담관의 보행을 연구하기위한 Whole-mount Immunohistochemical method의 사용 Suncus murinus

요약

Suncus murinus 의 외 간성 담도계에서 neurofilament 단백질 발현을 시각화하기위한 whole-mount immunohistochemical 접근법 . 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜은 S. murinus 또는 다른 종의 모든 내장 기관의 innervation을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

이 작품은 전체 마운트 immunohistochemistry 얼룩 방법을 자세하게 설명합니다, 신경 섬유 단백질 항체를 사용하여 Suncus murinus ( S. murinus 의 담즙 기관의 innervation을 표시하기 위해   ). 먼저 표본을 S. murinus 에서 해부시키고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정시켰다. 둘째, 효소 처리 및 잠재적 인 내재적 퍼 옥시 다제 불 활성화가 수행되었다. 그 다음, 시험편을 1 차 항체, 항 - 신경 필라멘트 단백질 항체에 3-6 일 동안 노출시켰다. 이어서, 양 고추 냉이 과산화 효소가 접합 된 2 차 항체와 함께 항온 배양 하였다. 표적을 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB) 기질과 반응시켜 발색 반응을 나타내었다. 이 방법은 모든 내장 기관의 신경 분포 분석에 적용 할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 다른 뉴런 항체를 테스트하기 위해 적응할 수 있지만, 항체의 최적화es가 먼저 수행되어야합니다. 이 방법은 원래 Kuratani와 Tanaka ^{1 , 2 , 3} 에 의해 도입되었습니다.

서론

집 사향 갈기 , Suncus murinus , 주문 Insectivora과 가족 Soricidae에 속한다. 이 작은 포유 동물은 동남 아시아 전역에 분포하며 인간의 거주지 또는 소 펜 ⁴ 근처에 위치한 잔디와 풀밭에 서식합니다. 이 종은 마우스, 쥐 및 토끼와 같은 다른 실험 동물보다 인간과 더 유사한 일반적인 형태학적인 특성을 나타낸다. 이전에, S. murinus neurofilament protein (NFP)에 대한 말초 신경 마커를 이용한 whole-mount immunostaining은 췌장 ⁶ , 주요 십이지장 유두 ⁷ , 유두 ⁸ , 담낭 ⁵ 및 간외 담도 ⁹ 에서 말초 신경을 표지하기 위해 사용되었습니다.

NFP는 성숙한 신경 세포 뼈대의 일부인 거대 분자 복합체입니다. 신경 필라멘트 관련 단백질NFP와 접합체 사이의 상호 작용을 매개한다. 효소 기능과 링커 단백질의 구조는 NFP ¹⁰ 에 의해 조절됩니다. NFP 복합체는 NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) 및 NF-H (200 kDa)의 세 가지 폴리 펩타이드로 이루어져 있습니다. NFP는 중추 신경계와 말초 신경계에서 신경 세포의 축색 돌기에서 발견 될 수 있습니다. 항 인간 NFP 항체는 중추 신경계와 말초 신경계의 축삭을 표지하는 것으로 나타났습니다. 해부학 적 및 전기 생리 학적 연구 결과에 의하면 괄약근, 담낭 및 근위부 위장관은 ^{11 , 12 , 13 , 14} 로 연결되어 있음이 입증되었습니다. 그러나, 그들의 연결 연결의 형태 학적 특징은 아직 정의되지 않았다.

이 연구는 S. murinus bil의 innervation을 표시하기 위해 whole-mount immunohistochemical 염색법을 사용하는 방법을 보여줍니다NFP 항체가있는 iary tract.

프로토콜

모든 실험 절차는 도쿄 도립 대학 동물 애호 관리위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험실 동물 의 관리와 사용을위한 안내서와 동물 보호에 관한 캐나다위원회 의 실험 동물 의 관리와 사용 안내서에 따라 동물을 수용하고 취급했습니다. 우리는 일본 동경 메트로폴리탄 대학교 (Functional Morphology Laboratory) 프런티어 보건 과학부에서 사육되고 유지 된 동물들을 사용했습니다.

1. 동물 배려 및 주거

1. 폐쇄 형 번식 식민지에서 7 S. murinus (암컷 3 마리와 체중 70 ~ 90g의 4 마리)를 얻습니다.
2. 종이 스트립이 들어있는 나무 둥지 상자가있는 플라스틱 케이지에서 이유 후 (출생 후 20 일) 개별적으로 S. murinus를 감금하십시오. 전통적으로 컨디셔닝 된 동물 룸 (23-27 ° C), 습도 조절 장치, 12시 12시 (h : 12시 12 분)의 암흑 사이클을 유지하십시오. 공급 commerc송어 알갱이와 물을 자유롭게 먹는다.

2. 조직 준비

1. 4 % (w / v) 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비하기 위해 PFA 40g을 0.01M 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, pH 7.4) 1,000mL에 녹인다. 흄 찬장에서 용액이 깨끗해질 때까지 와동을 사용하여 혼합하십시오. 4 % PFA O / N를 4 ℃에서 보관하십시오.
   주의 : PFA를 취급 할 때는 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오.
2. 동물을 관류 및 고정하기 위해 에테르로 마취 한 다음 somnopentyl (pentobarbital sodium, 0.6 mL / kg bodyweight)을 복강 내에 주입하십시오.
3. 동물이 완전히 마취 된 후, 메스로 복강을 열고 3cm 정도의 중간 선 복부 절개를 만듭니다. 대동맥을 절개하는 동안 대정맥을 절개하면서이 동맥 분기점 바로 위의 복부 대동맥에 복강 내 카테터를 삽입하여 장골 동맥을 만든다.
4. somnopentyl을 주사하십시오 (그래서 pentobarbital1.0 mL / kg 체중). 완전한 안락사 후, 0.01 M PBS (pH 7.4)로 관류시킨 다음 흄 찬장에서 4 % PFA로 관류시킨다.
5. 관류 후, 흰 네오프렌 라텍스 (증류수 (DW)가있는 희석 된 흰색 네오프렌 라텍스 3 : 2) 2 ~ 3 mL를 혈관에 라벨을 붙이도록 주사합니다.
6. 간, 담낭, 총 담관, 십이지장 및 췌장을 포함한 복부 기관을 관련 신경 및 혈관과 함께 추출합니다.
7. 담낭에 약 12 ​​mL의 파란색 네오프렌 라텍스 (희석 한 흰색 네오프렌 라텍스 10 mL에 파란색 잉크 한 방울 넣기)를 담낭에 약 0.1 mL 주입하십시오.
8. 전체 마운트 면역 염색을 위해 4 ℃에서 4 % PFA로 밤새 수정하십시오.
   주의 : PFA는 유독합니다. PFA를 직접 취급하지 마십시오. PFA는 연기 찬장에서 사용해야합니다.

3. Whole-mount Immunohistochemistry

참고 : 세척, 항체 배양 및 착색을 포함하여 프로토콜 전반에서 the 시편은 4 ℃에서 또는 RT에서 가볍게 흔들어 고정 장치에 남아 있어야합니다 ^.

1. 1 일 : 잠재적 인 내인성 퍼 옥시 다제의 효소 처리 및 불 활성화
   1. DW 4x로 준비된 시험편을 RT에서 적당한 크기의 유리 병에 1 시간 씩 씻으십시오. PFA를 제거하기 위해 시료를 nutator에서 조심스럽게 흔들어주십시오. 솔루션을 교환 할 때 표본이 손상되지 않도록하십시오.
   2. 1 % (w / v) 오르토과 요오드 산을 준비하려면 DW 100 mL에 1 g의 오르토 요오드 산을 용해시킨다.
   3. 내재 peroxidase 반응을 방지하기 위해 RT에서 20 분 동안 1 % orthoperiodic 산성에서 표본을 품어.
   4. 0.04 mol / L Tris-HCl 완충액 (pH 7.6) 100 mL에 파파인 0.004 g을 녹여 0.004 % (w / v)의 파파인을 준비한다.
   5. DW로 표본을 RT에서 10 분 동안 씻으십시오.
   6. 부드러운 흔들림이있는 항온조에서 37 ° C에서 2 시간 동안 새로 준비한 0.004 % 파파인으로 표본을 배양하십시오.
   7. D로 표본을 씻는다.W에서 50-60 분 동안 처리 하였다.
   8. 4 ° CO / N에서 4 % PFA에 검체를 보관하십시오.
2. 2 일째 : 효소 처리
   1. 보관 된 시험편을 DW로 4 시간 동안 RT에서 1 시간 씩 씻으십시오.
   2. 부드러운 흔들림이있는 항온조에서 37 ° C에서 2 시간 동안 새로 준비한 0.004 % 파파인으로 표본을 배양하십시오.
   3. DW로 표본을 RT에서 50-60 분 동안 씻으십시오. 4 ° CO / N에서 4 % PFA에 검체를 보관하십시오.
3. 3 일째 : 동결 치료
   1. 위와 같이 저장된 표본을 DW 4x로 각각 1 시간 동안 RT에서 씻으십시오.
   2. 2.5 g, 5 g, 10 g의 자당을 각각 0.01 M PBS 100 mL에 녹여 2.5 % (w / v), 5 % (w / v), 10 % (w / v) pH 7.4).
   3. 2.5 % (w / v), 5 % (w / v) 및 10 % (w / v) 자당에 각각 30 분 동안 표본을 담그십시오.
   4. -20 ° C에서 30-60 분 동안 표본을 동결시킨 다음 RT에서 완전히 녹입니다. 3x 사이클을 반복하십시오.
   5. 피2 % Triton X-100 (v / v)을 다시 채우고 0.01 M PBS (pH 7.4) 100 mL에 2 mL의 Triton X-100을 첨가한다.
   6. 4 % CO / N에서 2 % Triton X-100에 시험편을 보관하십시오.
4. 주 4 : 일차 항체 배양
   1. BSA (Bovine Serum Albumin) 0.2g, Triton X-100 0.3mL 및 sodium azide 0.1g을 0.01M PBS (pH 7.4) 100mL에 녹여 1 차 항체 희석액을 준비한다.
      주의 : 나트륨 아자 이드는 매우 독성이 있습니다. 흡입과 접촉은 피해야합니다. 적절한 PPE를 착용하십시오.
   2. 1 차 항체 (NFP) 1 : 600을 상기 희석 완충액 (단계 3.4.1)에서 희석한다. 검체가 Nator 항체로 4 ° C에서 3 ~ 6 일 동안 배양하여 표본이 nutator에서 부드럽게 흔들리지 않게하십시오. 더 큰 표본은 배양 시간을 늘려야합니다.
5. 이차 항체 배양
   1. RT에서 각각 1 시간 동안 PBS 4x에서 검체를 씻어서 항체가 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
   2. 0.2 g의 BSA와 0.3 mL의 Triton X-100을 0.01 M PBS (pH 7.4) 100 mL에 녹여 2 차 항체 희석액을 준비한다.
   3. 희석 버퍼 (단계 3.5.2)에서 보조 항체 (peroxidase - 접합, 친화 - 정제 양 항 마우스 IgG - HRP) 1 : 600을 희석. 검체를 2 차 항체와 함께 4 ° C에서 3 일 동안 배양하고 검체를 nutator에 부드럽게 흔들어 놓습니다.
6. 천연색
   1. 짙은 냄새가 나는 곳에서 0.05 mol / L Tris-HCl 완충액 (pH 7.6) 100 mL에 3,3'- 디아 미노 벤지딘 테트라 히드로 클로라이드 (DAB) 0.002 g을 넣고 용액을 어둡게 유지하여 DAB 착색 용액을 조제한다.
   2. 각각 1 시간 동안 PBS에서 4x RT로 시료를 씻으십시오.
   3. 갓 준비된 DAB 착색 용액에 30 % H ₂ O ₂ 10 μL를 넣고 4 ° C / N 용액 또는 3 일 동안 incubate 한 후 nutator에서 부드럽게 흔들어 준다.
   4. pla로 반응 중지최적의 염색 강도에 도달하면 0.04 % 나트륨 아자 이드로 PBS로 표본을 넣는다.
      참고 :이 단계까지 나트륨 아자 이드의 사용을 피하십시오. 이는 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제를 억제하기 때문입니다.
7. 얼룩진 조직 이미징
   1. PBS가 담긴 페트리 유리 접시 (높이 5cm, 직경 10cm)에 조심스럽게 표본을 옮긴다. 실체 현미경에 장착 된 카메라를 사용하여 전체 장착 이미지를 캡처하십시오.
      참고 : 전체 마운트 스테인드 조직은 투명 유리 접시에 PBS에 완전히 담근 채로 이미지해야합니다.

결과

그림 1 - 4 는 S. murinus의 간외 담관에서 NFP 양성 신경 섬유에 대한 전형적인 결과를 보여줍니다. NFP에 대한 항체는 간외 담도 ( 그림 1 ), 담낭 ( 그림 2 ), 상부 담관 ( 그림 3 ) 및 십이지장 유두 부위 ( 그림 4 )의 전체 이미지에서 높은 특이도 및 최소 배경.

표본의 모든 조직에 대해, 모양과 크기에 관계없이, tegmental 신경은 동시에 염색 수 있습니다. 간외 담도의 신경 분포 외에도 식도와 위의 미주 신경의 진행 및 분포 밀도...

토론

이 작품은 neurofilament 단백질에 대한 항체를 사용하여 extrahepatic 담즙 관의 innervation의 시각화를위한 실험 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 쿠라 타니 (Kuratani)와 다나카 (Tanaka) ^{1 , 2 , 3} 에 의해 기술 된 프로토콜로부터 수정되었습니다.

이 실험에서는 전체 마운트 염색 접근법이 2 ~ 3 주 동안 계속되므로 각 실험에 대한 타임 라인을 계획하십시오. 동결 / 해동 과정을 제외하고 조직을 담는 용기는 항상 nutator에서 회전해야합니다. 특히 1 차 항체 및 2 차 항체와 함께 항온 처리하는 동안 시험편을 반응 용액에 균일하게 노출시키기 위해 견본을 시험관에서 회전시키면서 냉장 보관실에 놓았다. 몇 가지 솔루션 - 1 % (w / v) 오르토과 요오드 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
orthoperiodic acid	Wako	162-00732
papain	Wako	164-00172
소 혈청 알부민 (BSA)	Wako	010-15131
아지드	Nacalai 나트륨 Tesque	312-33
신경 필라멘트 단백질 (NFP) 항체	Dako	M0762, lot 089, 클론 : 2F11
peroxidase-conjugated 친화성 정제 양 안티 마우스 IgG-HRP	MBL	코드 330
3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)	Wako	349-00903
이미다졸	시그마	I-0125