우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
알러지 유발 물질과 병원균의 흡입은 폐의 면역 세포 유형의 다양한 여러 변화를 이끌어 낸다. 유동 세포 계측법은 면역 세포에 세포 표면 단백질의 정량 분석을위한 강력한 기술이지만, 폐 내에서 이러한 세포의 현지화 및 이동 패턴에 관한 정보를 제공하지 않습니다. 마찬가지로, 화성 분석은 체외에서 화학 주성 인자에 반응하는 세포의 가능성을 연구하기 위해 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 전술 한 기술들에 대조적으로, 폐 내의 각각의 세포 유형의 위치를 용이하게 시판되는 형광 태그 항체로 염색 정밀 절단 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 공 초점 현미경에 의해 부분을 시각화 시각화 할 수있다. PCLS 살 모두 사용과 폐 조직을 고정하고, 슬라이스 전체 엽 단면 한 큰 영역을 포괄 할 수있다. 우리는 성공적으로 수지상 세포의 구별 유형, 대 식세포, 호중구, T 세포와 B 세포뿐만 아니라, 림프, 내피 등의 구조 세포를 포함 폐에서 세포 유형의 다양한의 위치를 시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고있다 상피 세포. 세포가 폐 내에서 이동 및 정상 상태에서 염증 동안 서로 상호 작용하는 방식을 라이브, 입체 폐 조직에서 수지상 세포와 T 세포 사이 것과 같은 세포 상호 작용을 시각화하는 능력은 공개 할 수 있습니다. 같은 유동 세포 계측법 및 정량 PCR과 같은 다른 절차와 함께 사용하는 경우 따라서, PCLS는 폐의 알레르기 성 및 염증성 질환의 기초가 세포 사건의 포괄적 인 이해에 기여할 수있다.
서론
이러한 지질 다당류 (LPS)와 같은 염증성 자극의 흡입 후,이 내에 면역 세포의 조정 움직임, 그리고 폐에서. 예를 들어, 호중구는 빠르게 폐 실질과기도로 모집하고 있습니다. 또한, 종래의 수지상 세포 (CDCS)로 알려진 몇몇 전문 항원 제시 세포는 비교적 복잡한 이동 패턴 1, 2 겪는다. CDCS은 표면 마커들의 디스플레이하는 CD11c에 부분적으로 유세포하여 식별 기초 할 수있다. 수지상 고유 서브 세트 CD103 및 CD11b를 3 차 표면 발현에 의해 구별 될 수있다. 흡입 된 항원을 취득하면, 일부 CDCS 폐 빠져가 항원 특이 적 T 세포 위해 4 펩티드를 제시 폐 배수 림프절 (림프절)에 림프관을 통해 이동한다. 이 적응성 면역 연구의 시작에 중요한 초기 이벤트esponses. 알 수없는 이유로, 그러나, 흡입 항원을 획득 모든 CDCS는 폐를 떠나, 이러한 세포의 대부분은 몇 달 5 해당 기관에서 6 남아있다. 단핵구 유래의 CD11c + 케모카인 수용체, C....
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프로토콜
이 문서에 설명 된 동물 실험 절차는 NIEHS 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 폐 제조
- 제도적 동물 관리 및 사용위원회에 의해 제공되는 지침에 따라 특정 병원균이없는 조건에서 생후 6 12 주 사이 하우스 마우스.
참고 : 몇 군데 마우스는 각 연구자의 특정 관심 분야에 따라, 순진, 또는 처리 될 수 있습니다. 여기서는 50 μL의 총 부피의 비히클로 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여, 나이브 마우스에 100 μg의 난 알부민 (OVA) 및 0.1 μg의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)로 처리 된 마우스에 면역 세포 제이션을 설명한다. oropharyngeally기도에 OVA / LPS를 주입하기 위해 동물 이소 플루 란 흡입 마취와 수직으로 고무 밴드와 함께 자신의 치아에 의해 중단되었다. 혀 부드럽게 포셉 파지 연하 방지 한쪽 유지하고 50 #시켰다181; 구강의 후면에 증착 된 OVA / LPS 용액 L은 앞서 설명한 17. - 나트륨 펜토 바르 비탈 (100 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사로 마우스를 안락사 및 폴리스티렌베이스 동물 핀.
- 턱 복부까지의 중앙으로부터 피부와 복막 절단 가위로....
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결과
C57BL / 6 마우스에서 두 개의 DC 서브 세트들의 위치, CD11b를 하이 CDCS 및 CD103 + CDCS, PCLS 식별로 절단하는 CD11c 특이 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)로 염색하고, CD88, CD103 및 CD324 (E-cadherin의). CD324 얼룩기도 상피 세포에 대한 항체 및 CD88은 대 식세포와 호중구,하지만 CDCS (8)에 표시됩니다. 이것은 우리의 CD11c + 대 식세포에서 CDCS를 구별하고,기도 (도 1)에 각 세포 유형의 공간적 관계를 관찰 할 수 있었다. 우리는 CD103 + CDCS는 주로기도와 subpleural 지역의 주위에있는 반면, CD11b를 하이 CDCS는 실질에 지역화 것을 발견했다. CD103 + CDCS.......
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토론
여기에 설명 된 프로토콜은 원래의 폐 CDCS의 두 부분 집합의 위치를 시각화하기 위해 개발되었다. 그러나,이 프로토콜은 쉽게 세포 생존 및 폐의 3 차원 구조를 유지하면서, 다양한 세포 유형을 공부하고 적용 할 수 있습니다. 후자의 기능은 세포 배양 시스템에 비해 중요한 장점이다 희귀 세포 유형의 식별을 용이하게한다. 상기 방법은 폐에서 PCLS의 발생에 의존하고, 배경 얼룩을 최소화하면서 항체의 적절한 조합이 특정 세포 유형을 식별. 큰 정도,이 유동 세포 계측법을 포함한 다른 응용 프로그램에서 잘 작동 항체가 반드시 PCLS을 염색 잘 작동하지 않기 때문에 경험적인 운동이다. 우리는 이미이 점에서 상당한 진전을 만들었습니다, 그러나 여기에서 다루지 않은 세포 유형을 공부하고자하는 연구자들은 서로 다른 항체를 테스트하고 형광 색소와 농도를 최적화 할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 CD103 + CDCS와 CD11b.......
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공개 사항
저자는 선언하는 이해 관계의 충돌이 없습니다.
감사의 글
우리는 현미경과의 도움을 제프 터커, 에리카 스카피니, 그리고 아그네스 Janoshazi 감사합니다, 비판적 읽기 마우스 식민지의 그녀 관리를위한 라이곤 페로우 및 준 첸와 마이클 샌더슨 조직 슬라이서에 대한 도움말, 마이클 Fessler 데릭 가인 원고. 이 작품은 결과적으로 보건 복지부가 후원하는 NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09)의 교내 지점에 의해 투자되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 마우스 | 잭슨 연구소 | 000664 | |
| Prox1-TdTomato 형질전환 마우스 | 잭슨 연구소 | 018128 | B6; 129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA 특이적 TCR x Nur77-GFP 형질전환 마우스 | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 녹아웃 마우스 | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| 폴리에틸렌 튜빙 (비멸균) 100 ft | BD 진단 시스템 | 427421 | 0.86 mm 내경, 1.27 mm 외경 |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2 % 용액은 70 °C에서 PBS에 용해됩니다. C에서 40 °C로 유지되었습니다. |
| 컴프레스톰 VF-300 | 정밀 기기, Inc. | VF-300 | |
| 양날 스테인리스 면도날 | 전자 현미경 과학 | 72000 | 일회용; 250/상자. 모든 폐에 대해 블레이드를 교체해야 합니다. |
| Krazy Glue 모든 목적 인스턴트 젤 | VWR | 500033-484 | 일반적으로 현지 약국에서 튜브당 $3에 구할 수 있습니다 |
| Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 레드 | 없음 ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| 노멀마우스혈청(NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| 염색 완충액 | 0.5% 소 혈청 알부민, 0.1% NaN3, pH 7.4 | ||
| Fc 차단제(항-CD16/32 항체) | Made in House | N/A | 배양된 하이브리도마 세포주 2.4G2 |
| 항-마우스 CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | 안티 마우스 CD11b eFluor 450 (클론: M1/70) |
| 안티 마우스 CD11c 브릴리언트 바이올렛 605 | BioLegend | 101237 | 브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD11c (클론 : M1 / 70) |
| 안티 마우스 CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE 복합 안티 마우스 CD11c (클론 : N418) |
| 안티 마우스 CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen 550261 | APC 표지 안티 마우스 CD11c 9클론 : HL3) | |
| 안티 마우스 CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE 안티 마우스 CD88 (클론: 20/70) |
| 안티 마우스 CD103 알로피코시아닌 | eBioscience | 17-1031-82 | 안티 마우스 CD103 APC (클론: 2E7) |
| 안티 마우스 CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | 안티 마우스 CD90.2 eFluor 450 (클론: 53-2.1) |
| 안티 마우스 CD172a/Sirp1a 알로피코시아닌 | eBioscience | 17-1721-82 | 안티 마우스 CD172a APC (클론: P84) |
| 안티-마우스 CD324 브릴리언트 바이올렛 421 | BD 호라이즌 | 564188 | BV421 마우스 안티-E Cadherin (클론: 5E8 일컬어 5E8-G9-B4) |
| 안티-마우스 CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (클론: DECMA-1) |
| 안티-마우스 CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (클론: DECMA-1) |
| 유리 바닥 Microwell 접시 35 mm 페트리 접시, 14 mm Microwell, No. 1.5 커버글라스 | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek 챔버 커버글라스 | ThermoFisher Scientific | 155411PK | 16 개 팩 |
| 15 mm 커버슬립, No. 1.5 유리 두께 | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| 베어 플래티넘 와이어 | 세계 정밀 기기 | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) 직경을 ~1cm 길이의 조각으로 자르고 "L" 모양으로 구부림 |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | 4°C 유지; C, 사용하기 전에 실내 온도로 따뜻하게하십시오. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 다광자 레이저 스캐닝 현미경 | Carl Zeiss | Zen Black 소프트웨어 버전 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
참고문헌
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A.
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재인쇄 및 허가
