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방법 논문

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

11.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55463

⸱

2017년 3월 31일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에 설명된 방법은 장기 판독 게놈 염기서열 분석에 사용하기 위해 절대 생물영양 진균 병원균인 흰가루병에서 게놈 DNA를 추출, 정제 및 품질 관리하는 방법입니다.

초록

분체 곰팡이 곰팡이는 경제적으로 중요한 곰팡이 식물 병원균의 그룹입니다. 상대적으로 작은 인해 잘 발달 된 유전자와 게놈 자원의 부족 부분에 분자 생물학 및 병원체의 유전에 대한 알려져있다. 이 생물의 게놈 시퀀싱 및 조립 엄청나게 어려운 만든 대형, 반복적 인 게놈을 가지고있다. 여기서는 하나의 흰가루병 종 Golovinomyces cichoracearum에서 고 분자량의 게놈 DNA의 수집, 추출, 정제 및 품질 관리에 대한 평가 방법을 설명한다. 기술 된 프로토콜은 최적화 된 페놀 / 클로로포름 게놈 DNA를 추출하여 포자의 기계적 파괴를 포함한다. 전형적인 수율은 150 mg을 분생 당 7 μg의 DNA에 있었다. 이 절차를 이용하여 분리 된 게놈 DNA는 긴 판독 순서 (즉,> 48.5 KBP)에 적합하다. 품질 관리 대책이 게놈 DNA의 크기, 수율 및 순도를 보장하기 위해 또한이 방법에 기재된. 여기에 설명 된 품질의 게놈 DNA의 염기 서열은 조립 및 차례로 더 나은 이해로 이어질 것입니다 여러 흰가루병 유전체의 비교를이 농업 병원균의 제어를 개선합니다.

서론

흰가루병은 가지 의무적 biotrophic 곰팡이 식물의 그룹이 함께 할 때, 식물 병 전 세계적으로 하나의 가장 큰 원인, 즉 병원균이다. 분류 학적으로 가족 Erisyphaceae 2에서 다섯 개 종족으로 분류 된 흰가루병의 900 설명 종있다. 경제적 중요성과 그들의 호스트와 개발 친밀한 관계를 모두 인해, 흰가루병 질환> 100 년 연구의 대상이되어왔다. 감염시, 흰가루병이 병원균 혜택을, 세포의 구조, 신진 대사와 그 호스트의 분자 생물학의 급격한 변화를 유도. 그러나, 흰가루병의 연구는 그들의 가지 의무적 라이프 스타일, 그리고 순수 문화에 곰팡이의 성장은 아직 5, 4, 3에 설명되지 않은에 특히 도전,"외부 참조"> 6, 7, 8. 과도 변환이 어떤 종 9, 10에보고되었지만 흰가루병의 신뢰성, 안정적인 유전자 변형은 아직 완성되지 않았습니다.

흰가루병 게놈의 염기 서열 및 조립으로 인해 게놈 자체의 기능들이 어려운 입증했다. 다른 진균 유전체로 - (180 MBP 120) 기준으로 60 구성 - 흰가루병 게놈이 크고 90 % 고르게 분포 반복 소자 (11). 이러한 요소는 비 긴 말단 반복뿐만 아니라 분류 중복 요소를 포함한다. 하나의 흰가루병 종, Blumeria 그라 미니 f를 두 formae SPECIALES. SP. hordei 및 F. SP. 소맥 (년 Bgh 각각 BGT)뿐만 아니라 포도 흰가루병에 에리시 페 necator, 꿀벌이N 서열, 및 다른 여러위한 초안 게놈은 12, 13, 14을 완성 하였다. 게놈의 반복적 인 특성은 조립 어렵게 있으며, 완성 된 게놈 년 Bgh 2의 L50 메가 12 6,989 supercontigs로 조립 하였다.

큰 게놈에도 불구하고, 흰가루병은 각각 년 Bgh 및 BGT 예측 5845 개 및 6540 유전자, 단백질 코딩 유전자의 수가 적은 것으로 보인다. 시퀀싱 흰가루병은 생존 11, 12, 13, 14 그들의 숙주 식물에 진균의 의존성과 일치 다른 진균류에 필수적인 최소한 99 핵심 유전자 결여 보인다.

텔로미어, 중심절 리보솜 RN 근처 반복 서열유전자 배열과 전이 될 풍부한 영역이 제대로 짧은 판독 시퀀싱 전략 조립 및 언더 표현 게놈 어셈블리 (15)에 종종있다. 이러한 영역은 게놈 서열에서 발생하는 공극의 많은 책임을 생각하고, 이것이 반복 요소 (16)의 그 광범위한 팽창으로 흰가루병에 적용된다. 높은 플라스틱 게놈 영역은 종종 반복적 인 지역 3에서 발견된다. 이들은 염색체 재 배열 사이트로서 기능하고 종종 이펙터 단백질을 코딩하는 유전자 및 이차 대사 효소를 코딩하는 유전자와 같은 강력한 선택 압력하에 유전자를 인코딩한다. 단일 분자 긴 읽기 시퀀싱 기술의 발전은 유전체 (15)의 반복적 인 지역에 걸쳐 순서에 대한 잠재적 인 솔루션을 제공합니다. 예를 들어, Faino 등. (2015)을 포함하여 긴 시퀀스 기술과 광 m 읽어 발견apping 유전자 주석 유전자 주석의 수를 증가 (및 일부의 수를 감소 시키거나 누락 게놈의 반복 DNA 서열의 비율 배로 그들을 곰팡이 병원균 Verticillium 달리아 두 균주 갭리스 게놈 시퀀스를 생성하도록 허용 ) 및 계시 게놈 17 재구성.

최소 크기> 20 KBP 이러한 긴 읽기 시퀀싱 기술, 고품질의 게놈 DNA의 높은 농도를 사용하려면 필요하다. 여기에서 우리는 분생 포자로부터 포자 수집, 고 분자량의 DNA의 정제를위한 우리의 방법을 설명하고 흰가루병 종 Golovinomyces cichoracearum를 사용하여 우리의 품질 관리 평가는 오이 (18)에 성장. 이 프로토콜은 켈러 B. 실험 그룹 (쮜리히 대학, 스위스 취리히) (13), (19)에서 개발 된 프로토콜에 기초증가 DNA 수율 주도 여러 변형 및 크기의 DNA> 48.5 KBP의 높은 비율을 포함한다. 이 프로토콜은 또한 연구소 20, 21, 22 에너지 공동 게놈의 미국학과의 추천에 따라 품질 관리 단계를 포함한다.

용해 완충액에 포함 된 각 시약 및 각 정제 단계에 근거하는 기능 등 (2008) 23 헨리에 기재되어있다. 식물과 미생물 조직에서 고 분자량 게놈 DNA의 분리에 사용할 수 게시 된 프로토콜은 또한이 프로토콜 24, 25, 26, 27, 28의 설계시 협의했다.

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프로토콜

곰팡이 재료 1. 준비

  1. 흰가루병 성장
    1. 다음의 조건으로 성장 챔버에 식물을 성장 : 22 ° C 일 온도 20 ℃ 밤 온도, 80 % 상대 습도, 14 시간 낮 길이 125 μE / m 2 / s의 광 강도 (형광등에 의해 제공된 ).
    2. 18, 29 설명 Golovinomyces cichoracearum 변형 UCSC1 오이 식물 (쿠쿠 미스 사티의 다양한 부시 챔피언) 감염.
  2. 수확 흰가루병 분생 포자
    1. 생포 축적 된 인 - 라인 필터 (11 μm의)와 작은 진공을 이용하여 접종 10 일 - 7에 감염된 식물을 수확 분생. 부드러운 압력을 적용, 분생 포자를 수집하는 잎의 표면을 따라 진공 노즐을 실행합니다.
      참고 : G.의 cichoracearum의 평균 수익률은 크게 infe에서 분생 포자의 20 밀리그램이다면적이 약 130cm 2 cted 오이 잎.
    2. 깨끗한 종이 상에 필터로부터 (7-8 감염된 오이 잎으로부터 약 375 μL 부피 또는 분생) 분생 포자 약 150 mg의 브러시. 여기에서, (액체 질소)에서 미리 냉각 두 32분의 5 인치 직경의 스틸 밀링 볼 2 mL의 크리오 바이알 (cryovial)의 분생 포자로 옮긴다. 즉시 액체 질소로 튜브를 반환한다. -80 ° C에서 보관 튜브.
  3. 볼 밀링에 의해 속보 열기 분생 포자
    1. 플래시를 액체 질소 중에서 볼밀 알루미늄 판을 고정. 로드는 볼 밀 랙에 크리오 바이알 (cryovial). 격렬 (실온) 30 회 / 초에서 30 초 동안 볼 밀에서 분생 스틸 볼과 크리오 바이알 (cryovial)을 흔들어. 즉시 액체 질소에서 재 냉동을 크리오 바이알 (cryovial).
      참고 : 처음에, 연마하는 동안 세포 벽 파열의 효율을 100 배 배율에서 현미경으로 분생 포자의 샘플을 액세스 할 수 있습니다. 30 회 / 초, B 30의 2 라운드 - 필요한 경우, 추가로 1 갈기유타는 최소로 라운드의 수를 유지한다. 최적의 조건이 성립 된 후,이 단계에서 현미경으로 포자 파손 평가 루틴은 불필요하다.

2. 게놈 DNA 정제

  1. 분생 포자 용해
    1. 빨리 작업, 해동 분생 포자를 방지 자석 크리오 바이알 (cryovial)에서 강구를 제거합니다. 슬러리가 형성 될 때까지 10 초 - 65 μL 700 ° C의 용해 완충액 (표 1) 및 선회 (5)를 추가한다.
    2. 300 μL (65 °의 C) 예열 된 5 % (v / v)의 sarcosyl 추가 부드럽게 섞어 다섯 번 (3 초 당 1 개 반전) 반전. 65 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션 튜브; 10, 20, 30 분에서 3 시간 온화하게 반전. 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여, 새로운 2 ML의 마이크로 원심 튜브에 전 용액을 옮긴다. 이후의 모든 단계에서, 부드럽게, 천천히 반전에 의해 혼합 넓은 구멍 피펫 팁으로 DNA 함유 솔루션을 전송합니다.
  2. DNA 추출 I
    1. 클로로의 1 볼륨을 추가성상 : 이소 아밀 알코올 : 부드럽게 용해 용액 (24 1 V / V)과 5 회 혼합 바꾸. 부드럽게 배양의 끝에서 다시 중간 지점에서 다섯 번을 혼합하는 반전, 실온에서 10 분 동안 품어. 14,000 × g에서 15 분 동안 실온에서 원심 분리기. 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 조심스럽게 새로운 2 ML의 마이크로 원심 튜브에 수성층을 전송; 계면으로부터 재료를 포함하는 피.
  3. DNA 강수량 I
    1. 1 볼륨 실온 100 % 이소프로판올 (약 750 μL)을 추가하고 부드럽게 여섯 번 섞어 반전. 14,000 × g에서 15 분 동안 실온에서 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 폐기합니다.
    2. 450 μL 사전 냉장 (-20 ° C) 70 % 에탄올을 추가합니다. 14,000 × g으로 실온에서 5 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 폐기합니다. 조심스럽게 미세 피펫 팁으로 뜨는을 제거하고 폐기, 3 초 동안 1,000 XG에서 원심 분리기. 15 분 A의 펠릿을 공기 - 건조t 실온. 15 분 이상 건조하지 마십시오.
    3. 300 μL TE의 펠릿 (10 mM 트리스 - (CL), 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 pH 8.0)에 재현 탁. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션. 부드럽게 솔루션에 가지 않았다 잔여 물질을 재 부유 버려.
  4. , RNA 오염 제거 10 μL의 RNase A (10 ㎎ / ㎖)을 첨가한다. 부드럽게 세 번을 섞어 반전. 3 초 동안 1,000 XG에서 원심 분리기. 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
  5. DNA 추출 II
    1. 300 μL를 페놀 추가 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1 v / v)로 부드럽게 다섯 번을 섞어 반전. 부드럽게 배양의 끝에서 다시 중간 마크에서 다섯 번을 혼합하는 반전, 실온에서 10 분을 품어. 14,000 × g으로 실온에서 15 분간 원심 분리기. 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여, 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상기 상층 액을 전송.
  6. DNA 강수량 II
    1. 0.01 부피 3 M 아세트산 나트륨 pH를 5.2 (approximatel 추가Y 3 μL), 부드럽게 다섯 번을 섞어 반전. 2.5 볼륨 사전 냉장 (-20 ° C) 100 % 에탄올 (약 750 μL)를 추가합니다. 부드럽게 다섯 번을 섞어 반전. -20 ℃에서 하룻밤 품어
    2. 원심 분리기에서 14,000 × g에서 4 ℃에서 30 분. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 폐기합니다.
    3. 450 μL 사전 냉장 (-20 ° C) 70 % 에탄올을 추가합니다. 14,000 × g에서 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 폐기합니다. 3 초 동안 1,000 XG에서 원심 분리기. 조심스럽게 미세 피펫 팁 및 폐기에 뜨는을 제거합니다.
    4. 실온에서 30-60 분 동안 펠렛을 공기 - 건조. 27.5 μL TE의 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션. 부드럽게 솔루션에 가지 않았다 잔여 물질을 재 부유 버려.
    5. 분취 품질 관리 시험 22.5 μL TE (최종 부피 25 μL)에 2.5 μL (아래 참조). 시퀀싱을 위해 제출 될 때까지 4 ℃에서 저장 DNA 샘플. 장기 보관, 저장 샘플의 경우및 -80 ° C에서 전단을 방지하기 위해 동결 - 해동 사이클을 최소화 할 수 있습니다.
      참고 : 제대로 피펫 어려울 수있다 고 분자량 게놈 DNA로이 단계에서 피펫 팅 할 때주의하십시오, "QC 나누어은"게놈 DNA 샘플의 정확한 표현인지 확인하는 것이 중요하다.

3. 품질 관리

  1. 샘플 순도
    1. TE에 빈을 사용하여, 작은 볼륨 분광 광도계에 QC 나누어지는 1 μL를로드하여 DNA의 샘플 순도를 평가합니다. 기록 A260 / A280 및 A260 / A230 수치. 순수한 DNA는 1.8과 2.2 사이에 약 1.8 A260 / A230의 비율 A260 / A280 비율을 가질 것이다.
  2. 게놈 DNA의 정량화
    1. 제조업체의 지침에 따라 상업 이중 가닥 DNA 정량 분석 ​​키트를 사용하여 품질 관리 나누어의 정량화를 수행합니다.
  3. DNA 품질 평가 I
    1. 부하 약 60 ng의 게놈 DNA 및1X TAE (40 개 mM 트리스, 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA, pH를 8.0)에 0.7 % 아가 로즈 겔상에서 DNA 사다리. 70 V 40 겔 실행 장치 - 게놈 DNA 밴드까지 45 분 정도 사다리에서 잘 분리 대역에서 2cm이다 명백하다. 이러한 조건은 가능한 겔 전기 영동 장치에 기초하여 조절 될 필요가있다.
  4. DNA 품질 평가 II
    1. 부하는 약 60 0.5X의 TBE (44.5 mM 트리스, 445 mM의 붕산, 1 mM의 EDTA, pH를 8.3) 및 1 % 아가 로스 겔상에서 게놈 DNA 및 (펄스 필드 겔 전기 이동에 적합) 고 분자량 DNA 사다리 겨 16 시간 동안 80 KBP 파형 펄스 필드 겔 전기 프로토콜 - 5을 사용하여 0.5X TBE를 실행하는 버퍼에서 실행.
  5. 세균, 곰팡이 및 공장 오염 물질의 평가
    1. 프라이머 및 증폭 조건을 이용리스트 리보솜 유전자의 적절한 전사 내부 스페이서 (ITS) 영역을 증폭하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행표 2에 에드. 겔에서 얻어진 반응 하중 10 μL.
      참고 : ITS 지역 ITS 프라이머 곰팡이로 증폭해야 흰가루병을 나타내는 밴드. 이 앰플 리콘 및 세균 또는 식물 프라이머로부터 생성 된 앰플 리콘 DNA는 오염의 근원을 결정하기 위해 서열화한다. 만 흰가루병은 ITS 시퀀스는 곰팡이의 증폭에서 찾을 수 있습니다.

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결과

G.로부터 정제 된 게놈 DNA를 60ng의 대표적인 예는 겔 전기 영동을 사용하여 아가로 오스 겔상에서 실행 cichoracearum 및 펄스 필드 겔 전기 영동을 사용하는 각각도 1 및도 2에 나타낸다. 소폭 통과하고 품질 관리를 실패 패스 게놈 DNA 제제를 나타낸다. 완벽한 품질 관리를 통과 게놈 DNA의 준비는 긴 읽기 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 시퀀싱에 이상적입니다. 가장자리 품질 제어를 전달 제제는 허용하지만, 충분히 전달 제제가 바람직하다. 품질 관리 실패 준비는 긴 읽기 게놈 시퀀싱 방법에 대한 허용되지 않습니다.

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토론

가지 의무적 biotrophic 흰가루병 균 순수한 고 분자량의 게놈 DNA를 얻기 위해, 전술 한 방법의 변형 된 버전 (30)를 개발 하였다. 이 최적의 프로토콜을 이용하여 평균 수율은 150 mg의 분생 당 7 μg의 DNA를, 종래의 프로토콜로 얻어진 수율의 두배이다. 또한, 평균 크기는 48.5 KBP에 걸쳐 약 20 KBP에서 증가했다. 이 프로토콜은 cucumber- G.의 cichoracearum 시스템에 최적화되었다. biotrophic 곰팡이를 다른 흰가루병에서 최고의 품질과 높은 순도의 DNA를 얻거나 의무를하기 위해이 프로토콜의 추가 수정이 필요할 수 있습니다. 추가 수정이 요구 될 수 있지만 나중에,이 프로토콜은, 다른 가지 의무적 biotrophic 곰팡이로부터 판독 긴 DNA 서열에 대한 고 분자량의 DNA가 적절한 획득하는데 사용될 수있다.

우려가 높은 수율 DNA 추출 DNA의 높은 분자...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 프로토콜은 Joint Genome Institute-Community Sequencing Project(#1657)를 지원하기 위해 개발되었습니다. 이 연구는 Philomathia Foundation, National Science Foundation (#0929226) 및 Energy Biosciences Institute to S. Somerville의 일부 지원을 받았습니다. 스위스 국립 과학 재단 (# 310030_163260)에서 B. Keller에게. 여기에 설명된 프로토콜을 개발할 때 관대한 조언과 자발적인 프로토콜에 대해 M. Figureroa와 M. Miller(미네소타 대학교), R. Panstruga(RWTH Aachen University), C. Pedersen(코펜하겐 대학교), P. Spanu(임페리얼 칼리지), J. Taneja(캘리포니아 버클리 대학교), M. Wildermuth(캘리포니아 버클리 대학교), R. Wise(아이오와 주립 대학교) 및 S. Xiao(메릴랜드 대학교)에게 관대한 조언과 자발적인 조언에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MM400 볼 밀Retsch20.745.0001또는 동등한 볼 밀
2 mL 튜브 볼 밀Sarstedt 72.694.007
5/32" 스테인리스 스틸 밀링 볼OPS 진단GBSS 165-5000-01
마이크로프로세서 제어 280 시리즈 수조 사전 설정 65°deg; 씨 Thermo Fisher Scientific2825또는 동등한 수조
마이크로프로세서 제어 280 시리즈 수조 사전 설정 37 ° CThermo Fisher Scientific2825또는 동등한 수조
Eppendorf 5417R 냉장 마이크로 원심분리기Krakeler Scientific 38-022621807또는 동등한 마이크로 원심분리기
클로르포름:IAA (24:1 v/v)Sigma-Aldrich C0549피부 접촉 또는 흡입 시 위험함. 니트릴 장갑, 보호 안경, 실험실 가운을 착용하고 화학 후드에서 작업
페놀 : 클로로포름 : IAA
(25 : 24 : 1 v / v)		Thermo Fisher Scientific15593031피부 접촉 또는 흡입시 위험합니다. 니트릴 장갑, 보호 안경, 실험실 코트를 착용하고 화학 후드에서 작업
. 100% 이소프로판올Sigma-Aldrich 
100% 에탄올시그마-알드리치 34923-20으로 냉각 > C 사전 사용
나트륨 아세테이트 시그마-알드리치 S2889
Rnase, Dnase-free (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificEN0531
포타슘 메타중아황산염시그마-알드리치 P2522
나트륨 라우릴 사크로이네이트 시그마-알드리치 L9150
트리스 베이스시그마-알드리치 
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)시그마-알드리치 EDS
염화나트륨 (NaCl)시그마-알드리치 S9888
세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)시그마-알드리치 H6269
Uvex by Honeywell, Futura 고글, S345C, Uvextreme스테이플423263또는 동급 안경
High Five COBALT 니트릴 장갑, LARGE, Neta ScientificHFG-N193또는 동급 장갑
GelRed 핵산 젤 염색 10,000x in waterBiotium41003
Ethidium Bromide 10 mg/mLBiotium40042피부 접촉의 경우 위험합니다. 니트릴 장갑과 보호 안경을 착용
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb CHEF DNA 크기 표준Bio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172또는 이에 상응하는 펄스필드 젤 아파라투스
Whatman 품질 여과지, 1등급시그마-알드리치 WHA1001042또는 이와 동등한 성장 챔버
Percival Growth ChamberPercivalAR66LXC9
NanoDrop 8000 UV-Vis 분광 광도계Thermo Fisher ScientificND-8000-GL또는 동등한 분광 광도계
Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트Thermo Fisher ScientificP11496
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50x)Thermo Fisher ScientificB49사용 전에 물로 1/50을 희석하십시오 (1x)
TE 버퍼Thermo Fisher Scientific12090015 
Tris-Borate-EDTA, 10x 용액 (전기영동)Thermo Fisher ScientificBP13334사용 전에 물로 1/10을 희석하십시오 (to 1x)
액체 질소액체 질소 (-196 ° C)는 동결 위험입니다. 또한 따뜻해지면 빠르게 팽창하므로 단단히 밀폐된 용기에 보관해서는 안 됩니다
링 하십시오 하십시오W29290710708976001, 하십시오

참고문헌

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