높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

요약

여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다.

초록

배아 줄기 세포 (ESC)는자가 증식하거나 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있습니다. 이는 다 분화능 (pluripotency)으로 알려진 현상입니다. 독특한 "다발성"상태가 "순진"과 "뇌하수체"다 분화능으로 묘사되었습니다. 순순한 뇌쇄 전환을 제어하는 ​​메커니즘은 제대로 이해되지 않았습니다. 특히, 우리는 키나아제 기능을 탐색하기위한 고품질의 도구 화합물의 이용 가능성이 증가 함에도 불구하고 순진하고 뇌척수가있는 다 능성 상태를 명시하는 단백질 키나아제에 대해서는 잘 알려지지 않고있다. 여기, 우리는 마우스 ESCs에 naive primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 확장 가능한 플랫폼을 설명합니다. 이 접근법은 단순 세포 배양 조건 및 표준 시약, 재료 및 장비를 사용하여 다 능성에 대한 지금까지 인식되지 않은 영향으로 키나아제 저해제를 밝혀 내고 유효성을 확인합니다. 우리는이 기술에 대한 잠재적 인 응용을 토론합니다. 여기에는 다른 작은 분자의 스크리닝점점 정교한 키나아제 억제제 및 후성 유전체 툴 화합물의 출현 라이브러리와 같은 컬렉션.

서론

배아 줄기 세포 (ESC)는 다 기능성 ^{1 (} pluripotency ^1)으로 알려진 성체의 모든 세포 유형으로자가 갱신하거나 분화 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 최근의 증거는 "순진"과 "감작"다 분화능 (pluripotency) ² 라고 불리는 발달 적으로 구별되는 다 능성 (pluripotent) 상태가 있음을 나타낸다. Naive ESC는 이식 전 배아 ³ 에서 발견 된 것과 유사한 발달 상태를 나타낸다. 반대로, 뇌관을 앓고있는 다 능성 ESC는 다 분화능을 없애고 전문화 된 배아 계통으로 분화한다.

나이브 및 뇌하수체 다 분원성 상태는 별개의 유전자 조절 네트워크로 표시됩니다. naive pluripotency는 Nanog, Krueppel-like transcription factors (Klfs), Rex1 ² 및 Esrrb와 같은 주요 다 능성 전사 인자의 발현을 특징으로한다 6. 마우스 ESCs (mESCs)에서 primed pluripotency는 naive 마커의 발현 감소와 de novo DNA methyltransferase Dnmt3b를 포함한 특정 유전자 발현 시그니처를 특징으로한다. 생체 내 에서 뇌하수체 전립선 상피 줄기 세포 (epiSCs) ^{4 , 5} 는 Epiblast 마커 Fgf5와 Brachyury ⁸ 과 같은 계통 뇌관 류의 마커를 추가로 발현합니다.

mESC는 in vitro에서 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는 메커니즘을 탐색 할 수있는 다루기 쉬운 모델을 제공합니다. 백혈병 억제 인자 (LIF)와 태아 소 혈청 (FBS)에서 배양 될 때, mESCs는 naive 및 primed pluripotent states 9,10 사이에서 동적 전이를 겪는다. 순진한 유전자 조절 네트워크를 촉진시키는 LIF-Jak-Stat3 신호 전달 기능 ¹¹

여기에서 우리는 naive primed pluripotent transition의 키나아제 조절제를 목표로하는 작은 분자 스크리닝을 수행 할 수있는 정량 및 확장 가능한 플랫폼을 설명합니다. 우리는 단순한 mESC 배양 조건과 표준 시약, 재료 및 장비를 사용하여 키위 나제 억제제를 밝히고 유효성을 검증하며 지금까지는 미숙 한 다 분화능을 안정화시키는 능력을 인정받지 못했습니다. 또한, 우리는 epigenetic 레귤레이터를 목표로 신흥 억제제 도서관 등 다른 작은 분자 컬렉션의 심사를 포함하여,이 기술에 대한 잠재적 인 확장 응용 프로그램을 논의합니다.

프로토콜

1. 작은 분자 키니 아제 억제 물 도서관의 분류

1. 228 개의 강력하고 선택적 인 키나아제 억제제 (http://lincs.hms.harvard.edu)의 표본 모음 인 하버드 의과 대학의 Integrated Network-Based Cellular Signatures (LINCS) 라이브러리와 같은 대중적으로 접근 가능한 키나제 억제제 수집 물의 억제제 라이브러리를 대조하십시오. , 및 단백질 키나아제 억제 물 세트 (PKIS), 산업 연구원 (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS)에 의해 조립 된 376 화합물 수집 ¹³ . 또는 상업적으로 이용 가능한 화합물로부터 주문품 키니 아제 억제제 수집 물을 조립하십시오.
   참고 : 우리 실험실에서는 51 개의 1 차 표적 키나아제를 대상으로하는 72 개의 강력하고 선택적인 툴 키나제 억제제를 수집했으며, 모두 상업적 출처에서 입수 할 수 있습니다.
2. 여러 농도에서 최적의 높은 처리량 처리를 위해 96- 웰 플레이트에 키나제 억제제를 조립하십시오 (1, 0.1 a0.01 mM). DMSO만을 함유하는 각 플레이트 대조구 및 대조군 인 PD173074 (FGFRi) 및 Ruxolitinib (JAKi)를 포함하며, 이들은 각각 순 진성 및 뇌하수체 성의 다 능성 상태를 촉진시키는 것으로 공지되어있다. 스프레드 시트 또는 유사한 소프트웨어에 주석을 답니다.

2. 스크린 준비를위한 mESC 문화 조건 및 절차

1. 10cm 플레이트에 0.1 % (w / v) 젤라틴 5 ML을 추가하여 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 요리를 준비하고 5 분 실온에서 부화. 흡 인물 젤라틴을 2 분 동안 건조시킨다.
2. 100 ng / mL GST-LIF, 10 % 태아 송아지 혈청 및 5 % 녹아웃 혈청을 함유하는 표준 mESC 배지 ( 재료 표 참조)에서 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 37 ° C 5 % CO ₂ 에서 모든 표준 mESC 라인을 배양하십시오. 바꿔 놓음. 1 일 5 ~ 1시 10 분 희석으로 매일 매 80 % confluency에서 매초 및 통로 mESC를 교체하십시오.
3. 통과 mESCs, 미디어를 대기음과 5 ML으로 씻어f 인산 완충 식염수 (PBS)를 함유한다.
4. mESC의 플레이트 당 1 ML 트립신 - EDTA (0.05 % 트립신, 0.02 % EDTA)를 추가하고 37에서 품어 ° C 10 분.
5. 5 분 1,200 rpm으로 mESC 미디어와 원심 분리기 4 ML의 Resuspend의 trypsinized 세포.
6. 철저히 하나의 세포 현탁액을 생성하는 위아래로 pipetting mESC 미디어 5 ML에 세포 펠렛을 resuspend.
7. 10 μL 세포 현탁액과 10 μL의 Trypan Blue (0.4 %)를 결합하여 세포를 계수하십시오. 세포 계수 챔버에 넣거나 hemocytometer와 가벼운 현미경을 사용하십시오.
8. 멀티 채널 피펫을 사용하여 0.1 % 젤라틴 코팅 96 웰 플레이트, 최종 볼륨 100 μL에 3 X 10 ³ mESC를 시드하십시오.
9. 다중 채널 피펫을 사용하여 1 : 100 희석액 (1 μL 억제제를 100 μL 배지에 첨가)에 키나제 억제제를 적용하십시오. 부드럽게 혼합 방지제와 세포 현탁액에 미디어를 피펫, 그럼 세포가 균등 분배 acro 보장하기 위해 1 시간 동안 조직 문화 후드에 정착 수 있습니다도금 표면. 매체를 바꾸지 않고 48 시간 동안 배양 세포.
   참고 : 1 / 0.1 / 0.01 mM의 스톡 플레이트는 각각 최종 저해제 농도가 10 / 1 / 0.1 μM이됩니다. off-target 효과를 최소화하면서 1 차 타겟 키나아제의 효과적인 억제를 보장하기 위해 1 μM의 최종 농도에서 스크린을 시작하는 것이 좋습니다.

3. 키나아제 억제제 스크리닝 분석

1. 멀티 채널 흡인기 및 피펫을 사용하여 200 μL PBS로 96 well mESC 플레이트를 세척하십시오.
2. 용해 버퍼 (20 MM 트리스 산도 7.4, 150 MM NaCl, 1 MM EDTA, 1 % NP - 40 (V / V), 0.5 % 나트륨 deoxycholate (W / V), 10 MM β - glycerophosphate , 10 mM 피로 인산 나트륨, 1 mM NaF, 2 mM Na3 VO4, 완전한 프로테아제 저해제 칵테일 정제).
3. V-bottomed 96- 웰 플레이트에서 30 분 동안 1,500 xg에서 원심 분리하여 추출물을 명확히하십시오.
4. 100㎕의 상청액을 nitrocel에 고정시킨다.96- 웰 진공 도트 블롯 매니 폴드 (blank dot manifot)를 사용하여 1 ㎛ 막에 코팅 하였다.
5. 멤브레인을 건조시키고 Ponceau S 40 mL로 얼룩을지게하여 일관된 이동을 보장합니다.
6. 멤브레인을 TBST로 씻고 TBST / 3 % (w / v) 우유로 차단하십시오.
7. TBST / 3 % (w / v) 분유에서 1 : 1,000 (v / v) 희석하여 Nanog 및 Dnmt3b 항체를 밤새 품는다.
8. TBST에서 3x10 분 동안 세포막을 씻고 1 : 10,000 (v / v)의 TBST / 3 % (w / v) 묽게 희석 한 2 차 항체 30 mL에서 배양하십시오.
9. 디지털 면역 블 롯팅 이미징 시스템을 사용하여 개발하십시오.
   참고 : 가능하면 Nanog 및 Dnmt3b를 검출하기 위해 정량 형광 면역 블로 팅을 사용하십시오. 그러나, 형광 immunoblotting에 의해 Dnmt3b에 대한 배경 신호가 너무 높습니다. 따라서, 800 nm 형광 항 - 토끼 (Nanog) 및 항 마우스 -HRP (Dnmt3b) 2 차 항체가 사용된다.

4. 선천성 만능 혈압 조절제로서 스크리닝 데이터 및 억제제의 검증

참고 : 이것은 선의의 만능 분열 조절제 만 확인하는 중요한 단계입니다. mESC 생존에 악영향을 미치는 키나아제 억제제가 추가 분석을 위해 선택되지 않도록 Nanog : Dnmt3b 비율과 전체 신호에 기반한 억제제를 분류하는 것이 필수적입니다.

1. Immobotting 분석 소프트웨어를 사용하여 Nanog 및 Dnmt3b 신호를 정량화하고 값을 스프레드 시트 또는 유사한 소프트웨어로 가져옵니다. DMSO 대조군과 비교하여 모든 시료에 대해 Nanog : Dnmt3b 비율을 계산하십시오. 또한, 키나아제 저해제가 mESC 생존력을 변경하여 Nanog : Dnmt3b 비율에 영향을 미치지 않도록 총 Nanog 및 Dnmt3b 신호를 결정하십시오.
2. Nanog : Dnmt3b 비율을 사용하여 순전 한 다 분화능 (Nanog : 대조군보다 높은 Dnmt3b 비율)과 primed pluripotency (Nanog : 대조군보다 낮은 Dnmt3b 비율)를 촉진하는 억제제를 확인하십시오. 제어 값으로부터 2 배 편차로 컷오프를 설정하고 전체 Nanog + Dnmt3b 신호를 생성하는 키나아제 억제제를 걸러냅니다(높은 Nanog : Dnmt3b 비율) 및 프라이밍 된 (낮은 Nanog : Dnmt3b 비율) 다 능성 상태를 안정화시키는 키나아제 저해제의 높은 신뢰도 목록을 생성하는 DMSO 대조군 값의 50 %.
3. 2 mL 배지에서 6 well 당 2 x 10 ⁵ 세포에 mESC를 접종하여 키나아제 억제제를 검증하고 배지 교환없이 48 시간 동안 1 μM에서 키나제 억제제를 첨가하십시오.
4. 용해 완충액에서 mESCs를 녹여 기존의 SDS-PAGE 면역 블로 팅으로 Nanog 및 Dnmt3b 발현을 분석합니다.
5. 또한 naive pluripotency marker 인 Klf2와 Klf4, Oct4에 대한 SDS-PAGE immunoblotting으로 히트를 검증하여 48 시간 동안 억제제를 투여 한 후에 다 분화능이 유지되도록 하였다.

결과

여기에 제시된 절차 ( 그림 1 )를 사용하여, 우리는 mESC pluripotency를 조절하는 것들을 확인하기 위해 228 개의 강력하고 선택적 인 kinase 억제제의 LINCS 라이브러리를 스크리닝한다. 라이브러리는 mESC에서 1 : 100 희석 및 최종 스크리닝 농도에 대해 0.1mM의 농도로 제조된다. 48 시간 후, mESCs를 용해시키고, Nanog 및 Dnmt3b 발현의 정량적 도트 블롯 분석을 위해 추출물을 준비 하였다 ( 도 2 , 상단). 다른 스크리닝 농도의 결과는 간결함을 위해 여기에 표시되지 않습니다. Nanog : 각 키나아제 억제제 및 화합물에 대해 Dnmt3b 비율을 결정하고 2x 차단을 적용했습니다 ( 그림 2 , 하단). 대조군과 비교하여 총 Nanog 및 Dnmt3b 신호는 억제제 등급에 중첩되어 있으며 중요한 MESC 독성을 나타내는 억제제의 트리 이미 징을 허용하기 위해 0.5x 차단을받습니다. 순진균을 안정화시키는 키나제 억제제를 선택하십시오te는 기존의 Nanog / Dnmt3b 면역 블로 팅을 사용하여 검증됩니다 ( 그림 3 ). 이들 억제제의 일차 키나아제 표적은 표 1 에 제시되어있다. 우리는 또한 감작 된 상태를 안정화시키는 억제제를 확인하기위한이 스크린의 적용 가능성을 보여줍니다.

그림 1 : naive primed transition을 조절하는 kinase inhibitor 스크리닝 워크 플로우. mESC를 1 μM의 최종 농도로 228 화합물 키나아제 억제제 라이브러리로 처리 하였다. 용 해물을 준비하고 immuno dot-blot 분석을 위해 nitrocellulose membrane으로 옮겼으며 Nanog와 Dnmt3b 수준이 결정되었다 (그림은 Williams et al . 알을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 그림의 arger 버전.

그림 2 : Naive primed pluripotency 스크린 분석 및 억제제 확인. (Top) 대표적인 Nanog 및 Dnmt3b 면역 도트 블롯 이미지. (아래) 각 키나제 억제제에 대한 Nanog 및 Dnmt3b 값을 DMSO 대조군에 대해 측정하고, Nanog : Dnmt3b 비 및 총 상대 Nanog + Dnmt3b 신호를 측정하고 억제제를 DMSO 대조군과 비교하여 평가 하였다. Nanog : Dnmt3b 비율을 DMSO 컨트롤 위 또는 아래의 2 배 임계 값 이상으로 변경시키는 것으로 밝혀진 억제제는 순진 또는 뇌졸중 만능 분화 촉진제로 확인되었습니다. DMSO 대조군보다 2 배 낮은 역치는 mESC 생존율을 저해하는 선별 억제제로 설정되었다. 추가 검증을 위해 선택된 억제제가 강조 표시됩니다. (그림은 Williams et al., ¹⁴ ).s / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 선택된 히트 화합물의 확인. mESCs는 1 μM AZD4547 (선택적 FGFR 억제제) 또는 그림 2의 화면에서 확인 된 표시된 억제제로 치료했다. Nanog : Dnmt3b 수준은 표준 SDS - PAGE 및 immunoblot 분석에 의해 결정되었습니다. 상대적 Nanog : Dnmt3b 및 Nanog + Dnmt3b의 수치는 아래 표에 나와 있으며, 순진한 다 능성 상태를 안정화시키는 억제제는 녹색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

화합물	1 차 대상		다른 목표
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	렉		Src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR 및 TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2, VEGFR3 &# 160;
AZD-1480	JAK2

도표 1 : 선정 된 명중 화합물 및 그들의 1 차 키니 아제 표적.

토론

여기서 우리는 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는데 키나아제 신호 전달 경로의 역할을 조사하기 위해 널리 접근 가능한 방법을 제시한다. 이것은 ESC 분야의 중요한 질문을 다룹니다. 고 처리량 유전체학 및 전 사체 접근법이 순진 및 초벌칠 다 능성 상태의 주요 전사 조절자를 식별하기 위해 일상적으로 사용 되긴하지만, 다 능성 신호 전달 네트워크를 밝히는 것은 어려운 것으로 입증되었다. 우리는 이제 mESCs에서 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는 키나아제를 확인하기 위해 화학 억제제를 사용하는 유연한 전략을 제공합니다. 이것은 세포 신호 및 ESC 생물학을 연구하는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 간단한 장비, 시약 및 재료에 의존합니다. 이 플랫폼의 성공에 결정적으로 중요한 것은 naive 및 primed pluripotent states 사이의 전이를 정량화하기위한 견고한 분석법 개발입니다. 이 분석법을 확립하기 위해서는 세포 평판에 대한 상당한 반복적 인 변형이 필요했습니다주입 밀도, 억제제 배양 시간 및 면역 블로 팅 조건.

소분자 접근법은 치료 용 ESC 응용에서 합리적인 사용을위한 견인력을 얻고있다 ^{15 , 16} . 소분자 스크리닝의 주요 장점은 효율적인 세포 흡수를 위해 도구 화합물이 설계 및 / 또는 변형된다는 것입니다. 형질 전환 효율은 제한적이지 않으며 렌티 바이러스와 같은 위험한 전달 시스템의 사용은 필요하지 않습니다. 또한, 저해제는 키나제 계열 ( 예 : Fgfr1-4, Jak1-3) 내에서 여러 isoform을 자주 억제하며 RNAi 및 CRISPR / Cas9와 같은 유전 / 게놈 간섭 기술을 방해하는 기능적 중복을 극복합니다. 보다 강력하고 선택적인 툴 화합물이 학술 및 의약품 발견 프로그램에서 모두 이용 가능 해짐에 따라, 잘 이해되지 못하고 잘 이해되지 않은 키나아제가 ESC 연구의 최전선에 밀려날 것입니다. 그러므로 우리는이 높은Roughput Screening 접근법은 핵심 ESC 규제 네트워크에 대한 새로운 연구 방법을 열어 줄 것입니다.

이 기술의 한 가지 사소한 한계는 가장 강력하고 선택적인 소분자 억제제조차도 생체 내 다수의 무관 한 키나아제 에 관여하고 억제한다는 것입니다. 그러나 점점 더 포괄적 인 키나아제 억제제 프로파일 링 데이터를 통해 키나아제 억제제의 기능 표적을 쉽게 확인할 수 있습니다 (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase - 억제제). 마지막으로 원칙적으로 우리 플랫폼은 고품질의 면역 블로 팅 항체를 사용할 수있는 소분자 채취 및 / 또는 세포 분석을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다. 이것은 pluripotency 규제에서 여러 규제 시스템의 연구를 허용하고 다양한 세포 프로세스를 수정 소분자 억제제의 식별을 용이하게합니다. 구체적으로, 우리는 에픽젠 (epigene)Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics)에 의해 개발 된 tic 프로브는 다 능성 전이의 새로운 조절 인자를 밝힐 잠재력을 가지고있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
mESC 미디어
CCE mESC	ATCC ATCC	SCRC-1023
DMEM Media	Gibco	11965092
L-글루타민	Gibco	25030081	최종: 2mM
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	15140122	최종: 50 U/ml
2-메르캅토에탄올	시그마	M6250	최종: 0.1mM
백혈병 억제 인자(GST 융합)	MRC-PPU 시약 및 서비스		최종: 100 ng/mL
백혈병 억제 인자	Thermo		PMC9484 Final: 100 ng/mL
비필수 아미노산	Gibco	11140050	Final: 0.1 mM
피루브산	나트륨 Gibco	11360070	Final: 1 mM
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Final: 5%
Defined Fetal Bovine Serum	Fisher	10703464	최종: 10%
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
TC materials
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드	Thermo	25300054
돼지 껍질의 젤라틴	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo	156545
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Gibco	14190136
V-bottom 96 well plates	Greiner Bio-one	651261
Name	Company	< strong>카탈로그 번호	코멘트
>용해 버퍼
Tris 버퍼	VWR	103157P
염화나트륨	VWR	97061
EDTA	시그마	E4884
1% NP-40	시그마	9016-45-9
나트륨 Deoxycholate	Sigma	D6750-100g
β-glycerophosphate	Sigma	G9422
Sodium Pyrophosphate	Sigma	13472-36-1
Sodium Fluoride		Sigma 450022
Sodium Orthovanadate	Sigma	450243
Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Sigma	CO-RO
strong>Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Chemicals
Tween	Sigma	P1379-1L
분유	Marvel
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
Western Blotting
Protran BA 85 니트로셀룰로오스 0.45 &micor; 남  기공 크기 (20cm x 20cm 시트) (25 장)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
Name	Company	>카탈로그 번호	Comments
Laboratory Equipment
Minifold I 시스템	GE	10447850
ChemiDoc 이미저	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Antibodies
Anti-mouse Nanog	Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW 당나귀 안티 토끼	Licor	926-32213
안티 마우스 HRP	세포 신호 기술	7076S
안티 Klf2	Millipore	09-820
안티 Klf4	R & D 시스템	AF3158
Anti-Oct4	산타 크루즈	sc-5279