(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.
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이 논문에서
요약
초록
잘못 접힌 알파 - 시누 클레인의 프리온 같은 동작을 연구하기 위해 마우스 모델은 중추 신경계 (CNS)에서 신경 병리학을 일으킬 알파 - 시누 클레인의 prionoids의 빠르고 간단하게 전송을 허용하는 것이 필요하다. 마우스, 프리온 단백질 프로모터로부터 A53T 돌연변이와 인간의 α- 시누 클레인 과발현과 반딧불에서 루시퍼 : 여기에서는 bigenic의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-)으로의 α- 시누 클레인 브릴의 intraglossal 또는 복강 내 주사를 설명 글 리아 섬유 성 산성 단백질 프로모터 (GFAP), 신경 병리학 적 질환을 유발하기에 충분하다. 동물 그들이 도달 할 때까지 자연 질환 무료 남아 8 개월 이형의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-)의 나이에 시작 심한 신경 학적 증상이 동형 접합의 Tg (M83 + / +) 마우스와 비교 22개월의 나이. 흥미롭게 intraperitone 통해 알파 시누 클레인 브릴 주입229 ± 십칠일의 중간 배양 시간과 마우스 : 알 경로가 다섯의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-) 네 마비와 신경 학적 질병을 유발. 병에 걸린 동물은 뇌와 척수에서 인산화 된 알파 - 시누 클레인의 심각한 예금을 보였다. 알파 시누 클레인의 축적은 sarkosyl 불용성이었고 유비퀴틴과 P62와 colocalized 및 성상 신경교 증 및 microgliosis 결과 염증 반응을 수반 하였다. 놀랍게도, 혀에 알파 - 시누 클레인 원 섬유의 접종 285 일 후에 알파 - 시누 클레인 병리를 보여주는 다섯 주입 동물의 한으로 질병을 일으키는 덜 효과적이었다. 우리의 연구 결과는 (+/- M83을 : GFAP의 -luc를 +/-) 복강 내 경로를 통해 intraglossal 노선과 더욱 그렇다 통해 접종의 Tg에 synucleinopathies의 관련 특징과 신경 학적 질병을 유도하기 적합하다는 것을 보여 쥐를. 이 유도 프리온 같은 기전 연구를위한 새로운 모델을 제공합니다보다 상세히의 α- 시누 클레인의 prionoids d 개의.
서론
알파 - 시누 클레인은 특히 자기 씨앗 용량에, 프리온 단백질의 것과 유사 세포 사이의 연결 경로를 따라 미스 폴딩을 전파 특성을 가지고 성장 증거가있다. 알파 - 시누 클레인의이 속성은 '프리온 같은'또는 'prionoid'라고, 새로 건강한 뉴런 1, 2를 이식하는 병에 걸린 뉴런에서 잘못 접힌 알파 - 시누 클레인의 전달률을 제안 이식 실험에서 관찰에 의해 지원됩니다 3, 4. 또한 뇌 또는 주변부, 예 뒷다리 근육이나 장벽의 말단 부분의 α- 시누 클레인 병리의 확산의 결과로 잘못 폴딩의 α- 시누 클레인의 직접 분사 CNS의 5, 6, 7, 8, 9, 10. 우리는 더 상세히 주변 경로를 통해 알파 시누 클레인의 prionoids의 송신을 분석 미스 폴딩의 α- 시누 클레인은 단일 intraglossal 또는 복강 내 주사 한 후 이전 프리온 위해 아니라 잘못 폴딩 알파 위해 도시되었던 기능을 CNS를 neuroinvade 수 있는지 질문을 해결 시누 클레인. 혀에 프리온 주입 후 CNS의 neuroinvasion는 뇌간 (11)에있는 설하 신경의 핵 리드 혀 설하 신경을 따라 전달을 통해 달성된다. 하여 성상 세포의 활성화를 모니터 프리온 프로모터, 인간의 α- 시누 클레인의 A53T 변이체를 과발현하고 반딧불이 GFAP 프로모터의 제어 하에서 루시페라아제 마우스 : 마우스 모델로 우리의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83를 +/-) 선택한 생물 발광, 이전의 뇌에서와 같이쥐 12 프리온은 감염. 우리의 손에 bigenic의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 다른 사람 (13)에 의해 도시 된 바와 같이 마우스는 시대의 23개월까지 질병을 개발하지 않았다. 뇌에서 병리학, Tg 및 척수와 intraglossal 또는 복강 내 경로 유도 된 신경 질환을 통해 인간의 α- 시누 클레인 브릴의 단일 주입 : 가설을지지 생쥐 (+/- +/- M83 GFAP의 -luc) 알파 - 시누 클레인의 prionoids 프리온 (14)와 중요한 특성을 공유합니다.
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프로토콜
동물을 포함한 모든 절차는 노르 트라 인베스트 팔렌 주 환경청 (LANUV)의 동물 보호위원회의 승인을 수행 하였다. 동물을 수용하고, 12 시간 광 / 암주기 및 음식과 물에 자유롭게 접근하는 표준 조건에 따라 든다고 하였다.
1. 동물 모델
- Tg가 서로 엇 hemizygous (GFAP의 -luc +/-) hemizygous bigenic의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 생성 hemizygous의 Tg (M83 +/-) 마우스와 마우스 마우스 (15), (16).
- 개똥 벌레 루시퍼 라제 (12), (17)을위한 트랜스 코딩 인간의 α- 시누 클레인의 표준 PCR과 존재를 실시간 PCR과 자손의 유전자형.
- 여섯 - 투 - 8 주 시대에 동물을 접종한다.
2. 접종 제조
- 미주리 준비로되어있는 한 20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.2) 150 mM의 NaCl을 함유하는 TBS 버퍼 (TBS) 완충액에 A53T 돌연변이와 nomeric 재조합 인간의 α- 시누 클레인은 앞서 설명한 14.
- 800 rpm에서 5 일간 37 ℃에서 오비탈 진탕 단량체 재조합 인간의 α- 시누 클레인의 3 ㎍ / μL 교반하여 접종을 위해 섬유상의 α- 시누 클레인을 준비한다.
- intraglossal 접종에 대한 복강 내 또는 2 ㎍ / μL 1 개 ㎍ / μL의 최종 농도에 도달하기 위해 인산 완충 용액 (PBS)에 브릴 어셈블리 희석.
- 얼음 (각 펄스와 50 %로 설정된 진폭의 1 초 휴지 기간의 0.5 40 펄스)을 1 분 동안 초음파 처리와로드 알파 시누 클레인 브릴을 조각. 교차 접종에 의한 오염을 방지합니다. 다른 접종을 준비하는 깨끗한 초음파 프로브를 사용합니다.
3. Intraglossal 주사
- intrape과 동물을 마취100 ㎎ / ㎏의 케타민과 10 밀리그램 / kg의 자일 라진 ritoneal 주입. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
- 신중 연구자 향 머리와 등쪽 누운 자세에서 가열 플레이트 상에 접착 테이프 narcotized 동물을 고정한다.
- 초음파의 α- 시누 클레인 브릴 또는 PBS 5 μL와 27 G 일회용 피하 주사기를 채우기.
- 동물의 입이 열려 개최 톱니 모양의 팁을 하나의 뭉툭한 코 엄지 손가락 집게를 사용하여 집게의 작은 제 2 쌍은주의 깊게 주입을위한 혀의 바닥면에 액세스 할 수 있도록하기 위해 혀를 당겨.
- 설하 신경 부근의 혀의 오른쪽 또는 왼쪽 하단 측에 주사기 바늘을 주입한다. 천천히 5 초 후 접종을 주입. 천천히 접종 있도록 5 초 후 바늘을 철회조직을 침투하고 바늘을 철회하면서 손실되지 않습니다.
- 그 고정물에서 동물을 해제하고 완전한 복구 될 때까지 지속적인 모니터링에서 가열 플레이트에 둡니다.
4. 복강 내 주사
- 복강 내 주사를 위해, 2 L / min의 유량으로 2 %로 설정 증발기를 사용하여 이소 플루 란 / 산소 흡입 마취 챔버 내에 곧 동물을 마취시키다. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다.
- 초음파의 α- 시누 클레인 브릴 또는 PBS 50 μL와 27 G 일회용 피하 주사기를 채우기.
- 직접 마우스의 복강에 주사하고, 조사원으로부터 떨어져 대면하는 헤드와 등쪽 위치 동물 잡고 하향으로 대략 45 °로 복부 벽 뒤에있는 소장 또는 맹장 관통 피한다. 그들이 회복 될 때까지 동물을 모니터링마취에서.
5. 생물 발광 영상
- 이미지의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 마우스 생물 발광 이미징 시스템을 사용하는 모든 2-4주.
- 곧 묘화 2 L / min의 유량으로 2 %로 기화기로 이소 플루 란 / 산소 챔버에서 쥐를 마취 전에. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다.
- 면도와 제모 크림 쥐의 머리를 털을 뽑다. 불특정 생물 발광을 차단하는 비 자극 마커와 블랙의 귀를 색상.
- 30 ㎎ / ㎖의 스톡 용액에 D-PBS 칼륨 염 루시페린, 루시 페라 제의 기판을 희석. -20 ° C에서 1 mL를 씩이 보관하십시오. 노광에서 용해 D-루시페린 보호.
- 주입하기 전에 동물의 무게를. 150 mg / kg (체중)의 주입을위한 D-루시페린의 정확한 양을 계산한다. 복강 주사 D-luciferin 및 마취 챔버에 동물을 반환한다.
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 이미징 시스템이 도달하면 작동 온도 제어판에서 '초기화'버튼을 클릭하여 시스템을 초기화합니다.
- 버튼 '발광'과 '사진'을 선택합니다. 60 초, '보통'의 F / 정지 '1'로 비닝 (binning)과 '끄기'로 EM 이득에 노출 시간을 설정합니다.
- 여기 필터 '열기'을 '차단'하고, 발광 필터로 설정되어 있는지 확인하고, 1.50 cm 피사체 높이를 설정.
- 텐 분 D-루시페린과 주사 후, 촬상 챔버 내의 가열 플레이트 상에 동물을 배치하고 그 총구 올바르게 마취 출구에 배치되도록. 흡입 챔버로부터 이소 플루 란 / 산소 유량을 닫고 0.25 L / min의 유량으로 2 %의 증착과 촬상 챔버에 대한 흐름을 연다. 이미징 챔버 홍보의 문을 닫습니다operly.
- 60 초 걸리는 생물 발광을 측정하기 위해 '획득'버튼을 클릭합니다. 이소 플루 란의 흐름을 중지하고 완전히 자신의 새장에 다시 반환 후 회복 될 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 생물 발광을 정량화하기 위해 이미징 소프트웨어를 사용합니다. '도구 팔레트'내에서의 투자 수익 (ROI) 도구 '를 선택합니다. 의 투자 수익 (ROI) 도구 '에서'유형 '에서'측정 투자 수익 (ROI) '를 선택합니다.
- 의 투자 수익 (ROI) 도구 '내에서 "원"도구를 클릭하고 풀다운 메뉴에서 그릴 로아의 수를 선택 - 이상적으로'3 '세 마우스에 대해.
- 이미지에서 각 ROI와 아래는 '속성'1.25 cm에 폭과 높이를 조정 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 정량화 뇌 영역에 걸쳐 각각의 투자 수익 (ROI)을 배치합니다.
- 화상의 상부 좌측에, "빛 (광자) '단위로 패널을 설정.
- '도구 팔레트'내 선택 '이미지 보정'최소를 조정하고0.20e6에서 1.00e6에 인스턴스의 '색 눈금'의 최대.
- '파일'에서 '저장'을 사용하여 데이터를 저장합니다.
6. 생화학 분석
- 설립 프로토콜 (18), (19)에 따라 뇌와 척수를 분리합니다.
- 조직 균질 기에서 6,000 rpm으로 30 초 두 사이클로 (PBS에 1 배 희석), 프로테아제 및 포스파타제 억제제의 존재하에 별도로 PBS에서 전체 뇌와 척수 전체 샘플 균질화. 뇌와 척수 시료를 20 % (중량 / 부피)의 최종 농도로 균질화되었는지 확인.
- 10 s의 일정한 펄스와 50 %로 설정된 진폭 얼음들을 유지하면서 두 샘플을 초음파 처리.
- PBS 중 1.5 M NaCl로 1 : 1 그들 희석 PBS 750 mM의 NaCl을 10 %의 균질을 조정한다.
- 세포 파편을 분리하기 위해 5 분으로 1,000 XG에서 균질 원심 분리4 ° C. 다음 단계의 상층 액을 유지하고 알약을 폐기합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 bicinchoninic 산 (BCA) 분석을 사용하여 균질의 단백질 농도를 측정한다. 얼음 위에서 15 분 동안 10 % (중량 / 부피)의 최종 농도에서 N-laurylsarcosyl 척수 균질의 뇌 균질 물에서 총 단백질 1.0 mg을 0.8 mg의 인큐베이션.
- 증류수 10 % (중량 / 부피)의 3 mL의 슈 크로즈 쿠션 상에 균질 오버레이, 4 ° C에서 1 시간 동안 465,000 XG 그들을 초 원심 분리기.
- 4 % 도데 실 황산나트륨 (SDS), 2 % β 메르 캅토 에탄올, 192 mM의 글리신, 25 개 mM 트리스, 5 % (중량 / 부피) 수 크로스를 함유하는 완충액에 재현 탁 펠릿.
- 5 분 동안 100 ℃에서 샘플을 비등하고 morpholineethanesulfonic 술폰산 (MES) 버퍼 시스템에 대한 전기 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩들을.
- 주사 전자 현미경 (SEM)으로 분리 된 폴리 비닐 리덴 디 플루오로 단백질 (PVDF) 멤브레인 전송시스템을 모래 바닥 idry.
- 가교 35 RPM으로 로터에 실온에서 30 분 동안 PBS에서 (부피 / 부피) 포르말린 용액 멤브레인 단백질 0.4 %의 막을 인큐베이션.
- 0.05 % (부피 / 부피의)을 포함하는 TBS 버퍼 트윈 20, 실온에서 1 시간 동안 5 % (중량 / 부피) 우유에서 막을 차단.
- 4 ℃에서 밤새 블로킹 완충액에 일차 항체로 블롯을 인큐베이션.
- TBS 버퍼 막 세 번 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 TBS에서 페 록시 또는 형광 접합 된 이차 항체로 부화.
- 확립 된 프로토콜 20에 따라 화학 발광 또는 형광으로 결합 이차 항체를 시각화.
7. 면역 형광 분석
- 휴지 프로세싱 스테이션에서 해부 뇌 및 척수 탈수 및 파라핀 스테이션을 사용하여 파라핀에 그들을 삽입.
- 파라핀 포매 TIS 컷8 개 μm의 두께 코로나 섹션 마이크로톰으로 고소와 유리 슬라이드에 섹션을 탑재합니다.
- 10 분에서 5 개의 분리 크 실롤 조에이를 배양하여 조직 절편을 Deparaffinize 및 등급 에탄올 욕 (100 %, 90 %, 70 %, 50 %)의 시리즈를 통해 최종적으로 H 2 O로 재수
- 실온에서 5 분간 0.01 M 시트 레이트 완충액 (pH 6.0)의 섹션을 인큐베이션 추가적으로 마이크로파 오븐에서 10 분 동안 삶아.
- 섹션을 실온까지 냉각하고, 내인성 퍼 옥시 다제를 억제하는 30 분 동안 3 % 과산화수소로 부화하자.
- 20 % (부피 / 권) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 % 트리톤 X-100을 실온에서 1 시간 동안 PBS에 함께 배양하여 조직 절편을 차단.
- 1 % (부피 / 부피) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) BSA, 0.25 % 트리톤 X-PBS에서 밤새 100에서 4 ℃로 희석 차 항체와 함께 인큐베이션 섹션. <리> 0.25 % (부피 / 부피의) 트리톤 X-100의 PBS 일단 PBS로 두 번 씻어 섹션.
- 해당 형광 접합 된 이차 항체를 실온에서 1 시간 동안 1 % 희석 핵 염색 DAPI (용적 / 권) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) BSA 및 PBS와 섹션 얼룩.
- 0.25 % (부피 / 부피의) 트리톤 X-100의 PBS 일단 PBS로 두 번 세척 한 후, 내장 미디어 슬라이드를 커버 슬립 및 공 초점 레이저 주사 현미경에 의한 염색을 시각화.
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결과
마우스 (표 1 및도 1)은 혀 또는 bigenic의 Tg의 CNS (GFAP의 -luc +/- +/- M83)의 복막 유도 병리학 통해 알파 시누 클레인의 prionoids 주변의 주입. 알파 - 시누 클레인 섬유소와 하나의 복강 내 주사 한 후, 다섯 마우스의 네 229 ± 십칠일의 중간 배양 시간과 신경 학적 질환을 개발했다. 놀랍게도, 단지 1 ~ 5의 마우스 285 일 후 알파 - 시누 클레인 원 섬유와 intraglossal 주사 후 CNS 질환을 개발했다. PBS로 접종 실험의 420 일 이내에 질병이 발생하지 않았다.
웨스턴 블로 팅 및 알파 - 시누 클레인의 Ser129에 대한 인산화 특정 EP1536Y 항체 프로브에 의한 생화학...
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토론
Tg는 (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-)의 복막 내로의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 마우스 synucleinopathies의 중요한 특성 요점을 되풀이하는 신경 염증을 동반 신경 질환을 유발하는 용이 한 방법을 나타낸다. 마찬가지로, 혀 주입 트랜스 제닉 마우스에서의 α- 시누 클레인의 prionoids 의해 neuroinvasion 대한 다른 경로를 나타내고 있지만, 덜 효율적이다. 우리는 주사 후 420일에서 실험을 종료하기로 결정했습니다 우리는 더 많거나, 피 브릴 주입 마우스의 모든 이후의 시점에서 질병을 개발 할 수있는 가능성을 배제 할 수 없다. 또한, (+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg의 사용 마우스 astrogliosis의 비 침습성 시각화를 가능하게하고, 전체 수명 동안의 α- 시누 클레인의 neuroinvasion에 의한 염증 반응을 모니터링하기위한 간단한 방...
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 올가 샤르마, 테레사 헌트 및 기술 지원에 대한 DZNE 현미경과 동물 시설의 직원을 감사드립니다.
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재료
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| anti-alpha-synuclein, phospho S129 항체 [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 항체 [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP 항체 | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 항체 | Wako | 019-19741 | |
| 항-세퀘스토솜-1 (p62) 항체 | Proteintech | 18420-1-AP | |
| 항-유비퀴틴 항체 [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | 인비트로겐 | 14190169 | |
| 케타민 | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G 주사기 | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
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