아밀로이드 -β 및 타우 신경 병증의 유전자 변형 마우스 모델에서 자발적 교대, 새로운 대상 인식 및 사지 걸림의 평가

요약

여기에는 β- 아밀로이드증 및 타우 병증 유전자 변형 마우스 모델에서인지 및 기능 운동 행동에 대한 생체 내 효능을 나타내는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수있는 단계적 행동 스크리닝 방법이 기재되어있다. 이 방법은 단기 및 작업 메모리 작업에서 활동을 위해 화합물을 스크리닝하기 위해 최적화됩니다.

초록

여기에서는 β- 아밀로이드증 및 타우 병증 유전자 변형 마우스 모델에서인지 및 기능 운동 행동에 생체 내 효능을 나타내는 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수있는 단계별 행동 검사 방법에 대해 설명합니다. 이 패러다임은 Y-maze에서의 자발적 교대, 새로운 물체 인식 및 사지 걸쇠를위한 테스트를 포함합니다. 이 테스트는 1)인지 또는 운동 영역 및 인간 질병 상태와 관련된 상관 신경 회로의 기능을 조사하고, 2) 명확하게 정의 된 엔드 포인트를 가지고 있으며, 3) 쉽게 구현 가능한 품질 관리 검사를 수행하고, 4) 보통 처리량 형식, 5) 조사관의 개입이 거의 필요하지 않습니다. 이 방법은 알츠하이머 병 마우스 모델과 관련된 단기 및 작업 기억 과제 또는 기능성 운동 행동에서 화합물을 스크리닝하려는 조사자를 위해 고안되었습니다. 여기에 설명 된 방법은 eng해마와 다양한 피질 영역을 포함한 다양한 뇌 영역의 나이. 단일 뇌 영역에 의해 중재 된인지 능력을 구체적으로 평가하는인지 검사를 원하는 조사자는이 기술을 사용하여 다른 행동 검사를 보완 할 수 있습니다.

서론

알츠하이머 병 (Alzheimer 's disease, AD)은 전 세계적으로 약 4,400 만 명의 사람들이 쇠약 해지는인지 기능 저하를 초래하는 진행성 신경 퇴행성 질환입니다. 현재이 질병에 대한 새로운 치료 전략의 전임상 발견에 대한 시급한 필요성을 강조하면서 질병을 수정하는 AD 치료법이 없습니다. AD ^{1 , 2} 의 다양한 양상을 되풀이하는 다양한 형질 전환 마우스 모델이 만들어졌으며, 환자 ³ 에서 장애를 일으키는인지 영역의 결손을 포함한다. 이 마우스 모델 은 생체 내에서 효율적인 스크리닝을 용이하게하는 유용한 도구입니다.

잠재적 인 생체 내 효능 에 대한 화합물을 평가할 때 적절한인지 영역 에서 유효성을 스크리닝하는 단계적 접근법이 취해 져야하며 또한 적절한인지 적 영역에서 효력을 발휘하는 특정 종말점에 영향을 미칠 수있는 행동을 모니터링해야합니다.ssess인지. AD의 많은 형질 전환 마우스 모델은 과잉 행동과 특정인지 검사를 방해 할 수있는 행동을 보이며 약물 스크리닝에서의 사용을 금지합니다 ⁴ . 더욱이, 약물 스크리닝 환경에서 실행되는 접근법의 경우, 사용 된 특정 시험은 적어도 적당한 처리량을 유지해야하고, 명확하게 정의 된 종점을 가지고 있어야하며, 조사자가 최소한의 개입을 필요로하는 절차가 있어야합니다. 이러한 기준을 사용하여 화합물 스크리닝에 필요한 재현성, 낮은 내부 및 내부 분석 편차 및 효과 크기를 나타내는 행동 화면을 구현할 수 있습니다. 여기 β- 아밀로이드증 및 타우 병증 유전자 변형 마우스 모델에 존재하는인지 및 운동 표현형을 완화하는데 효과적인 화합물을 스크리닝하기 위해 사용 된 방법이 여기에 상세히 설명되어있다. 설명 된 방법은 l에서보고 된 일반적으로 사용되는 행동 패러다임iterature ⁷ , 특정 최적화 및 품질 관리 검사를 사용하여 AD와 관련된 유전자 변형 마우스 모델에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 데이터 수집 및 분석 시스템과 함께 사용할 수 있으며 조사자는 관련 소프트웨어에 대한 실무 지식이 있다고 가정합니다.

프로토콜

이 간행물에 설명 된 방법은 적용 가능한 연방, 주 및 지방 법률 및 규정에 따라 동물의 적절한 관리, 사용 및 인도적 치료를 보장하기 위해 Hilltop Laboratory Animals의 기관 동물 보호 및 사용위원회 (IACUC)에서 검토되었습니다. 연방 동물 복지 규정 (Asian Animal Welfare Regulations, AWRs) (1985), 실험실 동물의 인간애 보살핌 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 또는 PHS 정책 (PHS 1996).

1. 모든 행동 평가를위한 일반 지침

1. 동물 취급 전에 새 케이지 카드를 사용하여 현존하는 케이지 카드를 커버하십시오.
   참고 : 일상적인 화합물 / 위약 투약 중 생쥐를 다루는 수사관은 행동 평가를 위해 생쥐를 다루는 것이 허용되지 않습니다.
2. 오버 헤드 조명을 어둡게하거나 끄고 조명이나 아레나 또는 미로의 바닥에서의 조명이 30-35 럭스가되도록 조명을 조정하십시오.
3. 에프또는 몇 주간의 연구로 매주 체중을 전반적인 건강 상태의 간접 측정으로 기록합니다.
   참고 :보다 견고한 건강 검사가 필요한 경우 코트 품질, 자세, 보행 및 자발 이동에 대한 추가 케이지 측 검사가 포함될 수 있습니다.

2. 수사관의 취급을 위해 마우스를 숙주로 삼으십시오.

1. 행동 검사 2 일 전에 쥐를 다룰 준비를하십시오. 케이지 랙에서 케이지를 제거하고 평평한 표면에 놓습니다.
2. 케이지에서 뚜껑을 제거합니다. 다가오는 행동 테스트를 수행하는 동안 마우스를 정확히 처리하십시오. 홈 케이지 위에 cupped 손으로 마우스를 놓습니다.
3. 조사자의 손에서 홈 케이지로 돌아가는 대기 시간을 측정합니다. 최대 5 초 동안 마우스를 잡습니다.
   참고 : 대기 시간이 2 초 이상인 마우스는 "익숙하지 않은"것으로 간주됩니다. 첫 번째 실험에서 2 초 미만의 지연 시간을 보이는 마우스는 2 가지 추가 습관그 날 n 회의.
4. 생쥐에게 요법을 2 일 연속으로 실시하도록하십시오. 2 ^일 이 끝날 무렵 익은 상태의 마우스를 기록하십시오.

3. Y-maze ⁸ 에서 자발적 교대 측정을 통한 공간 작업 기억 평가

1. 처음 사용하기 전에, 무 향료 표백 살균 와이프, 70 % EtOH, dH ₂ O ^9로 Y- 미로를 완전히 닦아냅니다. 분명히 미로의 팔을 'A', 'B'& 'C'또는 다른 유사한 고유 식별자로 지정하십시오.
2. 테스트 세션을 시작하기 전에 데이터 수집 시스템 또는 비디오 카메라를 설정하고 미로에서 마우스를 올바르게 추적하도록 설정하십시오. 통치자 또는 알려진 길이의 다른 물체의 캡처 된 비디오 이미지를 사용하여 미로에서 거리를 보정합니다.
   참고 :이 절차의 행동 방식은 다양한 데이터 수집 시스템에서 작동하며 저자는이 절차를 수행하는 것은 선택한 데이터 수집 시스템을 사용하는 데 능숙합니다. 전력 분석에 따르면 그룹당 10-15 마리의 표본 크기가 β≤0.2 일 때 필요합니다.
3. 케이지를 랙에서 꺼내고 Y-maze 가까이에있는 테이블 위에 천천히 올려 놓습니다. 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 조심스럽게 Y- 미로의 한 쪽 팔 중앙에 마주 맞 춥니 다. 수사관에게 마우스가 수사관을 볼 수 없도록 미로에서 충분히 멀리 떨어지게하십시오.
4. 마우스를 미로에 배치 한 직후에 데이터 / 비디오 획득 시스템을 활성화하십시오.
5. 놀을 누르고 10 분 동안 각 마우스의 자발적 행동을 기록하십시오. 세션이 끝나면 마우스를 조심스럽게 홈 케이지에 놓고 새장을 랙으로 되돌립니다.
6. 각 세션 사이에 미백 표백 살균 와이프, 70 % EtOH, dH ₂ O로 완전히 미로를 청소하십시오. 3.4 단계에서 반복하여 모든 마이크를 평가하십시오이자형.
7. 일단 모든 마우스가 Y- 미로의 탐사를 완료하면 획득 시스템에서 데이터를 분석하거나 세션의 비디오를 수동으로 점수를 매 깁니다. 팔 입구는 마우스의 모든 4 개의 발이 중앙 구역의 문지방을 넘어 팔과 동물의 주둥이가 팔의 끝을 향하는 방향으로 향할 때 발생합니다.
   참고 : 분석 할 종점에는 미로로 이동 한 총 거리, 각 팔 (중앙 구역 포함)에서 이동 한 총 거리, 각 구역 (중앙 구역 포함)에서 소비 한 총 시간, 총 팔 입구 수, 각 팔에 입력 된 항목 및 변경된 횟수를 평가하기 위해 입력 된 일련의 팔 목록.
8. 자발적인 교대는 마우스가 3 개의 연속적인 팔 항목 각각에서 미로의 다른 팔에 들어갈 때 발생합니다. 자발적 교대 %는 다음 공식을 사용하여 계산됩니다.
   
   참고 : 예를 들어, 나는팔 입구의 순서는 다음과 같다 : ABCCBABCABC, 조사자는 총 6 개의 자발적 교대로 순서대로 점수를 매겼다 (순서 : ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). 총 11 개의 암 입력으로 자발적 교대 %는 67 %입니다.
9. 다음의 품질 관리 점검을 통해 데이터가 자발적 교체에 대한 편파적 평가를 나타내도록하십시오.
   1. 총 이동 거리와 제작 된 팔 입력 수에 대한 자발적 교대 %의 피어슨 상관 관계를 수행합니다.
      참고 : 매개 변수 중 자발적 교대 %와 유의 한 상관 관계가있는 경우에는 명백한인지 종료점 ¹⁰ 에서의 과도한 동적 이동의 잠재적 영향으로 인해 데이터를 자세히 조사해야합니다.
   2. 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 테스트로 각 팔에 입력 된 항목 수를 분석합니다.
      참고 :이 분석이 중요하다면 이것은 마우스를 특정 레지 (regi)에 끌어 당기는 환경에서 단서의 존재를 나타냅니다미로의.

4. 새로운 물체 인식을 통한 중간 - 용어 인식 메모리의 평가 ^{11 , 12 , 13}

1. 이 테스트의 각 단계마다 초기 사용 전에 무 표백 표백 살균 와이프 (70 % EtOH, dH ₂ O)를 사용하여 공개 필드 경기장을 철저히 청소하십시오.
2. 물체에 노출되기 하루 전, 쥐를 오픈 필드 경기장에 익숙하게하십시오.
   1. 요법 세션을 시작하기 전에 데이터 수집 시스템이나 비디오 카메라를 설치하고 미로에서 마우스를 제대로 추적하는지 확인하십시오. 눈금자 또는 알려진 길이의 다른 물체의 캡처 된 비디오 이미지를 사용하여 경기장에서 거리를 보정하십시오. 위치 적 편향의 채점을 허용하기 위해 소프트웨어에서 경기장의 코너를 표시하십시오.
      참고 :이 절차의 동작 방식은 다양한 데이터 수집 시스템에서 작동합니다줄기와 저자는이 절차를 수행하는 사람이 선택한 데이터 수집 시스템을 사용하는 데 익숙하다고 가정합니다. 전력 분석에 따르면 그룹 당 15-20 마리의 표본 크기가 β≤0.2 일 때 필요합니다.
   2. 케이지를 랙에서 제거하고 경기장과 가까운 곳에 탁자 위에 부드럽게 올려 놓습니다.
   3. 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 마우스를 경기장의 중앙에 살짝 놓습니다. 마우스를 경기장에 둔 직후 추적 소프트웨어 및 / 또는 비디오 녹화 시스템을 켭니다.
   4. 마우스가 자유롭게 30 분 동안 경기장을 탐험 할 수 있습니다.
      참고 :이 기간 동안 수사관은 생쥐를 방해하지 않습니다.
   5. 습관 세션 후 마우스를 집에 다시 넣고 무취 표백 살균 와이프, 70 % EtOH, dH ₂ O로 철저히 청소하십시오.
   6. 모든 쥐가 경기장에 익숙해 질 때까지 4.2.2 단계를 반복하십시오.
   7. 모든 생쥐가 습관을 먹은 후에경기장에서 비디오 분석.
      참고 : 분석 할 끝점에는 경기장에서 이동 한 총 거리와 각 구석 근처에서 보낸 시간이 포함됩니다. 마우스 모델과 관련이 있다면, 고정 관념이있는 행동이 이러한 분석에 포함됩니다 ( 즉 , myoclonic corner jumping, circling 등 ). 경기장의 특정 지역에서 보낸 시간에 편향을 보이는 마우스는 개체 탐색에 영향을 미치기 때문에 추가 실험에서 제외됩니다.
      참고 : 새로운 객체 인식의 첫 번째 단계는 마우스를 객체에 익숙하게하는 것입니다. 여기서, 신규 한 물체 인식 절차의이 부분은 샘플 단계로 언급 될 것이다.
   8. 샘플 페이즈 세션이 시작되기 전에, 대상물을 경기장에 놓고 동물들이 대상을 움직일 수 없도록 장착 퍼티로 바닥에 고정하십시오. 벽과 물체 사이에 충분한 거리를두고 두 개의 동일한 물체를 특정 벽에 정렬하여 마우스가 모든 각도에서 물체를 자유롭게 탐색 할 수 있도록합니다.레.
   9. 데이터 수집 시스템이나 비디오 카메라를 설치하고 미로에서 마우스와 대상의 적절한 추적을 확인하십시오. 눈금자 또는 알려진 길이의 다른 물체의 캡처 된 비디오 이미지를 사용하여 경기장에서 거리를 보정하십시오.
   10. 위치 적 편향의 채점을 허용하기 위해 소프트웨어에서 경기장의 코너를 표시하십시오. 소프트웨어로 객체를 표시하고 각 객체 ( 즉 , "객체 A"및 "객체 B")에 대한 탐색 동작을 개별적으로 추적합니다.
   11. 케이지를 랙에서 제거하고 경기장에 아주 가까운 테이블에 부드럽게 놓습니다.
   12. 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 부드럽게 대상물을 마주보고 경기장의 중심에 놓으십시오.
   13. 마우스가 15 분 동안 자유롭게 대상을 탐색 할 수있게합니다. 이 기간 동안 마우스를 방해하지 마십시오.
   14. 세션이 끝나면 마우스를 부드럽게 홈 케이지에 놓으십시오. 70 % EtOH와 dH ₂ O로 경기장과 물체를 청소하십시오.이 물체를 다시 th전자 분야.
   15. 모든 마우스가 대상에 익숙해 질 때까지 4.2.11 단계를 반복하십시오.
   16. 모든 마우스가 대상에 익숙해지면 비디오를 분석하십시오.
       참고 : 다음 조건을 충족하면 개체 탐색을 계산합니다. 마우스가 개체를 향하고 주둥이가 개체의 2cm 이내에 있고 동물의 몸의 중간 점이 개체에서 2cm 이상 떨어져 있고 이전 기준 적어도 1 초 동안 수행되었습니다. 또한 동물이 탐사 기준을 만족하지만 움직이지 않는 상태를 10 초 이상 나타내면 탐험 시합이 끝난 것으로 간주됩니다.
   17. 다음과 같이 각 마우스에 대한 객체 바이어스 점수를 계산합니다.
       
       참고 : 개체 바이어스 점수가 20 % 미만이거나 80 % 이상인 마우스는 추가 실험에서 제외됩니다.
3. 새로운 대상 인식의 최종 단계는 탐색 행동 평가환경에서 새롭고 익숙한 객체를 지향하며 여기서는 테스트 단계라고합니다. 이 단계는 샘플 단계 완료 후 2-3 시간에 수행됩니다.
   1. 테스트 단계가 시작되기 전에 동물들이 경기장에 물건을 올려 놓고 동물들이 물건을 움직일 수 없도록 바닥에 고정시킵니다.
      1. 대상을 샘플 단계와 관련하여 경기장의 같은 위치에 배치하십시오 ¹³ .
      2. 유전자형과 치료 그룹 전반에서 새롭고 친숙한 개체의 상대적 위치를 조화시킵니다.
      3. 마우스가 모든 각도에서 물체를 자유롭게 탐색 할 수 있도록 벽과 물체 사이에 충분한 거리가 있는지 확인하십시오.
   2. 데이터 수집 시스템 및 / 또는 비디오 카메라를 설정하십시오. 미로에서 마우스와 사물의 적절한 추적을 확인하십시오. 통치자 또는 알려진 길이의 다른 물체의 캡처 된 비디오 이미지를 사용하여 경기장에서 거리를 보정하십시오.
   3. 소프트에서 경기장의 모서리를 표시하십시오.위치 편향의 득점을 허용해야한다. 소프트웨어에서 객체를 표시하고 각 객체에 대한 탐색 동작을 개별적으로 추적합니다 ( 예 : "소설"및 "익숙 함").
   4. 케이지를 랙에서 제거하고 경기장에 아주 가까운 테이블에 부드럽게 놓습니다.
   5. 부드럽게 경기장의 중심에 물건을 마주보고 동물을 배치하십시오. 생쥐를 자유롭게 10 분간 대상물을 탐사합니다.
   6. 테스트 세션이 끝나면 경기장에서 쥐를 떼어 내고 쥐를 다시 우리집에 넣으십시오. 각 세션 후에는 표백제가 포함 된 표백제와 표백제를 70 % EtOH 및 dH ₂ O로 철저히 세척하십시오.
   7. 모든 동물이 평가 될 때까지 4.4.3 단계를 반복합니다.
   8. 개체 탐색이 모든 마우스에 대해 측정되면 비디오가 분석됩니다.
      참고 : 개체 탐색은 다음 조건이 충족되면 계산됩니다. 마우스가 개체쪽으로 향하고 주둥이가 개체에서 2cm 이내,동물의 몸은 대상에서 2cm 이상 떨어져 있고 이전 기준은 적어도 1 초 동안 수행되었습니다. 또한 동물이 탐사 기준을 만족하지만 움직이지 않는 상태를 10 초 이상 나타내면 탐험 시합이 끝난 것으로 간주됩니다.
   9. 소설을 탐구하는 데 소요 된 시간과 익숙한 개체를 비교하여 새로운 개체 인식을 평가합니다. 문헌에 일반적으로 세 가지 방법이보고되어있다.
      1. 반복 측정 테스트를 사용하여 새롭고 친숙한 객체를 탐색하는 데 소요 된 원시 시간을 분석합니다. 이 방법은 유전자형 및 / 또는 치료가 전체 탐사 시간에 영향을 미치지 않을 때 가장 잘 사용됩니다.
      2. 방정식을 사용하여 참신 선호도를 계산합니다.
         
         참고 : 이것은 객체를 탐색하는 총 시간을 기준으로 참신한 객체를 탐색하는 데 소비 된 시간의 백분율을 제공합니다. 값의 범위는 0 % (새로운 대상의 탐사 없음)에서 100 % (소설의 탐사에만 해당됩니다.ject), 50 %의 값은 새롭고 친숙한 객체를 탐색하는 데 소요 된 동등한 시간을 나타냅니다.
      3. 방정식 ¹¹ 을 사용하여 차별 지수 ¹¹ 을 계산하십시오.
         
         참고 : 이는 소설과 친숙한 객체를 탐색하는 데 소요 된 시간의 차이를 객체 탐색에 소요 된 총 시간과 비교하여 산출합니다. 값의 범위는 -1 (익숙한 객체 만 탐사)에서 +1 (소설 객체 만 탐험, 0은 동등한 시간을 나타내며 새롭고 친숙한 객체를 탐색하는 데 사용됩니다.
   10. 테스트 과정에 참여하지 않은 동물은 고 동적 운동이나 다른 고정 관념 때문에 배려 ¹¹ 에서 제거하십시오.
       참고 : 제거에 사용 된 기준은 객관적이어야하며 마우스 모델에 대해 선험적 으로 결정되어야합니다 ( 예 : 총 탐사 시간 동안 <5 백분위 수, 평균> 100테스트 세션 중 회전 각도 또는 myoclonic corner jumping을 나타내는> 50 백분위 수 시간).

사지를 쥐고있는 쥐의 대뇌 피질 척수 기능 평가 ¹⁴

1. 비디오 전체 세션을 문서화하십시오. 휴대용 휴대용 장치 ( 즉 , 스마트 폰 또는 동급 제품)를 사용하여 비디오를 녹화하십시오.
   참고 : 힘 분석에 따르면 그룹당 10-15 마리의 표본 크기가 β≤0.2에 필요합니다.
2. 랙에서 홈 케이지를 꺼내 테이블 위에 놓습니다. 다음 단계 전에 동물 ID를 비디오에 기록하십시오.
3. 부드럽게 케이지에서 마우스를 제거하고 5-10 초 동안 꼬리에 의해 중단. 비디오는 정지 된 상태에서 동물의 뒷다리와 앞발을 기록해야합니다.
4. 최소 5 초의 비디오를 캡쳐 한 후 마우스를 홈 케이지에 다시 넣고 새장을 랙으로 되돌립니다.
5. 테이블을 청소하십시오. 모든 쥐가 recorde 때까지 단계 5.2에서 반복하십시오 디.
6. 0-4의 척도로 꼬리에 매달린 마우스 비디오에서 점수 사지를 집어 넣습니다 (점수에 대한 설명은 표 1 참조). 일시 중지 된 마우스의 비디오를 검사 한 후 다음 기준에 따라 점수를 지정하십시오.
   1. 팔다리가 걸리지 않았어. 정상 탈출 연장. 한 사지는 불완전한 분출과 이동성의 상실을 나타낸다. 발가락은 정상적인 분출을 보입니다.
   2. 뒷다리는 모두 불완전한 분출과 이동성의 상실을 나타낸다. 발가락은 정상적인 분출을 보입니다.
   3. 두 뒷다리는 말려 진 발가락과 움직이지 않음으로 걸쇠를 잡습니다.
   4. 앞다리와 뒷다리는 걸쇠를 걸고 넘어지며 발가락이 구부러지고 움직이지 않습니다.
7. 모든 마우스는 2 명의 독립적 인 조사자에 의해 채점됩니다. 2 개의 점수가 1 점 이상 차이가 나는 마우스는 다시 한번 다시 판정됩니다.
   1. 다른 점수는 평균입니다.

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표 1 : 사지 클러킹 점수에 대한 설명.

결과

노화 된 Tg2576 마우스는 Y- 미로 ^{15 , 16} , 여기서 묘사 된 방법 ( 그림 1A )을 사용하여 복제 할 수있는 표현형 내에서 만들어진 자발적인 교대에서 튼튼한 적자를 나타냅니다. 팔 증가에 대한 추세가 이러한 생쥐에서 관찰되었지만 ( 그림 1B ),이 생쥐에서 관찰 된 과다 활성은 자발적 교대 비율에 영향을 미치지 않았습니다 ( 그림 1C ). 대조적으로, 노화 된 rTg4510 마우스는 Y- 미로 ( 그림 1D )에 놓았을 때 자발적으로 증가하는 것으로 나타납니다. 이것은 극단적 인 과잉 행동 ( 그림 1E )과 고정 관념 ⁽ stereotypy) ¹⁰ 에 기인합니다. 이는 자발적 교대 측정을 상당히 방해합니다 ( 그림 1F ). 이 작업에서 처음 쥐를 평가할 때 팔 입력 및 / 또는 이동 거리가자발적 교대 비율과 유의 한 상관 관계가 있었다.

새로운 물체 인식을 평가하기 전에 마우스가 테스트가 수행 될 경기장에 익숙해 져 있습니다. 요법 동안, 과잉 행동 ( 그림 2A ) 및 마우스 모델과 관련된 기타 고정 관념의 행동을 평가할 수 있습니다. 표본 단계에서 각 개체의 탐색을 개별적으로 측정하여 탐색 행동에서 중요한 편향을 나타내는 마우스를 추가 평가에서 제외 할 수 있도록하는 것이 중요합니다 ( 그림 2B , 열린 원). 소설의 물체 인식은 친숙하고 새로운 물체의 탐색을 비교하여 평가되며 일반적으로 세 가지 방식으로 분석됩니다. 총 탐구 시간이 유전자형 및 / 또는 치료 그룹에서 비교 가능한 경우, 각 대상을 탐구하는 원시 시간과 적절한 반복 측정 테스트를 사용하여 새로운 대상 r인식 ( 그림 2C ). 특정 마우스의 변형이 전체 탐색 시간에 차이를 보이는 경우, 신규 한 대상 인식은 참신 선호 ( 그림 2D ) 또는 차별 지수 ( 그림 2E )를 사용하여 평가할 수 있습니다.

사지 걸쇠는 대뇌 피질 기능의 결손을 정량화하는 기능적 운동 검사입니다. 인식 척도가 아닌 사지 걸쇠는 몇 가지 형질 전환 타우 마우스 모델 ^{6 , 17 , 18 , 19} 에서 관찰되며 후기 AD 환자에서 관찰 된 일부 기능성 운동 결핍을 반복한다. 꼬리에 의한 생쥐의 정지는 탈출 응답을 유발한다 ( 그림 3A , "0"). 뒷다리를 풀고 발가락을 확장하는 능력의 결점은 0-4의 척도에 따라 심각도에 따라 점수가 매겨집니다 ( 그림 3A). 여기에 설명 된 절차를 사용하면 rTg4510 마우스 ( 그림 3B )에서 중요한 사지 clasping 관찰 할 수 있습니다.

그림 1 : Y- 미로에서 자발적 교대. ( A ) Y-maze에 배치되면 마우스는 잃어버린 시프트 검색 전략을 채택하여 각 암을 3 개의 팔 항목마다 한번씩 조사하는 탐사 패턴을 만듭니다. 나이가 많은 Tg2576 마우스는 자발적 교대로 상당한 결손을 보입니다. 이 방법에서 약술 된 절차를 사용하여 독점 화합물로 치료 한 후 자발적 교호 작용이 크게 회복되었습니다. 1-way ANOVA를 사용하여 데이터를 분석하고 Dunnett 's test를 사용하여 Tg-PBS에 대한 post-hoc 비교를 수행 하였다. ** p <0.01. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. ( B ) 팔 발목의 수는 어느 부위에서나 크게 다르지 않았다.이 실험에서 모니터링 된 그룹 중 데이터는 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 테스트를 사용하여 분석되었다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. ( C ) 자발 교대와 팔 입국 수 사이에 상관 관계가 없어 자발적인 운동 활동의 차이가 자발적인 교대의 정량화에 영향을 미치지 않았다는 것을 가리킨다. 상관 관계 분석은 피어슨 상관 관계 분석을 사용하여 수행되었습니다. ( D ) Y- 미로에 놓았을 때, rTg4510 마우스 (6 개월)는 littermate WT 마우스에 비해 현저한 자발적 변화를 보였다. 데이터는 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)에 의해 분석되었고, Tg-PBS에 대한 사후 비교는 Dunnett 's test를 사용하여 수행되었다. ** p <0.01. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. ( E ) rTg4510 마우스는 극심한 과다한 운동 능력으로 인해 훨씬 ​​더 많은 팔을 만들었다. 데이터는 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)에 의해 분석되었고, Tg-PBS에 대한 사후 비교는 Dunnett 's test를 사용하여 수행되었다. *** p <0.001. 오류 막대는 SE자발적 교대 행동은 팔 운동과 유의 한 상관 관계가 있었고, 이는 극한 운동 능력의 표현형이 진정한 자발적 교대를 불분명 함을 의미한다. 상관 관계 분석은 피어슨 상관 분석 (r = 0.7, p <0.0001)을 사용하여 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 새로운 객체 인식. ( A ) 투기 습관은 특정 마우스 모델과 관련된 자발적인 운동 및 기타 고정 관념의 행동 측정을 허용한다. 여기, 노인 Tg2576 생쥐 (22 개월)는 littermate WT 생쥐에 비해 훨씬 더 자발적인 운동을 나타냅니다. 데이터를 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)에 의해 분석하고, Tg-Veh에 대한 사후 비교는 Dunnett '시험. ** p <0.01. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. ( B ) 샘플 단계 동안, 두 개의 동일한 대상에 대한 탐사가 별도로 추적되었다. 두 대상 중 하나의 탐험에 큰 편향을 보이는 마우스 (열린 원)는 테스트 단계에서 제외되었습니다. ( C - E ) 소설과 익숙한 물건의 탐사를 측정하여 소설의 물체 인식을 평가했습니다. 새로운 개체 인식은 ( C ) 원시 탐사 시간, ( D ) 참신 선호 또는 ( E ) 차별 색인을 사용하여 평가되었습니다. 패널 C의 데이터는 반복 측정으로 2-way ANOVA를 사용하여 분석하였고 Sidak 's test를 사용하여 쌍으로 비교 하였다. 패널 DE의 데이터를 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)으로 분석하고, Tg-Veh와의 후 - 비교 (post-hoc comparison)를 Dunnett 's test를 사용하여 수행 하였다. * p <0.05, ** p <0.01. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 클릭하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 다리 걸쇠. ( A ) rTg4510 마우스 (6 개월)는 이러한 방법을 사용하여 점수를 매겨서 littermate WT 마우스에 비해 유의하게 팔다리를 쥐고 있음을 보여줍니다. 1-way ANOVA를 사용하여 데이터를 분석하고 Dunnett 's test를 사용하여 Tg-PBS에 대한 post-hoc 비교를 수행 하였다. *** p <0.001, **** p <0.0001. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

기존 방법에 대한 기술의 중요성
이 절차는 β- 아밀로이드증 및 타우 병증의 형질 전환 마우스 모델에서 화합물의 생체 내 활성을 스크리닝하도록 설계되었다. 여기에 사용 된 단계적 접근법은 AD ^3과 관련된인지 영역에서 효과적인 화합물의 검출을 보장합니다. 또한 여기에 설명 된 접근법은 명확하게 정의 된 끝점, 쉽게 구현 가능한 품질 제어 검사, 중간 처리량 형식으로 실행될 수있는 행동 테스트 및 조사자의 개입이 거의 필요하지 않습니다. 이러한 특성은 동물 내 및 코호트에서 우수한 재현성을 나타내는 분석 결과를 가져 오며 약물 내 환경에서의 행동 프로파일 링을 지원하기에 충분할 정도로 견고한 내부 및 내부 분석 편차와 효과 크기 (2 ≤ f ≤6)를 가져옵니다.

Pr 내의 중요한 단계안경
AD 약물 발견에 사용되는 많은 마우스 모델은 불안과 공격성이 높아진 행동과 일치합니다. 이것은 여기에 설명 된 행동 테스트를 수행하기 위해 습관 조절을 필수적으로 수행합니다. 이 검사는 운동을하지 않는 행동에 의존하기 때문에 지나치게 활동적이고 불안하거나 공격적인 마우스로 인해 조사자가 거친 취급을하면 성능에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 불안감이 높아지면 테스트를 수행하지 않아 테스트의 전반적인 성능이 저하 될 수 있습니다. 또한, 경기장의 가벼운 수준은 각 테스트에 필요한 자발적인 운동을 촉진하는 데 필수적입니다. 밝은 빛은 불안감을 증가시키고 설치류의 이동을 억제하는 경향이 있으므로 경기장에서 주변 광 레벨을 30-35lux로 조정해야합니다.

절차의 또 다른 중요한 측면은 작업을 수행하는 동물의 능력을 방해하는 강력한 환경 단서를 최소화하는 것입니다. 청소마우스가 환경의 새로운 향기에 매료 될 때 실행 사이의 경기장 및 사물이 필수적입니다. 경기장 및 사물을 철저히 청소하지 않으면 마우스의 자발적 활동을 왜곡하고 진정한인지 능력을 숨길 수 있습니다. 수사관은 또한 이러한 절차를 수행 할 때 개인 위생 제품 및 코 인식 / 향수의 사용을 최소화해야합니다. 마지막으로, 설치류는 학습과 기억을 포함한 많은 명백한 행동 ²⁰ 에서 튼튼한 주간 및 일주 변화를 나타낸다. 그러므로 기초 행동과인지 능력의 주간 리듬으로 인한 편차를 최소화하기 위해 모든 검사는 코호트와 연구를 통해 같은 시간대에 이루어져야합니다.

또한, 새로운 물체 인식과 관련하여, 샘플과 테스트 단계 사이의 지연 간격, 그리고 환경에서의 물체의 선택 및 배치가 중요한 파라미터이다. 기억은 3 가지 형태로 존재합니다 : 단기 기억(STM), 중기 메모리 (ITM) 및 장기 메모리 (LTM) ^{(22 , 23)를 포함} 한다. 샘플 및 테스트 단계 간 간격을 분 (STM)에서시 (ITM) 또는 일 (LTM)로 변경하면 절차에 따라 테스트 된 메모리 유형이 변경됩니다 ¹² . 또한 새로운 물체 인식 테스트를 실행하기 전에 탐사시 잠재적 인 편향을 유발할 수있는 많은 개체를 마우스 테스트 집단에서 선별해야합니다. 테스트 코호트에 과도하게 매력적이거나 불쾌한 대상은 새로운 대상 인식을 평가할 때 사용할 수 없습니다. 이상적으로 시험장에 배치 될 때 시험에 사용되는 모든 물체는 순수한 생쥐 집단과 동일한 탐사 시간을 이끌어 낼 것입니다. 객체의 테스트 및 최적화가 부적절하면 새로운 객체 인식의 힘을 크게 줄일 수 있습니다.

수정 및 문제 해결
다음과 같은 몇 가지 요소가 있습니다.여기에 설명 된인지 시험의 명백한 변동성. AD의 많은 마우스 모델은인지 기능 종점으로 측정 된 행동을 가려 주거나 변경할 수있는 과격 운동 (hyperdynamic locomotion) ³ 을 나타낸다. 더욱이 성 (sex ^{) 24 , 25 , 26} , 심지어 모계 유전자형 ²⁷ 조차도 AD 마우스 모델에서 신경 병리학 및인지 적 표현형의 발달 및 진행에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 늘어나고있다. 예기치 않은 변동성이나 행동 과제 구현 실패는 이러한 요인들로 인한 것일 수 있습니다. 특정 행동 테스트를 처음 실시 할 때, 결과는 항상 성별, 나이 및 적용 가능한 경우 모체 유전형에 따라 계층화되어야합니다. 또한,이 절차에서 설명 된 품질 검사는 과다 활동이나 다른 고정 관념의 행동이인지 종말점의 정량화를 방해하지 않도록 항상 수행되어야합니다.

환경다림질은 또한 설치류의 자발적인 탐색 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 연구자가 감지 할 수없는 냄새 나 소리는 자발적인 행동에 의존하는인지 테스트 결과를 왜곡하고 쥐를 유인 할 수 있습니다. 초기에 Y- 미로 또는 새로운 물체 인식을 확립 할 때, 물체 및 / 또는 환경의 탐사에 위치 편향이 없음을 보장하는 제어 수단의 수행이 필수적이다. 위치의 편차가 관찰되면 조사자는 환경을 면밀히 조사하고 조명, 경기장 배치, 시설 내의 다른 방 ( 즉 , 높은 인신 매매 지역 또는 중장비 근처가 아님) 및 경기장 청소 절차와 관련하여 시험실의 위치를 ​​잠재적으로 조정해야합니다.

테스트 환경에 익숙해지는 것은 새로운 객체 인식 테스트에서 최적의 성능을 달성하는 데 중요합니다. 예를 들어 총 탐사 시간이 짧으면 습관이 부적절하기 때문일 수 있습니다. proc의 대안으로(2 절) 및 경기장 (4.2 절) 습관 조절, 다루기 습관 및 시험 환경은 2 일 연속 3 일 5 분 세션으로 수행 할 수 있습니다.

기술의 한계
다른 절차와 마찬가지로 이러한 행동 테스트에는 한계가 있습니다. 이 절차는 다양한 피질 영역과 해마의 기능을 시험하기 때문에 사용되었습니다. 마우스 모델이 이러한 검사에서 뇌 영역의 기능적 결함을 나타내지 않는다면 이러한 기술은 유용하지 않습니다. 또한 우리는 단기 기억을 탐색하는인지 검사를 선택했습니다. 전임상 평가에서 화합물의 작용 기전이 단기 기억에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다면 ( 즉 , 장기 기억을 시험하기 위해 표본 검사 상 간격을 늘리는) 이러한 과정을 적절히 수정해야한다. 마지막으로, 이러한 테스트는 움직이지 않는 행동을 사용합니다. 따라서 마우스 모델이 exces 인 경우적극적으로 지나치게 활동적이거나 환경 탐사를 방해하는 다른 고정 관념이있는 행동을 나타내면 이러한 절차가 최적이 아닐 수도 있습니다. 대안으로, Tg2576 또는 다른 β- 아밀로이드증 마우스 모델 또는 rTg4510의 공간 물 미로 또는 타우 병증의 다른 마우스 모델에 대한 공포 컨디셔닝을 사용할 수 있습니다 ³ .

미래의 응용
일단이 절차가 실험실에서 성공적으로 채택되면 추가의인지 기능적 운동 측정을 평가하기 위해 몇 가지 수정 또는 확장을 할 수 있습니다. 예를 들어, 새로운 물체 인식 작업을 변경하여 마우스가 물체의 위치 변화를 인식 할 수 있는지 판단 ¹³ . 또는 객체를 사용하는 대신 다른 마우스를 사용하여 사회적 인식 테스트를 구현할 수 있습니다. 팔다리 걸쇠 및 모터 기능과 관련하여, 와이어 걸림 및 / 또는 그립 강도 테스트로이 테스트를 보완 할 수 있습니다. 테스트이 방법은 AD의 번역 마우스 모델 에서 생체 내 효능을 갖는 화합물을 선별하기위한 견고한 기반을 형성하며, 특정 마우스 모델을 가장 잘 조사하거나 독창적 인 약물 발견 프로그램의 요구를 충족시키기 위해 다양한 방법으로 변형 또는 변형 될 수 있습니다 .

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Topscan Lite-High Throughput	Cleversys		자동화된 행동 분석. 카메라 및 비디오 수집 시스템, 노트북을 포함합니다.
정확한 물체 탐사 정량화를 위한	ObjectScan	Cleversys
마우스를 위한 오픈 필드	Cleversys	CSI-OF-M	아레나 새로운 물체 인식을 위한
Y-미로 마우스를 위한 Y-미로	맞춤형		암: 길이 30cm, 너비 10cm, 높이 20cm, 120도 간격으로 배치.
오픈 필드용 카메라 마운트	커스텀		76cm 높이, 115cm 너비, 카메라 장착 @ 양쪽에서 30cm.  두 개의 마운트, 각각 두 개의 상자를 덮습니다.
Y-maze Custom Custom 용 카메라 마운트			높이 76cm, 너비 115cm, 카메라 장착 @ 양쪽에서 30cm. 하나의 마운트는 두 개의 미로를 덮습니다.
구슬	제국 장난감	8565	표준(직경 15.5mm) 유리 구슬.
주사위	Cardinal Industries	770	표준 (0.650 인치) 흰색 주사위와 검은 점 주사위.
LOCTITE, Fun-Tak	Henkel	B018A3AG0W	Standard, blue, sticky tak
, EtOH	Nexeo Solutions	82452	100% 에탄올, 증류수를 사용하여 70%로 희석,
dH2O	Tulpenhocken Spring Water Co.	-	PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD 인증서. #320
종이 타월	Procter & Gamble	B019DM86LA	Bounty, 흰색
휴대용 비디오 카메라	Apple, Inc.	MKV92LL/A	Limb clasping 비디오, Iphone 6S Plus(또는 이에 상응하는 기능) 인수.
장갑	SafePOINT, L.L.C.	GL640-2	표준, 파우더 프리 라텍스 장갑, 미디엄
라이트 미터	Dr. 미터	LX1330B	조명 @ 오픈 필드 바닥 = 35 LUX, 조명 @ Y-Maze 바닥 = 32 LUX
표백제 살균 물티슈	Clorox		장비 살균 중 및 사용 후