시 사채를 결합한다.
    7. 중배엽 분화 배지에서 세정 매체 재현 탁 제거, 즉 RPMI 4 ㎎ / ㎖ PVA 0.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 mm의 보충 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 0.05 % 인간 혈청 알부민, 5 ㎍ / mL로의 트랜스페린, 5 NG / ㎖의 소듐 셀레 나이트, 0.1 % 혼합 지질 250 μM 포스 아스 코르 베이트, 10 μM Y-27632 10 NG / ML 본 형태 발생 단백질 -4 (BMP-4), 3 NG / ㎖ 티빈 A, 5 NG / ㎖ 안정 FGF2.
    8. 계면 활성제 코팅 T175 플라스크로부터 PBS를 제거하고 세포 현탁액 (40 ㎖의 200 μL 사채) 채우기. 작은 EB 볼륨에 대해 작은 플라스크를 사용합니다.
    9. 삼일 (37 ° C, 5 % CO 2, 5 % O 2)에 대한 정지 사채 육성. 환 (단계 1.3.7에서와 동일 조성) 배지의 50 % 매일 (사용 V 자형 침 수납). 매일 전 먹이 중간 신선한 준비합니다.
  4. 심장 차별화
    1. 전날 새로운 계면 활성제 코팅 된 혈관을 준비하고 (1.3.2) 위에서 언급 한 바와 같이 처리합니다.
    2. 중배엽 유도 삼일 후, 교환 사채는 침강 랙에 최대 5 분 동안 정착하자. 매체의 대부분을 제거하고 0.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES가 보충 된 RPMI 1640으로 세척 하였다.
    3. 이전 10 EB 현탁액 mL의 눈금에침전 후 15ml의 튜브 추정치 EB 볼륨.
    4. 재현 탁 사채 신중 심장 분화 배지에 0.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 0.05 % 사람 혈청 알부민, 5 ㎍ / mL로의 트랜스페린, 5 NG / ㎖의 소듐 셀레 나이트, 0.1 % 지질 믹스 250 μM의 포스 보충 된 RPMI 1640으로 이루어진 -ascorbate 1 μM Y-27632, 100 nM의 억제제의 Wnt-DS-I-7-13.
    5. 새로운 계면 활성제 코팅 세포 배양 플라스크에 사채를 전송 (200 μL 사채 ~ 46 ㎖ / T175에서).
    6. 50 % 매체 변화 사흘 (37 ° C, 5 % CO 2, 21 % O 2) 부화 두 번째 및 세 번째 날 (배지 조성은 단계 1.4.4 참조). 처음 48 시간 이내에 매체를 변경하지 마십시오.
    7. 인슐린 500 μM 1- 티오 글리세롤, 10 mM의 HEPES, 0.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 μM Y-27632, 2 % 혈청 신경 세포 배양 보조제 (예 : B27)의 100 nM의 Wnt에 보충 된 RPMI 1640으로 이루어진 배지에서 인큐베이션 -inhibitor DS-I앞으로 4 일 동안 50 % 매체의 일상적인 교류와 -7. 교환 사채는이 기간 내에 치기 시작해야합니다.
    8. 심장 차별화 일주일 후가 Wnt 억제없이 혈청 신경 세포 배양 보충제와 같은 매체로 전환합니다. 첫날을 제외하고 매일 매체의 50 %를 변경합니다.
  5. 인간의 심근 세포의 해리
    참고 : 차별화 프로토콜 2 주 후, 교환 사채는 자발적 수축 (그림 1C)를 표시해야합니다. 그렇다면, 해리를 시작하고 콜라겐 솔루션을 준비합니다.
    1. ((HBSS)를 계량, 칼슘 / 마그네슘없이 칼슘없는 행크스 균형 염 용액에서 200 U / ㎖를 해결하여 콜라겐 용액을 제조하고 1 mM의 HEPES, 10 μM Y-27632, 30 μM N 벤질 p- 톨루엔 설폰 아미드를 추가 BTS). -20 ° C에서 여과 (0.2 ㎛의 필터) 및 저장 분취하여 소독. 밤 동안 4 ℃에서 분취 액을 해동.
    2. 침전 랙에 사채를 정착,대기음 매체 20-25 ML의 예열 HBSS로 대체. 다시 한번이 세척 단계를 반복합니다.
    3. 대기음 HBSS 및 예열 콜라게나 제 용액 (15 ㎖ / T175)로 교체한다. 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 (37 ℃, 5 % CO 2, 21 % O 2) 배양한다.
    4. DMEM 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신의 DNase (12 ㎍ / ㎖)으로 보충하여 블로킹 완충액을 준비한다.
    5. 벤치에 세포 배양 플라스크를 눌러, 교환 사채는 분해 및 붕괴 (하지 않을 경우, 배양 시간을 증가)한다 해리. 원뿔 50 ㎖ 튜브에 조심스럽게 씹다 세포 현탁액 및 전송. 완충액 (15 ㎖ / T175)를 차단 형틀 씻고 튜브에 옮긴다.
    6. 100 × g에서 10 분간 원심 분리기. 따뜻한 DMEM, 씹다 세포를 재현 탁하고 세포를 계산합니다.

엔지니어링 심장 조직의 2 세대 (EHT)

  1. 자료를 참조 (시판 PDMS 랙 및 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 (PTFE) 스페이서를 압력솥과장비 스프레드 시트; 도 2) 전날 EHT 생성하기 위해, 멸균 조건 하에서 다음 방법을 준비한다.
    1. 무게 및 PBS, 오토 클레이브의 적합한 부피에 용해시켜 2 % 아가로 오스를 준비, 즉시 60 ℃에서 보관.
    2. 아프로 티닌을 준비 계량 아쿠아 광고 iniectabilia 적절한 부피에 용해시켜 (33 ㎎ / ㎖)을 -20 ℃에서 멸균 (0.22 μm의 필터), 분취 저장 필터.
    3. -20 ℃에서 0.9 % NaCl을 멸균 (미지근한) 분취하여 저장할 적당한 부피 멸균 피브리노겐을 용해 (200 ㎎ / ㎖), 피브리노겐을 준비한다.
    4. 세 부분으로 무균 트롬빈을 용해하여 트롬빈 (100 U / ㎖)을 제조는 -20 ℃에서 PBS 2 개 부분 아쿠아 광고 iniectabilia 작은 튜브 3 μL의 분취 부 및 매장 멸균.
    5. 5 ㎖ 아쿠아 광고 iniectabilia에 670 mg의 10 배 DMEM 파우더를 용해시켜 준비 DMEM 배, 4 ℃에서 멸균 저장소 필터.
    6. 배 DMEM을 준비2ml의 열 불 활성화 된 말 혈청, 0.2 ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 5.8 mL의 아쿠아 광고 iniectabilia 2 mL의 DMEM 배 혼합하여, 4 ℃에서 멸균 저장소 필터.
    7. 준비 EHT 캐스팅 4 ℃에서 10 %의 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 % L- 글루타민 (200 mM)을 저장소로 DMEM 혼합함으로써 매체 (ECM)를.
  2. 1.6 mL의 따뜻한 오스 (2 %, PBS)을 피펫 팅하여 웰에 PTFE 스페이서 (도 2A)에 배치하여 24 웰 플레이트에서 주조 금형을 준비한다.
    참고 : 장소의 스페이서는 즉시 8 개 우물 최대로 피펫 팅 후 - 아가로 오스는 매우 빠르게 굳은. 이상 5 분 동안 실온에서 아가로 오스를 두지 마십시오.
  3. 아가로 오스 고형화 (~ 10 분, 아가 불투명 바뀔 것이다) 후, PTFE 스페이서 (도 2C)를 제거하고 PDMS 포스트 쌍의 각 몰드 (도 2D)에 도달되도록 주조 금형에 PDMS 랙 (도 2B)를 배치했다.
  4. 15 × 106 세포 / ㎖의 최소 농도 ECM에서 심근 세포를 재현 탁.
  5. , ice.For 24 EHTs에 둥근 바닥 15-㎖의 튜브에 재구성 믹스 추정 체적의 110 %를 준비 인간, 래트 또는 마우스 심근 표 1에 나열된 재구성 믹스 피펫 각각 (10 % 추가로 포함된다).
    주 : 재구성 믹스 세포 농도는 인간 (10 × 106 세포 / ㎖), 래트 (4.1 × 106 세포 / ㎖) 및 마우스 (6.8 × 106 세포 / ㎖) EHTs 다르다. 세포 현탁액의 농도에 따라 2,640 μL의 최종 부피에 추가 ECM을 추가한다. 피브리노겐은 피펫에 대한 미온적 수 있습니다. 천천히 피펫의 팁을 작성하고 재구성 믹스에 피브리노겐을 추가 할 때 피브리노겐 함유 피펫으로 추위 재구성 믹스의 표면을 만지지 마십시오 - 피브리노겐의 점도를 피펫 팁 즉시 증가 할 것입니다.
  6. 재구성 믹스를 씹다 10 - 피브리노겐 응고까지 혈청 피펫 15 시간은 용해된다. 동질성에 대한 피펫의 재구성 믹스를 확인합니다.
  7. 분취 한 트롬빈 (200 μL 튜브에서 3 μL)의 각 EHT, 피펫 100 μL 재구성 믹스, 혼합 수 (도 2E) 빨리 아가 슬롯에 혼합물을 피펫. 각 EHT에 대한 새 필터 팁을 사용합니다. 매 8 EHTs 후 (5-10 회 피펫 혈청로 연화) 재구성 믹스 재현 탁.
  8. 일단 모든 슬롯 재구성 믹스로 채워진다, 세포 배양 접시에 뚜껑을 닫은 후, 2 시간 동안 37 ℃, 7 % CO 2에서 배양한다.
  9. 무균 후드하에 인큐베이터 장소에서 플레이트를 제거한다. 각 웰에 배지와 소량의 (예를 들어 DMEM, 대략 200-500 μL)를 커버 플레이트 부드럽게 흔들 적어도 10 분 동안 37 ℃로 다시 배양. DMEM의 추가는 아가로 오스 주조 금형에서 섬유소 젤에서 쉽게 제거됩니다.
  10. 또한, 10 % 열 불 활성화 된 말 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 ㎍ / ㎖의 인슐린, 33 ㎍ / ㎖의 아프로 티닌이 보충 된 DMEM으로 구성된 당 1.5ml의 EHT 매체와 새로운 24 웰 플레이트를 준비한다.
  11. 조심스럽게 아가 주조 금형에서 PDMS 선반을 제거하고 배지로 채워진 24 웰 플레이트 (도 2F)로 전송. 인큐베이터 (37 ℃, 7 % CO 2, 인간과 쥐 EHTs 대 40 % O 2, 마우스 EHTs 대 21 % O 2)를 공급 월요일, 새로 제조 EHT 매체와 수요일 및 금요일에 접시를 놓는다. EHTs는 7~10일 (그림 1D, 2G)를 주조 한 후 PDMS 랙의 게시물을 편향 자연 수축을 표시해야합니다.
    1. 마우스 EHTs는 섬유 아세포의 증식을 제한하기 위해 48 시간 동안 배양액에 5 시토신 βDarabinofuranoside 25 ㎍ / mL를 첨가.

3. 수축 분석

참고 : 수축 분석을 기반으로영상 광학 시판 EHT 분석 기기에 기록 (물질의 표를 참조). 이기구의 중앙 유닛은 배양 챔버 (도 3a)이다. 기기에 제공된 소프트웨어는 공지 탄성율 형상 (11) (도 1 부가)와 PDMS 포스트의 편향에 기초 수축력을 계산한다.

  1. 측정에 앞서 시스템을 2 시간의 가열 장치를 켜고. 수축 분석 직전에 가스 공급 및 축 시스템의 전자 공급을 켭니다.
  2. 기준선 기록 (분석에 기준점)의 경우, EHT 분석 기기에 EHT 매체에 EHTs 갖는 24- 웰 플레이트를 배치 및 공급 설명서에 따라 수축 분석 소프트웨어를 시작한다.
    1. 오른쪽 패널에서 "프로토콜"탭을 클릭하고 연구 이름, 사용자, 종, CE에 대한 관련 정보를 입력LL 형, 나이, 녹화 시간 및 추가 발언.
    2. 왼쪽 패널의 "카메라 뷰"탭을 클릭하고 자동 그림 감지 모드와 카메라 라이브 모드를 시작합니다. XYZ로 카메라 위치가 24 잘 접시에 잘 각각의 좌표 andadjust 오른쪽 패널에서 "설정"탭을 클릭합니다. EHT 윈도우의 중앙에 카메라의 초점이 있는지 확인합니다.
      1. 이 그림의 인식과 수축의 분석을 저해하므로 세포 배양 접시의 뚜껑 안개하지 있는지 확인합니다.
        주 :도 인식 알고리즘은 높은 콘트라스트 영역을 검출하고, 그 위치의 변화를 감시에 근거한다. 소프트웨어에서도 인식이 영역은 EHT의 수축으로 이동하는 블루 크로스로 표시한다.
      2. 청색의 교차 위치가 EHTs 모두 상하 단부에 있으며 단지 수직 EHTs (도 3b)의 수축을 이동시키는 일치하는지 확인. 에스"확인 위치"버튼을 눌러 각 웰의 아베 설치 위치.
    3. 다음, 왼쪽 패널에서 "매개 변수"탭을 클릭합니다. 여기에 표시된 매개 변수는 소프트웨어가 수축 피크를 식별하고 녹색 사각형 함께 표시하는 기준을 정의합니다. 이러한 값은 수축 피크 (도 3c) 및 오류없이 데이터 요소 (도 3E-F)의 정확한 식별을 위해 매우 중요하다.
      참고 : 종 의존 매개 변수 및 예제의 목록이 그림 3H에 도시되어있다. 자세한 내용은 소프트웨어 설명서를 참조하시기 바랍니다.
    4. 오른쪽 패널에서 "자동"탭을 클릭하고 "시작"버튼을 활성화하여 분석을 시작합니다. 이 소프트웨어는 다음 기록 EHT 수축 한 우물에서 순차적으로 이동 (왼쪽 패널에있는 "실시간"탭에 표시) 녹화 중에 힘을 계산합니다. 분석, PDF로 보고서의 끝에서 summari결과를 쌩쌩 자동으로 생성됩니다.
  3. 저장하고 PDF 결과를 요약 생성 시스템을보고 분석 할 수 있습니다.
  4. 며칠 동안 반복 측정에 의한 수축 매개 변수를 모니터링합니다. 이 고원 (보통 약 일 문화의 15)에 도달 할 때까지 EHT는 수축력 증가 할 것이다.
  5. 약물 검사
    1. 전날 측정 무 단백질 타이로드 용액을 조제하고, 24 웰 플레이트에서 평형 (2 ㎖ / 웰)을 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 7 % CO 2, 40 % O 2) 하룻밤 동안 120 mM의 염화나트륨, 5.4 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 0.1 mM의 CaCl2를 0.4 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 22.6 mM의 NaHCO3을 5 mM의 글루코오스, 0.05 mM의 EDTA 2 나트륨, 25 mM의 HEPES. 긍정적 수축성 영향을 조사하기 위해 1.8 mM의 또는 미리 정해진 [EC 50] 칼슘 손가락을 추가한다.
    2. 체중 및 DMSO로 약물을 용해하고, 필요한 경우, 멸균 필터.작업 농도 (DMSO)에 6 개의 서브 - 1000X 원액을 준비 (예를 들어 0.3, 1, 3, 10, 30, 각각의 나노 몰 범위 100 μM).
    3. 타이로드 플레이트의 각 재고 (물론 각 2 용액 2 μL)를 희석하고 철저하게 섞는다. 필요할 때까지 인큐베이터에서 접시를 다시 놓습니다.
    4. 웰 무균 후드 위치 탄소 전극 아래의 제 타이로드 채워진 24 웰 플레이트를 고려하여베이스 라인 측정을 시작합니다. 탄소 전극의 상부에 배치 EHTs와 PDMS 랙 이동시켜, 뚜껑을 닫고 인큐베이터에 다시 넣어 플레이트를 30 분 ~의 평형화 기간 동안 기다린다.
    5. EHT 분석 기기에서 연동 인큐베이터에서 EHTs 전송. (20 초 / EHT)을 악기를 닫고 자발적인 기준 수축력을 기록합니다.
    6. 페이싱 케이블 탄소 전극을 연결하고 EHTs (2.5 V, 4 밀리 임펄스 기간, 인간의 전기 자극으로 시작 ~ 1 ㎐, 쥐 ~ 2Hz에서, 마우스 : ~ 4 Hz에서). 은 "진행"베이스 라인 (10 초 / EHT)를 기록합니다. 모든 EHTs이 제대로 진행되었는지 확인합니다. 자극의 주파수와 전압이 세포주에서 세포 라인에 따라 다를 수 있습니다.
    7. 기준선 기록 후에 악기에서 EHTs를 제거하고 제 약물 농도로 24 웰 플레이트에, 상부에 PDMS 랙과 전극을 옮긴다. 즉시 EHT 분석 기기의 연동에 EHTs 위로 이동하고있다 (표준 약물 배양 시간 예를 들면 20 분)를 배양한다.
    8. , 페이싱 케이블을 다시 연결도 인식을 조정하고 최초의 약물 농도에 응답 EHT 수축을 기록합니다.
    9. 다음 약물 농도를 들어, 더 높은 약물 농도를 함유하는 24 웰 플레이트와 단계 3.5.7 및 3.5.8을 반복한다.
    10. 모든 PDF 녹음을 저장합니다. 수축 피크 및 아티팩트 (도 3 및 3.2.1 참조 식별 그림 인식, 녹색 사각형의 정확한 위치에 대한 각각의 기록을 확인 ).
    11. 필요한 경우 추가 오프라인 분석을 수행합니다.
      1. "실행을 선택"을 클릭하여 왼쪽 패널의 "를 실행합니다"데이터베이스에서 각각의 실행을 선택합니다. 왼쪽의 "매개 변수"탭에서 수축 분석을위한 매개 변수를 변경합니다. 이제 비디오를 재분석 오른쪽 패널에서 "오프라인"탭에서 "오프라인 분석"을 선택합니다.
      2. 그림 인식을 조정하고, 따라서 새로운 비디오 파일을 기록하려면 "실시간"탭에서 그림 인식을 조정 한 후 "샘플 리뷰"를 선택합니다. 참고 : 오프라인 분석 왼쪽에있는 "매개 변수"패널의 버튼을 "모든 우물에 대한 사용 매개 변수"를 클릭하여 모든 우물에 대한 새 매개 변수를 적용 할 수있는 반면, 샘플 검토 만 한 번에 하나의 잘 재분석 할 수 있습니다. 오프라인 분석의 두 가지 유형이 자동으로 결과를 표시하는 새로운 데이터 파일과 PDF 파일을 생성합니다.
    12. ㄴ의 결과를 조합하여 실험 분석iological는 복제 및 주파수 수축력 수축 시간과 휴식 시간 (도 5d) 및 평균 수축 피크 (도 5C)의 / 또는 그래픽 디스플레이 농도 반응 곡선의 데이터를 요약한다.
      참고 : PDMS 랙 및 PTFE 스페이서 반복 사용할 수 있습니다. (PDMS는 최대 랙 5 시간, PTFE 스페이서 끝없이). 사용 후, 물을 수동으로 청소 순수 및 오토 클레이브에 두 번 끓인다. 약물은 PDMS에 흡수 될 수로, 잠재적 인 오염 현상, 때 랙을 다시 사용에주의하십시오.

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결과

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심장 분화 EHT의 제조

HiPSC는 감소 된 성장 인자 기저막 매트릭스 확장 EDTA 밤새 스피너 플라스크에 형성 배양체 EBS ()로 분해 하였다. 3 일간 중배엽 유도 한 후, 분화는 심장의 Wnt 억제제 개시 하였다. 분화 프로토콜 ~ 십칠일 후 구타 사채는 콜라게나 제 II 형 (도 1)과 하나의 세포에 해리 하였다. EHTs 즉시 EB 해리 (도 2) 한 후 100 μL 조직 당 1.0 × 106 세포에서 심근 절연 갓 제조 하였다. 냉동 세포에서 준비 (예를 들면 상업 공급 업체)의 경우, 세포 배지에서 드롭 현명한 재 부유에 의해 해동하고 원심 분리 후 ECM에 재현 탁. 48 시간 내에서 단일 세포의 자발적인 박동이 EHT에 현미경으로 관찰되었다. 다음 ...

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토론

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설계된 심장 조직은 심장 혈관 연구의 도구 상자에 유용한 옵션을 제공합니다. 24 웰 형식의 EHTs 질병 모델링 8, 14, 약물 안전 검사 7, 8, 10, 11, 15, 또는 기본 심장 혈관 연구 16, 17에 대한 가치 입증했다.

기본적인 EHT 프로토콜 잠재적 변형 심근 비 심근 후 부하 (18) 및 강화

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공개 사항

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IM, TE와 AH는 EHT 기술 GmbH는 독일의 공동 설립자이다.

감사의 글

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저자는 재료의 그 종류 공헌 알레산드라 모레티와 데니스 샤데에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 실험 약리학과 UKE의 독성학과에서 유도 만능 줄기와 EHT 작업 그룹의 큰 지원을 인정합니다. 저자의 작업은 DZHK (심장 혈관 연구를위한 독일 센터) 및 교육의 독일 연구부 (BMBF), 독일 연구 재단 (DFG 에스 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 보조금 지원 ), 영국 국가의 중앙에 교체 정제 및 연구에 동물의 감소 (NC3Rs 균열이-IT는 35911-259146을 부여), 영국 심장 재단 RM / 3만1백57분의 13에 대한 유럽 연구위원회 (고급 그랜트 IndivuHeart), 독일 심장 재단 그리고 프레이 싶게 Hansestadt 함부르크.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EHT 분석 장비EHT Technologies GmbHA0001소프트웨어 포함
EHT PDMS 랙EHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE 스페이서EHT Technologies GmbHC0002
EHT 전극EHT Technologies GmbHP0001
EHT 페이싱 어댑터/케이블EHT Technologies GmbHP0002
24-웰-플레이트Nunc144530
6 웰-셀 배양 플레이트Nunc140675
15 mL 팔콘 튜브, 졸업 Sarstedt62,554,502
세포 스크래퍼Sarstedt831,830
스피너 플라스크Integra182 101
교반기 Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101로터 속도를 40 rpm
T175 세포 배양 플라스크로 조정 사르스테트 831,812,002
V자형 침전대 UKE 함부르크na
10×에서 맞춤 제작; DMEMGibco52100
1-티오글리세롤 Sigma AldrichM6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin-A R& D 시스템338-AC
아가로스 Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS 인슐린 Gibco17504-044
BMP-4R& D 시스템314-BP
콜라겐분해효소 II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, 타입 V (소 비장에서)Sigma D8764
도르소모르핀 abcamab120843
EDTA Roth8043.2
태아 송아지 혈청Gibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
피브리노겐 (소)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302코팅용: 1:200 희석
HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
말 세럼생명 기술26050088
인간 세럼 알부민 생물학 산업05-720-1B
인슐린, 인간시그마 알드리치I9278
L-글루타민Gibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234EHT 재조정 혼합용.
N-Benzyl-p-ToluenesulfonamideTCIB3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Penicillin/StreptomycinGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
폴리비닐 알코올 시그마 알드리치P8136
RPMI 1640 Gibco21875
나트륨 셀렌 이그마 AldrichS5261
TGFß 1Peprotech100-21
트롬빈시그마 알드리치T7513
트랜스퍼린 Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCUKE 함부르크에서 맞춤 제작na
iCell 심근 세포 키트Cellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
다막 세포 심근 세포 키트PluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC 심근 세포 키트Axiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis 심근 세포Takara Bio USA, Inc.Y10075

참고문헌

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