안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다.
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방법 논문
마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
망막 및 맥락막 혈류 역학은 녹내장, 당뇨병 성 망막증, 연령 관련 황반변 성 (AMD) 및 기타 안구 염증성 질환과 같은 다양한 안구 질환의 병태 생리 및 후유증에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 눈의 치료 반응을 모니터하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표지 세포의 살아있는 세포 이미징과 결합 혈액 세포의 적절한 라벨링, 망막과 맥락 순환에 흐름 역학의 조사 수 있습니다. 여기에서 마우스 적혈구 및 백혈구의 1.5 % indocyanine green (ICG) 및 1 % sodium fluorescein 표지의 표준화 된 프로토콜을 각각 설명합니다. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO)는 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 표지 된 세포를 시각화하기 위해 적용되었습니다. 두 방법 모두 생쥐 망막 순환에서 특이 적으로 형광 표지 된 세포를 보였다. 이러한 표지 방법은 다양한 안구 질환에서 더 넓은 적용 범위를 가질 수 있습니다모델.
서론
망막 및 맥락막 순환에서 혈구의 유동 역학을 연구하면 잠재적으로 시력이 위협되는 안구 질환 및 기타 안구 염증성 질환의 병인을 이해하는 것이 필수적입니다. 그러나 혈장 단백질에 형광 염료를 결합시키는 기존의 혈관 조영술은 적혈구 또는 백혈구의 동력학에 관한 정보를 제공하지 않습니다 1 . 적혈구 망막 혈류 역학은 망막에서의 대사 적으로 효율적인 순환과 다양한 염증 조건에서 세포 이동, 인식, 부착 및 파괴를 이해하기위한 백혈구 유동 역학을 연구하는데 중요합니다 2 . 다양한 세포 유형 3 의 동정과 특성 규명에 사용되는 몇 가지 형광 분자가 있습니다. 혈액 세포의 혈류 역학은 적절한 형광으로 염색하여 측정 할 수 있습니다염료 및 적절한 이미징 기술 적용 4 .
연령 관련 황반변 성 (AMD)과 당뇨 망막 병증 (DR)과 같은 안구 질환에서 염증 반응의 존재는 병변에 림프구가 축적되는 것을 의미합니다 5 , 6 . 조직에서 면역 세포를 추적하면 질병 발병 기전과 관련된....
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프로토콜
이 연구에 사용 된 동물 프로토콜은 싱가포르 싱가포르 SingHealth의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻었으며 안과 / 안과 분야에서의 동물 사용을위한 안과 / 안과 연구 협회 (ARVO)의 성명서 연구.
1. 형광 염료를 이용한 적혈구 및 백혈구의 표지
- 시약 준비
- 멸균 된 증류수 1800 μL에 ICG 3 mg을 녹여 ICG (1.5 mg / mL)를 준비하십시오. 10x 인산 완충 식염수 (PBS) 200 μL를 추가합니다.
- 멸균 증류수 6 ML에 1X PBS 4 ML을 추가하여 40 % 1X PBS를 준비합니다. 1x PBS 10 ML에 BSA 100 MG를 추가하여 PBS에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비합니다. BSA가 녹을 때까지 잘 섞는다.
- 밀도 구배 원심 분리를 이용한 적혈구 및 백혈구 분리
- 생쥐 마취 (야생 타이(ARVO 지침에 따라 스케쥴 1에 따라) 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)의 조합을 사용하여 투여 하였다 (C57BL / 6). 페달 철수 반사 ( 즉 , 발가락 핀치)로 마취를 ....
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결과
1.5 % ICG로 표지 된 적혈구를 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 시각화 하였다. 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 및 5 % 헤마토크릿 모두 망막 순환에서 구별 할 수 있었다. 그러나 개별 표식 된 세포는 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 헤마토크리트로 더 명확하게 시각화되었습니다 ( 그림 1 ). 5 % 헤마토크리트에서 망막 혈관의 많은 수의 표식 세포로 인해 개별 세포를 표시 할 수 없었습니다. 두 조건 모두에서 약간의 erythrostasis가 peripapillary region에서 관찰되었지만, 표지 된 적혈구의 5 % 적혈구 용적률에서 더 두드러졌다 ( 그림 2 ).
백혈구는 상기 프로토콜에 따라 1.......
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토론
망막 및 맥락막 순환에서 혈류 역학을 연구하는 것은 많은 안구 질환의 병리 생리학을 이해하는 데 중요합니다. 망막 순환에서의 혈류 역학은 Fourier-domain optical coherence tomography (FD-OCT), laser speckle flowgraphy (LSFG) 및 망막 산소 측정법에 의해 연구 될 수있다. 이 방법은 망막 순환에서 총 혈류를 연구하기 위해 다른 접근법을 사용하지만 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 개별 세포 유형의 유동 역학을 연구 할 수 없다는 한계가 있습니다. 망막과 맥락막 조직에 영양분과 산소 공급뿐만 아니라 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다. 재정적 또는 이해 상충은 없습니다.
감사의 글
이 연구 프로젝트는 싱가포르 국립 의료 연구 협의회 (National Medical Research Council, NMRC)의 New Investigator 기금으로 지원되었습니다. 연구팀은 2012 년 11 월부터 2012 년 10 월까지 National Medical Research Council (NMRC) 해외 연구 연수 펠로우 십을 통해 University University of London (UCL)의 안과 연구소 (IoO)에서 Agrawal 박사에게 제공 한 연구 훈련에 대해 감사를 표합니다. David Shima. Agrawal 박사는 시마 박사의 실험실에서 세포에 라벨을 붙이고 영상을 찍기위한 개념과 기술을 습득했습니다. 따라서 팀은 David Shima 교수, Kenith Meissner 박사, Peter Lundh 박사 및 Daiju Iwata 교수의 훈련 펠로우쉽 중 감독과지도를 인정하고자합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cardiogreen 폴리메틴 염료(Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x 인산염 완충 식염수(PBS) 초순수 등급 | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| K2E(K2EDTA) - EDTA 농도 - 혈액 1.8 mg/mL의 마이크로테이너 튜브 | BD, 미국 | 참조 365974 | |
| Histopaque 1077 용액 | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex 믹서 | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| 쉐이커 인큐베이터 | Lab Tech | ||
| Ceva 케타민 주사 (케타민 염산염 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine 염산염 20 mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. 미국 | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (페닐에프린 염산염 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. 미국 | NDC 0998-0342-05 | |
| 바늘이 있는 테루모 주사기 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, 필리핀 | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| 알코올 면봉 | Assure 의료용 일회용품 | 7M-004-L-01 | |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 혈관 조영 시스템(Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, 하이델베르크, 독일 | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, 하이델베르크, 독일 | ||
| 형광 현미경 | ZEISS | 모델: axio imager z1 |
참고문헌
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....
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