막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.
막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.
뇌에서 멤브레인 트래 피킹 시스템은 연결 형태, 시냅스 가소성, 생존 및 신경 교종과 같은 신경 기능을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 지금까지 수많은 연구에서 이러한 시스템의 결함이 다양한 신경 질환을 일으킨다 고보고했습니다. 따라서, 소포 역학의 기저를 이해하는 메커니즘은 여러 가지 신경 질환의 치료에 도움이 될 수있는 영향력있는 단서를 제공 할 수 있습니다. 여기에서는 ImageJ 플랫폼 용 소프트웨어 플러그인을 사용하여 운동 거리 및 이동 속도와 같은 소포 운동을 정량화하는 방법을 설명합니다. 정량화를위한 이미지를 얻기 위해, 우리는 EGFP - 태그 소낭 마커 단백질과 연결 endosome - 리소좀 구조를 표시하고 시간 경과 현미경을 사용하여 소포의 움직임을 관찰했다. 이 방법은 매우 유용하고 축삭 및 수상 돌기와 같은 신경 돌기뿐만 아니라 뉴런 및 신경아 교세포의 소마에서 소포 운동성 측정을 단순화합니다. 추가이 방법은 섬유 아세포 및 내피 세포와 같은 다른 세포주에도 적용될 수있다. 이 접근법은 막 밀매에 대한 우리의 이해를 진전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
Endosome-lysosome trafficking의 정확한 조절은 신경 기능 조절에 필수 불가결합니다. 주목할 만하게,이 vesicles의 동적 인 운동은 신경질 형태학, 발달 및 생존의 규칙의 기초가되는 중요한 요인이다. 이 시스템의 결함은 심한 신경 장애를 유발합니다 1 , 2 . 소포 인신 매매를 신경 질환과 연결시키는 분자 메커니즘은 복잡하다고 여겨지며, 몇몇 그룹에서는이 관련성을 조사하려고 시도해 왔습니다. 예를 들어, 늦은 엔도 솜 운동성을 교란 시키면 리소좀 결함으로 인해 유전되는 신경 퇴행성 질환 인 Niemann-Pick C 질병 3 과 유의 한 연관성이있는 것으로보고되었습니다. 다른 예는 리소좀 운동성을 손상시키는 리소좀 성 Ca 2+ 채널 trpml 1의 돌연변이로 리소좀 성 저장 질환 4 , 5 , 6 . 우리 그룹은 PtdIns (3,5) P 2 turnover의 조절 장애가 뉴런의 엔도 좀과 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
모든 동물 실험은 쓰쿠바 대학 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 해부
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
이 분석은 체외 배양 에서 소포 역학을 측정하기 위해 고안되었습니다. 이 분석은의 연결 형태 및 생존과 관련된 소포 운동성을 결정하는 데 활용되었습니다. 그림 1A 및 B 는 뉴런의 리소좀 운동성을 보여주는 대표적인 데이터를 표시합니다. 피질 뉴런은 리소좀 마커, LAMP-EGFP로 형질 감염되었고, 표준 형광 현미경을 사용하여 관찰되었다. 이전에는 특정 엔도 좀 - 리소좀 소포가 쉬고있는 뉴런 에서조차도 매우 이동성이 있다고보고되었습니다. 사실, 이러한 결과는 같은 수상 돌기 ( 그림 1A 와 B )에 휴식과 움직이는 소포 둘 다 보여줍니다. 일반적으로 쉬고있는 소포는 갈색의 움직임과 같은 진동 운동을 뉴런 수상 돌기에서 나타낸다. 대조적으로, 움직이는 소포는 불규칙한 운.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
이 프로토콜은 소포 운동성을 정량화하는 절차를 소개합니다. 일차 뉴런에서 엔도 좀과 리소좀은 젊은 뉴런에서 높은 운동성을 나타내는 경향이 있습니다 (4-6 DIV). 뉴런은 신경 프로세스를 길게하기 위해 리딩 에지에 몇 가지 구성 요소를 제공해야한다는 것을 감안할 때 멤브레인 트래 피킹은이 단계에서 동적으로 발생해야합니다. 따라서, 신경 dendrites의 동적 운동을 관찰하기 위해 젊은 뉴런을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 큰 베 시클은 젊은 뉴런에서도 높은 운동성을 나타내는 경향이 없습니다. 소포 크기의 조절은 융합 - 핵분열 단계의 빈도와 관련이있다. 역동적으로 움직이지 않는 특정 소포는 다른 소포를 쉽게 받아들이고 운동을 종결시킬 수 있습니다. 따라서 소포를 선택하는 것은이 분석을위한 중요한 과정입니다.
객체를 추적하기 위해 몇 가지 무료 플러그인 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다 21 . 예를 들어, 트랙메이트 패키.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
저자는 공개 할 것이 없습니다.
이번 분석을 돕기 위해 Ricardo Dolmetsch 박사 (Stanford University of Medicine, 현재 : Novartis Institute for Biomedical Research)와 Matthew Wood 박사, Aihara Takum, Dongsook Kim에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal 배지 | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | 무혈청 배지 |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-글루타민 | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 보충제 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% 트립신 | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P4957 | |
| 나일론 셀 스트레이너 | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection 시약 |
| Polyethyleneimine "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Transfection 시약. Lipofectamine2000의 대안으로 멸균수에 용해된 0.1mg/mL 폴리에틸렌이민을 사용할 수 있습니다. 그러나 효율성이 낮고 독성이 높습니다. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| 배양 시스템 INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism 버전 6.0 | GraphPad 소프트웨어 | NA | |
| Excel 버전 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ 버전 1.47 | NA | NA |
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청
허가 요청