Suncus murinus 의 외 간성 담도계에서 neurofilament 단백질 발현을 시각화하기위한 whole-mount immunohistochemical 접근법 . 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜은 S. murinus 또는 다른 종의 모든 내장 기관의 innervation을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
담관의 보행을 연구하기위한 Whole-mount Immunohistochemical method의 사용
이 논문에서
요약
초록
이 작품은 전체 마운트 immunohistochemistry 얼룩 방법을 자세하게 설명합니다, 신경 섬유 단백질 항체를 사용하여 Suncus murinus ( S. murinus 의 담즙 기관의 innervation을 표시하기 위해 ). 먼저 표본을 S. murinus 에서 해부시키고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정시켰다. 둘째, 효소 처리 및 잠재적 인 내재적 퍼 옥시 다제 불 활성화가 수행되었다. 그 다음, 시험편을 1 차 항체, 항 - 신경 필라멘트 단백질 항체에 3-6 일 동안 노출시켰다. 이어서, 양 고추 냉이 과산화 효소가 접합 된 2 차 항체와 함께 항온 배양 하였다. 표적을 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB) 기질과 반응시켜 발색 반응을 나타내었다. 이 방법은 모든 내장 기관의 신경 분포 분석에 적용 할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 다른 뉴런 항체를 테스트하기 위해 적응할 수 있지만, 항체의 최적화es가 먼저 수행되어야합니다. 이 방법은 원래 Kuratani와 Tanaka 1 , 2 , 3 에 의해 도입되었습니다.
서론
집 사향 갈기 , Suncus murinus , 주문 Insectivora과 가족 Soricidae에 속한다. 이 작은 포유 동물은 동남 아시아 전역에 분포하며 인간의 거주지 또는 소 펜 4 근처에 위치한 잔디와 풀밭에 서식합니다. 이 종은 마우스, 쥐 및 토끼와 같은 다른 실험 동물보다 인간과 더 유사한 일반적인 형태학적인 특성을 나타낸다. 이전에, S. murinus neurofilament protein (NFP)에 대한 말초 신경 마커를 이용한 whole-mount immunostaining은 췌장 6 , 주요 십이지장 유두 7 , 유두 8 , 담낭 5 및 간외 담도 9 에서 말초 신경을 표지하기 위해 사용되었습니다.
NFP는 성숙한 신경 세포 뼈대의 일부인 거대 분자 복합체입니다. 신경 필라멘트 관련 단백질NFP와 접합체 사이의 상호 작용을 매개한다. 효소 기능과 링커 단백질의 구조는 NFP 10<....
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프로토콜
모든 실험 절차는 도쿄 도립 대학 동물 애호 관리위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험실 동물 의 관리와 사용을위한 안내서와 동물 보호에 관한 캐나다위원회 의 실험 동물 의 관리와 사용 안내서에 따라 동물을 수용하고 취급했습니다. 우리는 일본 동경 메트로폴리탄 대학교 (Functional Morphology Laboratory) 프런티어 보건 과학부에서 사육되고 유지 된 동물들을 사용했습니다.
1. 동물 배려 및 주거
- 폐쇄 형 번식 식민지에서 7 S. murinus (암컷 3 마리와 체중 70 ~ 90g의 4 마리)를 얻습니다.
- 종이 스트립이 들어있는 나무 둥지 상자가있는 플라스틱 케이지에서 이유 후 (출생 후 20 일) 개별적으로 S. murinus를 감금하십시오. 전통적으로 컨디셔닝 된 동물 룸 (23-27 ° C), 습도 조절 장치, 12시 12시 (h : 12시 12 분)의 암흑 사이클을 유지하십시오. 공급 commerc송어 알갱이와 물을 자유롭게 먹는다.
2. 조직 준비
- 4 % (w / v) 파라 포름 알데히....
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결과
그림 1 - 4 는 S. murinus의 간외 담관에서 NFP 양성 신경 섬유에 대한 전형적인 결과를 보여줍니다. NFP에 대한 항체는 간외 담도 ( 그림 1 ), 담낭 ( 그림 2 ), 상부 담관 ( 그림 3 ) 및 십이지장 유두 부위 ( 그림 4 )의 전체 이미지에서 높은 특이도 및 최소 배경.
표본의 모든 조직에 대해, 모양과 크기에 관계없이, tegmental 신경은 동시에 염색 수 있습니다. 간외 담도의 신경 분포 외에도 식도와 위의 미주 신경의 진행 및 분포 밀도.......
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토론
이 작품은 neurofilament 단백질에 대한 항체를 사용하여 extrahepatic 담즙 관의 innervation의 시각화를위한 실험 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 쿠라 타니 (Kuratani)와 다나카 (Tanaka) 1 , 2 , 3 에 의해 기술 된 프로토콜로부터 수정되었습니다.
이 실험에서는 전체 마운트 염색 접근법이 2 ~ 3 주 동안 계속되므로 각 실험에 대한 타임 라인을 계획하십시오. 동결 / 해동 과정을 제외하고 조직을 담는 용기는 항상 nutator에서 회전해야합니다. 특히 1 차 항체 및 2 차 항체와 함께 항온 처리하는 동안 시험편을 반응 용액에 균일하게 노출시키기 위해 견본을 시험관에서 회전시키면서 냉장 보관실에 놓았다. 몇 가지 솔루션 - 1 % (w / v) 오르토과 요오드 .......
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공개 사항
저자는 아무런 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 인정하지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| 아지드 | Nacalai 나트륨 Tesque | 312-33 | |
| 신경 필라멘트 단백질 (NFP) 항체 | Dako | M0762, lot 089, 클론 : 2F11 | |
| peroxidase-conjugated 친화성 정제 양 안티 마우스 IgG-HRP | MBL | 코드 330 | |
| 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) | Wako | 349-00903 | |
| 이미다졸 | 시그마 | I-0125 |
참고문헌
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S.
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재인쇄 및 허가
