여기에서는 뉴클레오티드 절제 복구 시스템을 예로 들어 단일 분자 AFM 이미징을 통한 다양한 DNA 병변 인식 접근 방식에 대한 연구를 시연합니다. DNA 및 단백질 시료 준비 절차와 AFM 실험을 위한 실험 및 분석 세부 사항에 대해 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
핵 포스 현미경 검사에 의한 DNA 절편 검사에서의 DNA 병변 인식 연구
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
AFM 이미징은 단백질-DNA 상호 작용 연구를 위한 강력한 기술입니다. 이 단일 분자 분석법은 이질적인 샘플에서 서로 다른 분자와 분자 어셈블리를 동시에 분리할 수 있습니다. DNA 상호 작용 단백질 시스템의 특정 맥락에서 DNA 단편을 포함하는 표적 부위의 다양한 단백질 복합체 형태 및 해당 결합 위치를 구별할 수 있습니다. 여기에서는 원핵 및 진핵 뉴클레오티드 절제 DNA 복구(NER) 시스템에서 DNA 병변 인식 연구에 대한 AFM의 응용 프로그램이 제시됩니다. DNA 및 단백질 시료 준비 절차가 설명되고 실험 및 실험의 분석 세부 사항이 제공됩니다. 이 데이터는 NER 단백질에 의해 표적 부위 검증을 달성할 수 있는 전략에 대한 중요한 결론을 내릴 수 있도록 합니다. 흥미롭게도, 그들은 병변의 유형에 따라 진핵 생물 NER 시스템에 대한 병변 인식 및 식별의 다른 접근 방식을 나타냅니다. 또한, 원핵 생물 및 진핵 생물 NER에 관여하는 두 개의 서로 다른 헬리 케이스의 뚜렷한 구조적 특성은이 두 시스템에 대해 관찰 된 서로 다른 전략을 설명하고 설명합니다. 중요한 것은 이러한 실험 및 분석 접근 방식이 DNA 복구 연구뿐만 아니라 복제 또는 전사 과정에 관여하는 것과 같은 다른 DNA 상호 작용 단백질 시스템과도 매우 유사하게 적용될 수 있다는 것입니다.
서론
원자 힘 현미경 (AFM)은 단백질 -DNA 상호 작용 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 의 분석을위한 강력한 기술입니다. 단일 분자 수준의 분해능으로 이종 샘플을 직접 시각화하기 위해서는 적은 양의 시료가 필요합니다. 이질성은 단백질의 상이한 형태 또는 올리고머 상태에 기인 할 수있다. 특히, 단백질 -DNA 샘플과 관련하여, 단백질 복합체는 일반적으로 DNA 결합 또는 DNA 내의 특정 표적 부위에 결합함으로써 유도 된 상이한 화학 양론 및 / 또는 형태를 나타낼 수있다. 이종 샘플은 또한 2 종 (또는 그 이상)의 상이한 종류의 단백질 및 상이한 단백질 복합체형태 ( 예를 들어 , 하나의 유형의 단백질 대 헤....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 샘플 준비
- DNA 기판 준비 11
- 플라스미드에서 ssDNA 갭 생성
- 적절한 니카아제 (여기 Nt.BstNBI)와 효소 열 불 활성화와 반응 튜브에서 플라스미드 (여기에 : 수정 된 pUC19, pUC19N)의 샘플을 완전히 소화기 제조 업체의 프로토콜에 따라 조건을 사용하여 소화 (그림 1 참조 설계도 표시). 충분한 수율을 얻기 위해 ~ 50 μL와 ~ 500 nM 플라스미드로 시작하십시오.
- 묽게 한 견본 (~ 20 nM) 15 에 아가로 오스 젤 전기 이동 법에 의하여 플라스마 새싹을 확인하십시오. DNA 시각화에 사용되는 DNA 결합 염료에 대한 보호용 장갑을 착용하십시오.
참고 : 다른 전기 영동 이동성은 nicked (relaxed)와 supercoiled 원형 플라스미드 DNA ( 그림 1 )를 구분할 수 있습니다. - 플라스미드로부터 절개 된 ssDNA 스트레치 (닉 사이트 사이)를열 블록 ( 도 1 )에서 올리고 뉴클레오타이드의 용융 온도 (여기서는 68 ℃, pUC19N의 경우) 근처에서 30 분 동....
- 플라스미드에서 ssDNA 갭 생성
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
단백질 복합체 부피를 기준으로 다른 복합 형을 구별
원핵 생물 NER 헬리 케이즈 UvrB의 헬리 케이즈 활성은 DNA 결합에 의해 자극된다 22 , 23 . UvrB는 두 개의 단일 ssDNA 가닥 중 하나에 올바르게로드하기 위해 DNA에 짝을 이루지 않은 영역 (DNA 버블)이 필요합니다. 생체 내 에서,이 DNA 구조는 NER 캐스케이드의 다른 단백질을 통한 DNA 상호 작용에 의해 제공됩니다. 시험 관내 실험에서, 거품은 표적 병변에 근접하여 dsDNA 단편에 인위적으로 도입 될 수있다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 또한 UvrB 9 에 의한 DNA 결합을 향상시킵니다. 그러나 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
특정 표적 부위를 포함하는 긴 DNA 단편에 대한 단백질의 결합 위치에 대한 AFM 통계 분석은 단백질이 이들 부위 2 , 3 , 4 , 5 , 6 을 인식하기 위해 사용하는 특정 전략에 대한 흥미로운 세부 사항을 나타낼 수있다. 결과적인 위치 분포를 해석하기 위해, DNA 내 표적의 위치를 정확히 알아야한다. 이것은 원형 플라스미드 DNA에 잘 정의 된 서열 위치의 특정 부위를 도입하고 제한 효소 기술을 사용하여이 특정 부위를 포함하는 DNA의 단편을 절단함으로써 달성된다. 단백질 결합 위치의 AFM 이미지 분석에서 정확한 길이를 가진 DNA 단편 (절단 된 단편의 전체 길이와 일치 함) 만 포함될 수 있습니다. 왜냐하면 이들만이 대.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
PUC19N, CPD- 함유 올리고 뉴클레오타이드 및 p44는 Samuel Wilson, Korbinian Heil 및 Thomas Carell, Gudrun Michels 및 Caroline Kisker에 의해 각각 제공되었다. 이 연구는 도이체 Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 및 TE-671 / 4에서 IT 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | 원자력 현미경 (AFM) |
| Precision 390 | DELL | 해당 없음 | 컴퓨터 |
| ThermoMixer 및 1.5 mL 블록 | Eppendorf | 5382000015 | 열 블록 |
| Rotilabo Block-Heater H 250 및 0.5 mL 튜브용 블록 | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | 단백질-DNA 배양용 열 블록 |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | 겔 캐스터 및 전원 공급 장치가 있는 전기영동 챔버 |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | 전기영동 전원 공급 장치 |
| Centifuge 5415 D 로터 포함 | Eppendorf | 2262120-3 | Table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | 자외선 조사 테이블 |
| NanoDrop ND-1000 | VWR 국제 / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N / A | UV 분광 광도계 |
| TKAX-CAD 0.2 μ m 캡슐 필터 | Unity Lab Services | N/A | 물 탈이온화 및 필터 장치 |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM 소프트웨어 |
| ImageJ (오픈 소스 Java 이미지 처리) | NIH 이미지 | N/A | 이미지 분석 소프트웨어 |
| 엑셀 (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | 데이터 분석 소프트웨어 |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | 통계 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어 |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Material | |||
| AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM 캔틸레버 |
| 등급 V-5 백운석 | SPI 공급 | 1805 | 운모 시트 |
| Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | 원심분리기 필터 |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose 젤 추출 키트 |
| Rotilabo 셀룰로오스 종이 유형 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM 증착 블로팅 페이 |
| 퍼 Anatop 25 (0.02 μ m) | Whatman GmbH | 6809-2102 | 주사기 필터 |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, DNA | 기질 준비를 위한 |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | DNA 준비를 위한 제한 효소 | |
| 니킹 제한 효소 Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | 니카제 |
| T4 DNA 리가제 | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | 완충 화학 물질 |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | 염 화학 물질 |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | 염 화학 물질 |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | 화학 물질 / 시약 | |
| 아가로스, 아세트산, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | 시약 |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | 뉴클레오티드 |
| 올리고뉴클레오티드 #1(표 1) | Biomers | 맞춤형 | 상보형 DNA 올리고뉴클레오티드 |
| 올리고뉴클레오티드 #2, #3 및 #6(표 1) | Integrated DNA Technologies (IDT) | 맞춤형 | 플루오레세인 함유 올리고뉴클레오티드, |
| 올리고뉴클레오티드, 표 1의 #4 및 #5 | 비공개(예: TriLink 또는 GlenResearch에서 사용 가능), | 올리고뉴클레오티드를 함유한 CPD, | |
| SafeSeal 반응 튜브, 0.5 mL 및 1.5 mL | Sarstedt | 72.704 및 72.706 | 배양 튜브 |
| GeneRuler, 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate, gel loading, dye, purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA 로딩 염료 |
| 미도리 그린 | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA 염색 |
참고문헌
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
